CC BY
11© Коллектив авторов, 2014 УДК 615.277.3:547.96].076.9
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ХИМЕРНОГО ПЕПТИДА P16_ANTP IN VIVO
Т.М. Кулинич, кандидат медицинских наук, А.Н. Болдырев, В.К. Боженко, доктор медицинских наук, профессор
Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России, Российская Федерация, 117997, Москва, ул. Профсоюзная, д. 86 E-mail: [email protected]
Введение. Белок P16INK4a играет одну из ключевых ролей в процессах контроля пролиферации клетки, его инактивация — одно из наиболее частых событий при новообразованиях различной локализации. Восстановление функции P16INK4a в неопластических клетках может способствовать торможению их деления и элиминации. Поиск искусственно синтезированных, функционально активных, коротких фрагментов белка р16 и методов их внутриклеточной доставки — актуальная задача современной таргетной терапии злокачественных новообразований.
Цель исследования. Изучение в экспериментах in vivo противоопухолевой активности последовательности 82—102 из белка P16INK4a в составе химерного пептида, в котором в качестве вектора для внутриклеточной доставки используется последовательность ANTP.
Методы. Исследование противоопухолевой активности последовательности p16_ANTP проведено на 40 мышах-самках Balb/c nude 8 нед массой тела 20—22 г, которым были перевиты штаммы опухолевых линий человека НСТ-116 и А549. Мышам контрольных групп вводили физиологический раствор; животным опытных групп вводили пептид р16_ШТР в дозе 5мг/кг в область опухолевого узла. Объем опухолевых узлов вычисляли по произведению величин 3 взаимно перпендикулярных диаметров.
Результаты. Местное введение химерного пептида р16_ШТР вызывает достоверное торможение роста экспериментальных моделей колоректального рака (НСТ-116) и карциномы легкого человека (А549) соответственно на 66,8 и 58,7%.
Заключение. Химерный пептид p16_ANTP, включающий функциональную часть — фрагмент p16INK4A и интернализуемый вектор Antennapedia, обладает выраженной противоопухолевой активностью.
Ключевые слова: р16INK4a, ингибиторы циклиновых киназ, интернализуемые пептиды (CPP), противоопухолевая таргет-ная терапия
RESEARCH OF ANTINEOPLASTIC ACTIVITY OF CHIMERIC PEPTIDE P16_ANTP IN VIVO T.M. Kulinich, A.N. Boldyrev, V.K. Bozhenko
Russian Scientific Center of Reontgen Radiology, Profsoyuznaya Str., 86, Moscow, Russian Federation, 117997
Introduction. P16INK4a protein plays one of the key role in processes of cell proliferation, its inactivation is noted in a number of tumors of various localization. Restoration of the p16INK4a function in neoplastic cells may promote braking of division of tumor cells and their elimination. The search of artificially synthesized, functionally active, short fragments of protein р16 and methods fot their intracellular delivery is an actual problem of modern tumor target therapy.
The aim of the study. In vivo research of antineoplastic activity of the sequence 82-102from P16INK4a protein as a part of the chimeric peptide, which includes the sequence of ANTP as a vector for intracellular delivery.
Methods. Antitumor effect in vivo was investigated on xenograft models of HCT116, A-549 (concentration p16_ANTP — 5 mg/kg, using a thrice weekly dosing schedule). 40 mice females of Balb/c nude, at the age of 8 weeks, with a body weight of20-22g were used. The volume of tumors was calculated according to the product of values of 3 mutually perpendicular diameters of nodes.
Results. Intratumoral introduction of chimeric p16_ANTPpeptide leads to the reliable growth inhibition on experimental human tumor models — colorectal cancer (HCT-116) and lung carcinoma (A549) by 66,8% and 58,7% accordingly.
Conclusion. The chimeric p16_ANTP peptide which includes functional part — 82-102fragment of p16INK4A and an internalizing vector of Antennapedia, possesses the expressed antineoplastic activity.
Key words: p16INK4a, inhibitors cyclin of kinases, cell penetrating peptides (CPP), antitumor target therapy
ВВЕДЕНИЕ
Одной из основных биологических функций гена р16ШК4А и его продукта — белка Р16 является регулирование клеточного цикла, он блокирует переход из G1- в S-фазу по pRb-зависимому механизму, ингибируя активность циклинзависимых киназ D-типа (cdk-4 и cdk-6) [1]. Показано, что в
злокачественных новообразованиях различных локализаций (злокачественные лимфомы, рак поджелудочной железы, глиомы, меланомы и др.) ген р16 инактивирован [2]. Его инактивация может осуществляться различными путями, описаны как мутации, приводящие к нарушению функционирования белка, так и эпигенетические механизмы —
гиперметилирование промоторов и др. [2, 3]. Выключение гена р16 из процессов контроля клеточной пролиферации является одним из ключевых механизмов запуска канцерогенеза для клеток таких тканей, как эпителий поджелудочной железы, легких, эпидермис и др. [1, 3]. Показано, что восстановление активности гена р16 в опухолевых клетках приводит к остановке клеточного деления и их элиминации [4, 5]. Имеются также данные об участии р16 в процессах ангиогенеза во время роста опухоли. Показано [6], что внесение в клетки линий глиом последовательности р16 вызывает угнетение экспрессии васкулярного эндотелиального фактора, который является одним из важнейших медиаторов опухолевого ангиогенеза [6]. Ch.-T. Lee и соавт. [7] приводят данные о наличии противоопухолевого эффекта у конструкции р16 — аденовирус относительно линий рака мочевого пузыря человека, перевитой крысам [7].
В ряде работ показано, что связывать и инги-бировать циклиновые киназы способны не только полноразмерные белки, но и фрагменты белка р16. Так, R. Fahraeus и соавт. [8] проанализировали циклинингибирующие свойства 20-аминокис-лотных последовательностей из белка р16 и показали, что фрагмент 82—102 обладает такими же киназ-ингибирующими свойствами, что и полноразмерный белок [4, 8]. Использование коротких функциональных фрагментов белков может иметь ряд преимуществ по сравнению с полноразмерным белком. Можно предположить, что короткая функциональная аминокислотная последовательность не будет содержать участков полноразмерного белка, ответственных за взаимодействие с другими белками-участниками функциональной цепи, а значит, не будет подвержена возможным нежелательным регуляторным воздействиям [8].
Ранее мы показали, что химерная последовательность р16INK4a_Antennapedia (P16_ANTP), включающая фрагмент р16 (82—102) и интернали-зуемый пептид Antennapedia, обладает выраженными цитостатическими и цитотоксическими свойствами относительно различных перевиваемых опухолевых линий и первичных культур опухолей человека, полученых из операционного материала. Было показано, что данный пептид in vitro вызывает остановку клеточного деления и индуцирует апоптоз [9, 10]. Отметим, что, несмотря на большой срок, прошедший после открытия эффективности ингибирования циклиновых киназ фрагментом белка р16 (82—102), публикаций по исследованию его противоопухолевой активности как in vitro, так и in vivo практически нет. Можно привести лишь единичные исследования. Так, R. Hosotani и соавт. [11] на моделях рака поджелудочный железы линий AsPC-1 и BxPC-3, перевитых интраперитонеаль-но мышам, исследовали терапевтический эффект фрагмента р16, включающего фрагмент 82—102 и вектор Antennapedia. Было показано, что интра-
перитонеальное введение синтетического пептида вызывает резкое торможение роста опухоли, гибель опухолевых клеток по пути апоптоза, более длительное выживание опытных мышей [11]. Следует также отметить большое число публикаций по изучению противоопухолевого эффекта полноразмерного белка р16, в которых используется технология генной терапии [12].
Цель настоящей работы — исследование противоопухолевой активности последовательности 82—102 из белка р16ШК4а в составе химерного пептида, в котором в качестве вектора используется последовательность ANTP, в экспериментах in vivo.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование противоопухолевой активности химерного пептида P16 ANTP проведено на модели ко-лоректального рака HCT116. Последовательность P16_ANTP была получена методом твердофазного синтеза, как описано ранее [1].
В исследовании использовали 20 мышей-самок Balb/c nude в возрасте 8 нед, массой тела 20—22 г, разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Мыши были разделены на равные группы. Все исследования in vivo выполняли в соответствии с действующими в РФ методическими указаниями [13].
Штамм НСТ-116 получен из Коллекции опухолевых штаммов человека РОНЦ. Опухолевый штамм был привит мышам обеих групп в количестве около 1 млн клеток на 1 мышь, подкожно на наружную поверхность заднего правого бедра. Животным опытной группы вводили пептид P16_ANTP в дозе 5 мг/кг в область опухолевого узла. Всего было сделано 11 инъекций пептида. 1-я инъекция осуществлена на 6-й день после перевивки опухолевых клеток, далее препарат вводили через сутки. Исследуемый препарат: пептид P16_ANTP для введения мышам ex tempos разводили в физиологическом растворе. Мыши контрольной группы получали физиологический раствор в эквивалентных объемах.
Оценка противоопухолевого эффекта. Объем опухолевых узлов вычисляли по произведению величин 3 взаимно перпендикулярных диаметров. О переносимости воздействия инъекций судили по состоянию и поведению мышей с опухолью.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В контрольной группе на 28-й день эксперимента средний объем опухолей составил 679 мм3, за время эксперимента погибли 3 мыши. В опытной группе опухолевые узлы росли медленнее, чем в контроле (рис. 1). На 28-й день эксперимента средний объем опухолей составил 225,4 мм3, что соответствует 33,2% от такового в контрольной группе. В опытной группе погибли 2 мыши. Достоверных различий в выживаемости за время наблюдения не выявлено. Признаков токсического воздействия исследуемого препарата P16_ANTP в опытной группе мышей не отмечалось.
На рис. 2 показан сравнительный вид опухоли в контрольной и экспериментальной группах после 7 инъекций исследуемого пептида. Отмечается заметное уменьшение опухолевого узла в опытной группе.
Таким образом, показано, что местное введение химерного пептида P16_ANTP обусловливает достоверное (66,8%) торможение роста экспериментальной модели колоректального рака человека.
Исследование противоопухолевой активности химерного пептида Р16ЛИТР на модели карциномы
легкого А549. Использовали 20 мышей-самок Balb/c nude 8 нед, массой тела 20—22 г, разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Для постановки эксперимента животные были разделены на 2 группы по 10 мышей.
Штамм карциномы легкого А549 получен из Коллекции опухолевых штаммов человека РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Животным опытной и контрольной групп были перевиты опухолевые клетки линии А549 в количестве 1 млн клеток на 1 мышь,
Дни после перевивки nr. Контроль р16
120
100
80
в
ч
о £
к
о §
о &
ю О
60
40
20
-20
i
f 1 í
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Дни после перевивки Контроль р16
0
Рис. 1. Динамика изменения объема опухоли — колорек-тального рака человека НСТ116у мышей Balb/C nude при подкожной перевивке в область правого заднего бедра (представлены значения средних и стандартной ошибки). Красная линия — контроль; зеленая — опытная группа, получавшая пептид р16_ЛЫТР. Доза — 5мг/кг, через день, начиная с 6-го дня после перевивки. Введение местное — в ложе опухоли
Рис. 3. Динамика изменения объема опухоли — рак легкого человека А549у мышей Balb/C nude при подкожной перевивке в область правого заднего бедра (показаны значения средних и стандартной ошибки). Красная линия — контроль; зеленая — опытная группа, получавшая пептид р16_ЛЫТР. Доза — 5мг/кг, через день, начиная с 6-го дня после перевивки. Введение местное — в ложе опухоли
Рис. 2. Типичная картина роста опухоли HCT116 у мышей Balb/C nude на 18-й день после перевивки: а — мышь №7из контрольной группы (опухоль 11,5х 13,5мм); б — мышь №12 из опытной группы (опухоль 4,5x4,5мм), с введением пептидар16_ЛЫТР в ложе опухоли (проведено 7 инъекций)
Рис. 4. Типичная картина роста опухоли А549 у мышей Balb/C nude на 16-й день после перевивки: а — мышь №5 из контрольной группы (опухоль 6,0х 7,0мм); б — мышь №16 из экспериментальной группы (опухоль 3,0x3,0мм) с введением пептида р16_ЛЫТР в ложе опухоли (проведено 7 инъекций)
38 №4, 2014 Молекулярная медицина
подкожно, на внешнюю поверхность правого заднего бедра мыши. Инъекции препарата начинали в зоны опухолевых узлов на 4-е сутки после трансплантации и образования пальпируемой опухоли. Мыши контрольной группы получали физиологический раствор в объемах, эквивалентных объемам вводимого в опытной группе исследуемого пептида. Доза пептида P16_ANTP в опытной группе составляла 5 мг/кг. Было сделано 11 инъекций пептида. Исследуемый пептид P16_ANTP для введения мышам ex tempore разводили в физиологическом растворе. Инъекции проводили 1 раз в 2 дня.
Сравнительный анализ динамики роста опухоли показал, что в опытной группе на 6-й день после начала введения пептида наблюдали заметное снижение объема опухолей по сравнению с контролем (рис. 3). Средний объем опухолей у мышей контрольной группы на 24-й день эксперимента составил 95,24 мм3. В опытной группе средний объем опухолей составил 39,29 мм3, что соответствует 41,2% объема опухолей в контрольной группе. В обеих
группах за время проведения эксперимента погибло по 1 животному.
Таким образом, показано (рис. 4), что местное введение химерного пептида P16_ANTP обусловливает достоверное (58,7%) торможение роста экспериментальной модели карциномы легкого А549.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования показывают, что пептид P16_ANTP при местном введении проявляет выраженную противоопухолевую активность in vivo. Показано достоверно значимое уменьшение размеров опухолевых узлов как для НСТ116, так и для А549 в среднем соответственно на 66,8 и 58,7%. Использование пептида P16_ANTP в качестве противоопухолевого препарата в разовой дозе 5 мг/кг не вызывает видимых токсических эффектов. Полученные результаты позволяют сделать вывод о перспективности дальнейшего исследования противоопухолевых свойств химерного пептида, включающего циклинин-гибирующую последовательность белка P16INK4a.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1.
4.
5.
Dai L., Liu Y., Liu J., Wen X., Xu Z., Wang Z., Sun H., Tang S., Maguire A.R., Quan J., Zhang H., Ye T. A novel cyclinE/cyclinA-CDK inhibitor targets p27(Kip1) degradation, cell cycle progression and cell survival: implications in cancer therapy. Cancer Lett. 2013; 333 (1): 103-12. Cecchini M.J., Thwaites M., Talluri S., Macdonald J.I., Passos D.T., Chong J.L., Cantalupo P., Stafford P., Saenz-Robles M.T., Francis S.M., Pipas J.M., Leone G., Welch I., Dick F.A. A retinoblastoma allele that is mutated at its common E2F interaction site inhibits cell proliferation in gene targeted mice. Mol. Cell Biol. 2014; Mar. 24 Fang X., Jiang Z., Peng J., Yao N., Fang X., Zheng S. Proliferative and invasive effects of inhibitors of kinase 4(P15(ink4b) and P16(ink4a)/CDKN2) gene activation on RKO human colorectal cancer cells. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi. 2014; 17 (1): 31-5.
Radulescu R.T., Fahraeus R. Targeting the RB pathway for cancer therapy: peptide mimetic foundations and promise. Am. J. Transl. Res. 2010; 2 (2): 209. Shapiro G.I., Rodon J., Bedell C., Kwak E.L., Baselga J., Brana I., Pandya S.S., Scheffold C., Laird A.D., Nguyen L.T., Xu Y., Egile C., Edelman G. Phase I safety, pharmacoki-netic, and pharmacodynamic study of SAR245408 (XL147), an oral pan-class I PI3K inhibitor, in patients with advanced solid tumors. Clin. Cancer Res. 2014; 20 (1): 233-45. Hironobu Harada, Kou Nakagawa, Shinji Iwata, Masahiro Saito, Yoshiaki Kumon, Saburo Sakaki, Kohji Sato, Katsuyuki Ha-mada. Restoration of Wild-Type p16 Down-
Regulates Vascular Endothelial Growth Factor Expression and Inhibits Angiogenesis in Human Gliomas. Cancer Res. 1999; 1 (59): 3783-9.
7. Choon-Taek Lee, Ja Young Seol, Kyung-Ho Park, Chul-Gyu Yoo, Young Whan Kim, Curie Ahn, Yeong-Wook Song, Sung Koo Han, Jin Suk Han, Suhnggwon Kim, Jung-Sang Lee, Young-Soo Shim. Differential Effects of Adenovirus-p16 on Bladder Cancer Cell Lines Can Be Overcome by the Addition of Butyratel. Clin. Cancer Res. 2001; 7: 210-4.
8. Fahraeus R., Paramio J.M., Ball K.L., Lain S., Lane D.P. Inhibition of pRb phosphorylation and cell-cycle progression by a 20-residue peptide derived from p16CDKN2/INK4A. Current Biology. 1996; 6 (1): 84-91.
9. Боженко В.К., Кулинич Т.М., Иванов А.В., Кудинова Е.А., Шишкин А.М, Харченко В.П. Исследование влияния интернализуемого пептида p16INK4A на краткосрочные культуры опухолей человека. Вопросы онкологии. 2009; 55 (4): 451-4.
[Bozhenko V.K., Kulinich T.M., Ivanov A.V., Kudinova E.A., Shishkin A.M., Kharchenko V.P. Effect of metabolizable peptide p16INK4a on short-lived human tumor cultures. Voprosi Onkologii. 2009; 55 (4): 451-4 (in Russian)]
10. Кулинич Т.М., Харченко В.П., Филясова Е.И., Шишкин А.М., Боженко В.К. Цитостатические и цитотоксические свойства химерных пептидов, содержащих циклинингибирующие фрагменты. Бюллетень экспериментальной биологии и
медицины. 2008; 145 (1): 37-40. [Kulinich T.M., Kharchenko V.P., Filyasova E.I., Shishkin A.M., Bozhenko V.K. Cyto-static and cytotoxic properties of chimeric peptides containing cyclin-inhibiting fragments. Bull. Exp. Biol. Med. 2008; 145 (1): 37-40 (in Russian)]
11. Ryo Hosotani, Yoshiharu Miyamoto, Koji Fujimoto, Ryuichiro Doi, Akira Otaka, Nobu-taka Fujii, Masayuki Imamura. Trojan p16 Peptide Suppresses Pancreatic Cancer Growth and Prolongs Survival in Mice. Clin. Cancer Res. 2002; 8: 1271-6.
12. Wing Cheong Lee Andrew, Li Jian-Hua, Shi Willa, Li Anna, Liu Emily Ng, Ta-Jen, Henry J. Klamut, Fei-Fei Liu. Р16 Gene therapy:
A potentially efficacious modality for nasopharyngeal carcinoma. Mol. Cancer Ther. 2003; (2): 961-9.
13. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К., Андронова Н.В., Гарин А.М. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. РУ. Хабриева. 2-е изд., перераб. и доп.) 2005; 637-51.
[Treshalina E.M., Zhukova O.S., Gerasimova G.K., Andronova N.B., Garin A.M. Methodical instruction on investigation of antitumor activity of pharmacological substances. In: Guidance on experimental (pre-clinical) investigation new pharmacological substances (ed. Chabriev R.U.-2d еd.). 2005; 637-51 (in Russian)]
Поступила 14 мая 2014 г.
Молекулярная медицина №4, 2014 39
