CC BY
29
Раздел - молекулярная медицина
Исследование специфической противоопухолевой активности нового пептидного ингибитора Ras-ГТФазы
Кулинич Т.М., Шишкин А.М., Иванов А.В., Боженко В.К.
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России), 117997, ул. Профсоюзная, д. 86, г. Москва
Ответственный за переписку: Кулинич Татьяна Михайловна тел. 89261372035
Информация об авторах
Кулинич Татьяна Михайловна - заведующая лабораторией иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н.
Шишкин Александр Михайлович - старший научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н. Иванов Андрей Валерьевич- старший научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, к.м.н.
Боженко Владимир Константинович - зав. отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ, д.м.н., профессор Финансирование:
Работы выполнены при поддержке ГК Минобрнауки России № 14.N08.11.0057 от 10 ноября 2015 г.
Резюме
Цель: изучение специфической фармакологической активности шу^гопептидного ингибитора Ras-ГТФазы.
Материалы и методы: методами проточной цитофлуориметрии, МТТ-теста и исследованием пролиферации «в реальном времени» (iCELLIgence, ACEA Biosciences) на культурах клеточных линий рака легкого человека (A549, H460 и H1299) проведена оценка цитотоксического эффекта (количество жизнеспособных клеток, уровня апоптоза и пролиферативной активности) при воздействии на клетки пептидного ингибитора Ras-ГТФазы.
Результаты: показано, что исследуемая последовательность обладает выраженными противоопухолевыми свойствами, способна индуцировать апоптоз и тормозить процессы пролиферации в культурах клеток немелкоклеточного рака легкого.
Заключение: на основании проведенных исследований было показано, что исследуемая химерная последовательность - пептидный ингибитор Ras-ГТФазы обладает выраженными цитотоксическими и антипролиферативными свойствами в отношении культур клеток немелкоклеточного рака легкого человека.
Ключевые слова: химерные интернализуемые пептиды, апоптоз, рак легкого, проточная цитофлуориметрия, ингибиторы циклиновых киназ
The study of specific antitumor activity of a new peptide inhibitor of Ras-GTPase Kulinich T.M., Shishkin A.M., Ivanov A.V., Bojenko V.K.
Federal State Budgetary Institution Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, 117997 Moscow, Profsoyuznaya str., 86,
Summary
Purpose: to perform the in vitro study of the specific pharmacological activity of a peptide inhibitor of Ras-GTPase.
Materials and methods: the cytotoxic effect, level of apoptosis, proliferative activity of peptide inhibitor of the Ras-GTPase were estimated for the human cell lines of lung cancer (A549, H460 and H1299) with the methods of flow-cytometry, MTT assay and the "real-time" on cell line proliferation analysis (iCELLIgence, ACEA Biosciences).
Results: the results showed that the analyzed sequence possesses the high anti-tumor properties; it is able to induce apoptosis and to inhibit the processes of proliferation in human cell cultures of lung cancer.
Conclusion: on the basis of conducted studies, it was shown that the investigated peptide sequence (inhibitor of Ras-GTPase) has the pronounced cytotoxic and antiproliferative properties against cultures of cells of human lung cancer.
Keywords: chimeric peptides, cell penetrating peptides, CPP, apoptosis, lung cancer, flow cytometry, Ras-GTPase inhibitor
Введение
В настоящее время находят все более широкое применение лекарственные средства направленного действия («таргетные» препараты), влияющие на различные этапы процессов внутриклеточной передачи сигнала, от лиганд - рецепторных взаимодействий до процессов, протекающих в ядре клеток. Изучение белков, участвующих во внутриклеточных сигнальных каскадах, безусловно, важно не только для расширения фундаментальных
представлений о биологии клеток эукариот, но и для понимания молекулярных механизмов патогенеза различных заболеваний человека и выявления новых молекулярных мишеней для направленного воздействия на них.
Семейство широко распространенных белков Ras (млекопитающие, насекомые, дрожжи, нематоды и др.) регулирует различные аспекты клеточной пролиферации, дифференцировки и морфологии. Многие из них являются протоонкогенами: их повышенная активация приводит к злокачественной трансформации клеток. Ras-самый распространенный онкоген опухолей человека, на который не действует ни один из зарегистрированных противоопухолевых препаратов. Мутации генов Ras-ГТФаз приводят к тому, что Ras-киназа постоянно находится в комплексе с GTP (guanosinetriphosphate). Двойной комплекс Ras-GTP c высокой афинностью связывает Raf-киназу, в результате чего образуется активный тройной комплекс Ras-Raf-GTP, который фосфорилирует MEK киназу и, тем самым, передает сигнал дальше по каскаду киназ. Разрабатываемый препарат связывается с активным комплексом Ras-GFP по сайту связывания Raf-киназы и препятствует образованию активного тройного комплекса Ras-Raf-GTP, тем самым ингибируя сигнальный путь MAPK/ERK. Мутации Ras, приводящие к гиперактивации сигнального пути MAPK/ERK, встречаются в 25% всех опухолей человека [3,6,8]. Таким образом, Ras является перспективной молекулярной мишенью при онкологических заболеваниях, а отсутствие эффективных ингибиторов для его регулирования стало предметом активных исследований в последние годы для поиска новых путей решения этой проблемы [7,9].
Разрабатываемый нами подход создания новых противоопухолевых препаратов основан на использовании новой, инновационной технологии внутриклеточной доставки высокомолекулярных соединений на основе СРР (cell penetrating peptides) или интернализуемых пептидов [5]. В рамках этой технологии нами исследован спектр химерных пептидных конструкций, включающих в составе одной полипептидной цепи транспортные последовательности и функциональные ингибирующие последовательности из белков ингибиторов циклиновых киназ р21СIP/KIP и p16INK4a. Полученные результаты показали перспективность использования данной технологии для создания антипролиферативных препаратов, имеющих специфическую противоопухолевую активность и направленных на широкий спектр злокачественных новообразований [1,2].
Нами была проведена разработка молекулярной структуры химерной пептидной последовательности, включающей в свой состав активную группу - ингибитор Ras-ГТФазы и интернализуемый вектор - Tat (фрагмент белка вируса СПИДа). Целью данной работы было исследование специфической противоопухолевой активности полученной пептидной
последовательности в отношении клеточных линий немелкоклеточного рака человека, т.к. это одна из наиболее неблагоприятных форм рака, и частота мутаций Ras для нее особенно высока [4].
Материалы и методы
Исследование эффективности последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы (Ras-Tat) было проведено в условиях in vitro. В качестве моделей были использованы опухолевые культуры клеток линий человека: А549 (аденокарцинома легкого), Н1299 и Н460 (немелкоклеточный рак легкого). Работа с культурами клеток
Клетки культивировали в среде DMEM (ПанЭко), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (ПанЭко), 50мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глутамина. Культивирование осуществлялось в С02-инкубаторе (Sanyo) в вентилируемых культуральных флаконах при 37 °С, в 5% атмосфере СО2. Для пересева клеток из культурального флакона удаляли среду и, после промывки 2 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (ПанЭко) добавляли 0,5 мл 0,25% раствора трипсина в ЭДТА. Пересев клеток осуществлялся таким образом, чтобы на момент добавления к среде исследуемой пептидной последовательности конфлюэнтность составляла 40-50%. Мониторинг состояния клеточных культур осуществлялся с помощью микроскопа МСХ300 (Micros). Методы
Для исследования цитотоксических эффектов последовательности Ras-Tat методом МТТ-теста клетки опухолевых культур рассеивались в лунки 96-луночного планшета и растили до 50% конфлюэнтности. Среда сливалась, и к клеткам добавляли среду, содержащую исследуемую последовательность в концентрациях 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ и 40 мкМ в 200 мкл среды для культивирования. В качестве контроля использовалась среда, содержащая только интернализуемую последовательность (Tat) в тех же концентрациях. Все концентрации исследовались в 3 повторах. Планшеты помещались на сутки в СО2-инкубатор при 37 °С и 5% СО2. Постановка МТТ-теста выполнялась по стандартной методике, определение оптической плотности экстракта производилось на длинах волн 492 нм и 560 нм с помощью планшетного ридера SpectraMaxi3 (Molecular Devices).
Цитофлуорометрический анализ проводился на проточном цитофлуориметре CytomixFC 500 (Beckman Coulter, USA). Полученные данные обрабатывали, используя программу FloMax, версия 3.0. Для анализа уровня апоптоза была использована методика двойной окраски AnnexinV (аннексинV)/PI (пропидия йодид), которая позволяет одновременно определять интактные клетки (отрицательные и по аннексинуV, и по пропидию йодиду), клетки, находящиеся в «раннем» апоптозе (положительные по
аннексинуV, отрицательные по пропидию йодиду), и клетки, находящиеся в «позднем» апоптозе или в некрозе (положительные по пропидию йодиду).
Исследование влияния последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы на пролиферативную активность проводилось на приборе RTCAiCELLIgence (ACEA Biosciences). Устройство представляет собой клеточный анализатор в реальном времени, работающий на принципе микроэлектронной сенсорной технологии, позволяющий осуществлять непрерывный мониторинг состояния клеточных культур в течение нескольких суток. Для проведения исследования клетки высаживались в специальные планшеты. Для проведения исследования образцы культур были посеяны в количестве 40 тыс/ячейку в 400 мкл среды в планшет icelligence. Добавление исследуемой пептидной последовательности осуществлялось непосредственно в лунку планшета. Среда инкубации имела следующий состав: DMEM (ПанЭко), 10% ЭТС (ПанЭко), антибиотики пенициллин и стрептомицин по 50 Ед/мл (ПанЭко). Анализ полученных кривых позволяет определять относительный «клеточный индекс» отражающий активность пролиферации клеток.
Статистическая обработка полученных результатов была проведена с использованием стандартных методов пакета анализа Excel 2010 и статистических методов специализированной программы RTCA Data Analysis Software 1.0. Результаты
На основании проведенных исследований цитотоксического эффекта последовательности Ras-Tat методом МТТ был показан выраженый эффект относительно исследуемых линий рака легкого человека (А549, Н460 и Н1299). Эффект пропорционален концентрации Ras-Tat. Показано, что наибольший эффект наблюдался при инкубации RasTat с клетками Н1299, данная культура оказалась наиболее чувствительной к воздействию исследованной пептидной последовательности (Рис. 1).
Изменение количества живых клеток в культуре Н1299
к о т е
ы
в
и
о в т с е ч и л о
110 100 90 80 70 60 50 40 30 20
24 часа 48 часов
10 20 30 40
Концентрация Яав-Та!:, мкМ
50
0
Рис. 1. Изменение количества живых клеток при воздействии на культуру Н1299 последовательности Яав-Та! в различных концентрациях при инкубации 24 и 48 часов. Ось Х - концентрация исследуемой последовательности Ras-Tat в культуральной среде, мкМ; ось У - количество живых клеток в культуре, %. Указаны значения стандартного отклонения (М±ББ).
На основании проведенных исследований пептидной последовательности Ras-Tat методом МТТ было показано, что она обладает выраженым цитотоксическим действиемотносительно исследуемых линий рака легкого человека (А549, Н460 и Н1299).
Методом проточной цитофлуориметрии проведено исследование активации апоптозаи некроза при воздействии на культуры А549, Н460 и Н1299 пептидного ингибитора Ras-ГТФазы. Показано, что зависимости уровней апоптоза и некроза для исследованных клеточных линий при воздействии на них последовательности Ras-Tat, имеют схожий вид (Рис. 2).
о н <и
Изменение уровня апоптоза при воздействии на клетки
Ras-Tat
и а
и <и Т Я н о н с о
с
«
о а н и <и Т Я Ч о
И
50 40 30 20 10 0
*
А549 Н460 Н1299
10 20 30 40
Концентрация Ras-Tat, мкМ
50
0
Рис. 2. Изменение уровня апоптоза в культуре клеток линий А549, Н460 и Н1299 при воздействии пептидной последовательности Ras-Tat в концентрациях 2 - 40 мкМ. Метод проточной цитофлуориметрии, окраска Аппехт V-FITС (^1) / Р1 (FL3). Ось Х - концентрация исследуемой последовательности Ras-Tat в культуральной среде, мкМ; ось Y - количество клеток, вступивших в апоптоз, %. Указаны значения стандартного отклонения (М±SD).
Уровень апоптоза при воздействии Ras-Tat в концентрации 40 мкМ и времени инкубации 24 часа возрастает до 35% в культуре А549 и до 40% в культуре Н460, а уровни некроза до 32% и 31% соответственно. В то же время, эффект воздействия последовательности Ras-Tat на клетки линии Н1299 имеет принципиальные особенности, уровень индуцированного апоптоза в данной культуре был достоверно выше, чем уровень некроза. Количество клеток, вступивших в апоптоз (ранний + поздний апоптоз) при воздействии пептидной последовательности Ras-Tat в концентрации 10 мкМ в среднем составило 27,7%, при увеличении концентрации до 20 мкМ - 38% и при концентрации 40 мкМ- 45%.
Проведенное исследование видов клеточной гибели (апоптоз и некроз) при воздействии на клетки линий рака легкого человека методом проточной цитофлуориметрии с использованием двойной окраски Аппехт V-FITС/PI, показало: пептидная последовательность ингибитора Ras-ГТФазы обладает выраженным специфическим противоопухолевым действием в отношении культур клеток рака легкого человека. Данный эффект характеризуется индукцией клеточной гибели преимущественно по пути апоптоза. Уровень индуцированного внесением в культуральную среду пептидной последовательности
Ras-Tat апоптоза зависит от типа клеток и обусловлен, по-видимому, молекулярно-генетическими особенностями клеточной линии.
Для динамического исследования влияния изучаемой пептидной последовательности -на клеточный рост использовали прибор RTCA ЮЕКЬ^епсе. Для каждой клеточной линии было поставлено по пять экспериментов по исследованию влияния различных концентраций Ras-Tat в диапазоне 2 - 40 мкМ. На рисунке 3 представлен пример графиков клеточного роста для культуры А549.
контрольный образец 2 мкМRas-Tat 5 мкМRas-Tat 10 мкМР^^ 20 мкМР^^
40 мкМР^^
40,0 50,0 60,0 Ите (¡п Ноиг)
Рисунок 3. Исследование воздействия пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в концентрациях 2 - 40 мкМ на культуру А549 методом клеточного анализа ЮЕКЬ^епсе.
На графиках представлены средние значения клеточного цикла и значения стандартного отклонения (М±БО). Ось Х - время инкубации клеток А549 с последовательностью Ras-Tat, час; У - значение клеточного индекса, относительные единицы.
При исследовании антипролиферативного эффекта пептидной последовательности Ras-Tat в отношении клеток линии А549, было показано, что эффект имеет четкую концентрационную зависимость. При воздействии на клетки Ras-Tat в концентрации 2 мкМ показатель клеточного индекса (отражает количество прикрепленных, живых клеток) снижается относительно контрольного образца в 1,2 раза, при воздействии Ras-Tat в концентрации 5 мкМ в 1,6 раза, при 10 мкМ в 2,14 раза, при 20 мкМ в 4 раза, а при воздействии на клетки А549 Ras-Tat в концентрации 40 мкМ, мы наблюдали полную остановку пролиферации со снижением клеточного индекса до отрицательных значений, т.е. клеток становилось меньше, чем было внесено изначально.
При анализе воздействия пептидной последовательности Ras-Tat на клетки линии Н460 также был обнаружен цитостатический эффект, определяющийся по снижению пролиферативной активности в культуре при внесении в среду исследуемой последовательности. Эффект имел концентрационную зависимость: при воздействии на
клетки Н460 лекарственного средства Ras-Tat в концентрации 5 мкМ клеточный индекс снижался в 1,3 раза, при воздействии концентрации 10 мкМ - в 1,5 раза, при воздействии 20 мкМ в 2,4 раза, при воздействии 40 мкМ в 4 раза по сравнению с контрольными образцами.
При исследовании цитостатического эффекта на клетках культуры Н1299 был получен более слабый эффект, чем для культур А549 и Н460. Так значение клеточного индекса при воздействии на клетки Н1299 пептидной последовательности Ras-Tat в концентрации 5 мкМ снижалось в среднем в 1,1 раза, при воздействии 10 мкМ в 1,5 раза, при воздействии 20 мкМ в 1,6 раза, при воздействии 40 мкМ в 2,5 раза. Полученный низкий антипролиферативный эффект для клеток Н1299 вполне согласуется с результатами о высоком цитотоксическом эффекте последовательности Ras-Tat в отношении данной клеточной линии. Клетки, обладающие высокой пролиферативной активностью, по-видимому, более подвержены проапоптотическому воздействию ингибитора Ras-ГТФазы, в то же время клетки, уходящие из-под его воздействия, продолжают вступать в деление и размножаться.
С помощью программного обеспечения клеточного анализатора ЮЕКЬ^епсе были определены изменения величины времени удвоения культур клеток при воздействии на клетки пептидной последовательности Ras-Tat. Для линии клеток А549 было показано, что при концентрации Ras-Tat 40 мкМ время удвоения клеточной популяции возрастает до 18,4 часа, в контроле время удвоения культуры составляло 8,3 часа. Для культуры клеток Н460 при концентрации 20 мкМ, задержка времени удвоения пролиферации изменилась в 1,8 раз, при увеличении концентрации до 40 мкМ в 2,1 раз.
Рассчитанное время удвоения популяции для клеток культуры Н1299, составило 18,3 часа при 20 мкМ пептидной последовательности Ras-Tat, однако, увеличение концентрации Ras-Tat до 40 мкМ не привело к дальнейшей задержке пролиферации и составило 18,4 часа. Заключение
При исследовании противоопухолевого эффекта последовательности пептидного ингибитора Ras-ГТФазы в отношении культур рака легкого человекаA549, Н1299 и Н460 было показано, что исследуемая пептидная последовательность Ras-Tat обладает выраженной цитотоксической активностью, определяющейся в увеличении количества мертвых клеток и снижении количества живых клеток в культурах исследуемых линий. Исследуемая последовательность индуцирует апоптоз в клетках рака легкого человека, причем данный эффект зависит от типа клеточной линии. Цитотоксический и проапоптотический эффекты имеют прямую концентрационную зависимость. Антипролиферативный эффект пептидной последовательности Ras-Tat, при внесении
пептида в культуральную среду, также имеет концентрационную зависимость и различен для разного типа клеток. Список литературы
1. Кулинич Т.М., Болдырев А.Н., Боженко В.К. Исследование противоопухолевой активности химерного пептида P16_ANTP in vivo. Молекулярная медицина. 2014. №. 4. С. 36-39.
2. Bozhenko V.K., Kulinich T.M., Kudinova E.A. New targeted anti CDK4/6 peptide MM-D37K. Journal of Clinical Oncology. 2013. V. 31. e13545.
3. Huff S.Y., Quilliam L.A., Cox A.D., Der C.J. R-ras is regulated by activators and effectors distinct from those that control Ras function. Oncogene. 1997. V. 14. No. 2. P.133-143.
4. Kempf E., Rousseau B., Besse B., Paz-Ares L.KRAS oncogene in lung cancer: focus on molecularly driven clinical trials. Eur Respir Rev. 2016. V. 25. No. 139. P. 71-76. DOI: 10.1183/16000617.0071-2015.
5. Kharchenko V. P., Bojenko V. K., Kulinich T. M., et al. Cytotoxity of Chimera Peptides Incorporating Sequences of Cycline Kinases Inhibitors. Voprosy Oncologii. 2007. V. 53. No. 4. P. 448-452.
6. Marte B.M., Rodriguez-Viciana P., Wennstrom S., et al. R-ras can activate the phosphoinositide 3-kinase but not the MAP kinase arm of the Ras effector pathways. Curr Biol. 1997. V. 7. No. 1. P. 63-70.
7. Stephen A. G., Esposito D., Bagni R.K., McCormick F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 2014. V. 25. N. 3. P. 272-281.
8. Takai Y., Sasaki T., Matozaki T. Small GTP- binding proteins. Physiol Rev. 2001. V. 81. No. 1. P. 153-208.
9. Thompson H. US National Cancer Institute's new Ras project targets an old foe. Nat Med. 2013. V. 19. No. 8. P. 949-950.
