CC BY
84
Раздел - молекулярная медицина Исследование особенности активации апоптоза пептидом - ингибитором циклиновых киназ MM-D37K в клетках линии аденокарциномы толстой кишки НТ29
Кулинич Т.М., Боженко В.К.
ФГБУ Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава России
Кулинич Татьяна Михайловна, к.м.н., зав. лабораторией иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий в онкологии ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» МЗ РФ, тел. +7 (926) 137-20-35;
Боженко Владимир Константинович, д.м.н., профессор, заведующий отделом
молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ «Российский
научный центр рентгенорадиологии» МЗ РФ, тел. +7 (499) 120-81-91;
ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава РФ, г. Москва.
117997, Москва, ГСП-7, ул. Профсоюзная, д. 86, ФГБУ «РНЦРР»
Контактное лицо: Кулинич Татьяна Михайловна, тел. +7 (926) 137-20-35, E-mail:
Резюме
Белок р16INK4a является одним из ингибиторов циклин-зависимых киназ D-типа и нарушение его функций характерно для многих злокачественных новообразований, включая колоректальный рак (КРР). Ранее мы показали, что пептид MM-D37K, включающий последовательность 83-103 из р16INK4a обладает цитостатическим и апоптоз активирующим действием в отношении опухолей различного генеза. Целью данного исследования являлось изучение особенностей проапоптотического эффекта интернализуемого пептида MM-D37K на клеточную линию КРР НТ29. Материалы и методы: эксперименты проводились на линии клеток НТ-29 (аденокарцинома толстой кишки); для анализа показателей апоптоза и клеточного цикла был использован метод проточной цитофлуориметрии.
Результаты: пептид MM-D37K вызывает задержку перехода G1 - S и активирует апоптоз в клетках КРР НТ29. Активация апоптоза имеет фазозависимый характер и происходит во время перехода клеток из G1 в S клеточного цикла через 4-8 часов после снятия блока пролиферации. Это совпадает по времени с задержкой клеток в G1, вызываемой
пептидом-ингибитором циклиновых киназ ММ^37^ Обнаруженный эффект можно объяснить мутацией гена р16INK4a в исследуемой линии клеток.
Ключевые слова: CPP-cell penetrating peptides, интернализуемые пептиды, р^Ш^^ циклин-зависимые киназы (Cdk 4/6).
Оглавление
Введение
Цель исследования Материалы и методы Результаты
Обсуждение результатов Список литературы
Введение
Нарушения регуляции клеточного цикла являются неотъемлемым и основополагающим признаком неопластической клетки (Gelbert et al., 2014; Felix et al., 2015). Переход от одной фазы клеточного цикла к другой обеспечивается изменением активности последовательно сменяющих друг друга циклин-зависимых киназ (Aleem, Arceci, 2015; de Araujo et al., 2014). Регуляция активности циклин-зависимых киназ (Cdk) осуществляется за счет направленного изменения уровня экспрессии определенных циклинов. Кроме того, активность Cdk в свою очередь регулируется изменениями фосфорилирования определенных аминокислотных остатков. В активной форме комплексы циклин-Cdk фосфорилируют регуляторные белки, контролирующие протекание данной фазы (Donnellan, Chetty, 1998; Bardeesy et al., 2006; Peyressatre et al., 2015; Shi et al., 2015).
Известно, что действие многих протоонкогенов и опухолевых супрессоров направлено на нарушение регуляции тех или иных комплексов циклин - Cdk. Существует два основных семейства CKI (cyclin kinase inhibitor) белков, осуществляющих ингибирование Cdk. Представители первого семейства Cip/Kip (Cdk inhibitory protein) -р21, р27 и р57, ингибируют Cdk2 - и Cdk4/6 - циклиновые комплексы, осуществляя G1/S - и G2 - контроль. Представители второго семейства INK4 (inhibitor of kinase 4) - р15, р16, р18 и р19, узкоспецифичны для Cdk 4/6 - циклин D комплексов и осуществляют аналогичные функции (Toogood et al., 2005; Malumbres, Barbacid, 2009; The et al., 2015). Ген ингибитора опухолевого роста p16INK4A контролирует ингибирование циклин-зависимых киназ 4/ 6 и часто инактивирован в опухолях различной локализации. Инактивация данного гена в опухолевых клетках происходит с помощью различных механизмов (мутации различной природы, гиперметилирование промотора и др.). Главная биологическая функция р16 - регулирование клеточного цикла, он блокирует переход из G1 в S фазу по pRb-зависимому механизму, ингибируя активность Cdk-4 и Cdk-6. Однако
в экспериментальных исследованиях на опухолевых линиях различных локализаций, было показано, что ген р16 обладает и другими важными биологическими функциями. В клетках глиомы восстановление функций р16 приводит к угнетению ангиогенеза и блокирует метастазирование; в клетках других опухолей вызывает индукцию апоптоза через регуляцию o-sBi - фибронектинового рецептора (Oricchio et al., 2014). В ряде работ показано, что восстановление его функций может иметь терапевтический эффект (Schulz et al., 2008; Lu et al., 2012).
В настоящее время активно изучается возможность создания лекарственных агентов на основе уникальных свойств интернализуемых пептидов (в английской аббревиатуре CPP-cell penetrating peptides). Интернализуемые пептиды представляют собой короткие пептидные последовательности, длинной от 8 до 30 аминокислот, которые способны проникать через мембраны клеток и выполнять векторные функции -переносить в клетки различные соединения (Rittner et al., 2002, Alhakamy et al., 2013). СРР способны проникать в клетку и клеточные органеллы, включая клеточное ядро, не нарушая плазматическую и ядерную мембраны, и при этом способны осуществлять транспорт различных по размеру и свойствам молекул. СРР обладают низкой иммуногенностью, одинаково эффективно проникают в разные типы клеток. Проникновение не носит рецепторный характер; не зависит от температуры в пределах от 4 °C до 37 °C; при этом не используется фаго - или пиноцитозный путь. СРР применяется для доставки таких соединений как пептиды, белки, РНК и ДНК и их производные, а также наночастицы (Coupade, Fittipaldi et al., 2005).
Ранее мы показали, что последовательность 82-103 из белка Р16INK4a, соединенная с СРР последовательностью Antetnnapedia - Antp (пептид р16-pANTP -MM-D37K) эффективно накапливается в цитоплазме и ядре опухолевых клеток, что приводит к остановке клеточного деления и активирует апоптоз (Харченко и др., 2007; Kulinich et al., 2008). Нами было также обнаружено, что уровень индуцированного апоптоза зависит от
времени его регистрации. В настоящем исследовании мы изучали временную зависимость индукции апоптоза пептидом MM-D37K на синхронизированной линии клеток аденокарциномы толстой кишки человека НТ-29.
Цель исследования: изучение проапоптотического эффекта интернализуемого пептида, включающего функциональную группу ингибитора циклиновых киназ р16INK4a.
Материалы и методы
В работе была использована линия клеток НТ-29 (аденокарцинома толстой кишки, человек). Культивирование клеточной линии осуществляли в среде DMEM, содержащей 10 % FSB, 300 нг антибиотика-антимикотика и гентамицина и 2 мМ L-глутамина (37 °С, 5 % атмосфера СО2). Для снятия клеток с плашки использовали 0.25 % раствор трипсина в ЭДТА.
Перед проведением экспериментов клетки сеяли на 24-луночный планшет в количестве около 1*105 на лунку. После прикрепления клеток к подложке планшета (через 24 часа), среду, содержащую 10% FSB (fetal serum bovine) заменяли на среду, содержащую 0,5 % FSB, тем самым добиваясь остановки клеточного деления в G0/G1-фазе клеточного цикла (синхронизация обедненной средой). Инкубация с 0,5 % FSB продолжалась в течение 24 часов при 37 °С и 5 % СО2. После проведенной синхронизации культуральную среду заменяли на среду, содержащую 10 % FSB, «снимали блок синхронизации». В опытных образцах в культуральной среде был растворен MM-D37K в концентрации 40 мкМ. Анализ результатов проводился каждые 2 часа, для этого с помощью раствора трипсина снимались клетки с лунки в контрольной и опытной группе.
Для оценки изменений распределения клеток по фазам клеточного цикла и уровня апоптоза в образцах был применен метод окраски фиксированных образцов йодистым пропидием (Calbiochem, San Diego, США). Предварительная фиксация клеток была
проведена с помощью 70 % этилового спирта, в течение 24 часов. Для исключения связывания йодистого пропидия с РНК образцы обрабатывались РНКазой (R - 4875, Sigma, США) в течение 15 минут при 37 °С.
Обработка полученных результатов проводилась с помощью программы Cytomics™ FC 500, версия программного обеспечения RXP 1.0. и программы для анализа показателей клеточного цикла ModFit 3.0 ME 04086, USA.
Результаты
При анализе изменений в распределении фаз клеточного цикла было получено, что в контрольных образцах через 4 часа после снятия блока синхронизации в популяции клеток начинает возрастать доля клеток в S-фазе и снижается количество клеток в G0/G1-фазе. Через 12 часов после снятия блока синхронизации в контрольных образцах уровень S-фазы оказывался наибольшим (48.5 %), затем наблюдалось небольшое снижение. В опытных образцах с растворенным в культуральной среде пептид р16-рА№ГР в концентрации 40 мкМ наблюдалась задержка переходя клеток из G1 в S фазу клеточного цикла, и только через 10 часов после снятия блока синхронизации уровень S-фазы начинал возрастать (Рисунок 1). В образцах с р16-рАЭТР максимальное значение S-фазы наблюдалось через 20 часов. Уровень G0/G1-фазы также начинал снижаться только через 8 часов с момента снятия блока синхронизации. Однако через 24 часа уровень пролиферирующих клеток в контрольных образцах и образцах с р^-pANTP становится сопоставимым. Т.о., внесение р^-pANTP в культуральную среду приводит к остановке пролиферации и индукции задержки вступления клеток линии (НТ-29) в S фазу.
90
80
5 70
§ 60 ш
0 50 н
0
£ 40
1 30
о
8 , Г
А.
- контроль -pAпtp_p16(2)
20 1-1-1-1-1-г-1—I-1-1-1-г
0И 2И 4И 6И 8И 10И 12И 14И 16И 18И 20И 24И время инкубации с пептидом, час
В.
- контроль -рАгЛр_р16(2)
0Ь 2Ь 4Ь 6Ь 8Ь 10И 12И 14И 16И 18И 20И 24И время инкубации с пептидом, час
Рисунок 1. Влияние MM-D37K (р16-pANTP) на пролиферацию клеток линии НТ29 в контрольных образцах и при добавлении к культуральной среде р16-pANTP в концентрации 40 мкМ.
A. Изменение уровня G0/G1-фазы.
B. Изменение уровня S-фазы.
Ось X - время инкубации после снятия блока синхронизации, час; ось Y -количество клеток в определенной фазе клеточного цикла, %.
Анализ динамики уровня апоптоза клеток линии НТ-29 на фоне внесения в культуральную среду пептида MM-D37K показал, что его добавление приводит не только задержке перехода G1-S, но и к резкому увеличению уровня апоптоза до величин 35-45 %, притом, что уровень апоптоза в контрольной популяции составляет 5 и менее процентов (Рисунок 2).
Рисунок 2. Изменение уровня апоптоза в культуре клеток НТ-29 при инкубации с MM-D37K (р16-pANTP) после снятия блока синхронизации. Ось Х - время, час; ось Y -уровень апоптоза, %.
Обращает на себя внимание, что повышение уровня апоптоза имеет фазовый характер и его временной интервал совпадает с временем задержки клеток в G1 фазе клеточного цикла (Рис.1 и Рис.2).
Обсуждение результатов
В неизмененных клетках при активации процессов пролиферации прохождение клеткой G1-фазы (пресинтетический период) сопровождается синтезом циклина D, который активирует циклинзависимые протеинкиназы (cdk 4/6), с помощью cdk-киназ происходит фосфорилирование белков-мишеней (таких как рRb и др.), что необходимо для перехода в S-период. Внесение экзогенной последовательности р16-рА№ГР вызывает ингибирование активности cdk4 и cdk6, входящих в комплекс с циклином D, препятствует фосфорилированию pRb и приводит к остановке клеточного цикла в рестрикционной точке на границе G1-S перехода. Проходя через эту рестрикционную точку, клетка становится безразличной к внешним сигналам, активирующим или ингибирующим
клеточный цикл. Останавливаясь в рестрикционной точке, клетка производит проверку целостности ДНК на наличие повреждений, и запуска процессов репарации. Дальнейшая судьба клетки зависит от характера повреждений и возможностей системы репарации клетки: в случае исправления обнаруженных повреждений клетка начинает деление и входит в S-фазу; в случае, когда репарация невозможна, происходит инициация апоптоза.
Показано, что процесс апоптоза может инициироваться в любой фазе клеточного цикла (Bhattacharya et al., 2014). Это позволяет говорить о том, что метаболическая машина, необходимая для апоптоза, присутствует в клетке на всех фазах клеточного цикла, и если молекулы-эффекторы апоптоза индуцируются, то их индукция не зависит от стадии клеточного цикла. (cell-cycle related manner) (Sherwood et al., 1994). Наблюдаемый нами эффект активации апоптоза в клетках HT29 через 2 часа после снятия пролиферативного блока при добавлении «экзогенного» аналога - ингибитора р16INK4a может говорить о том, что в клетках этой линии отсутствует нормальный ген\белок р16INK4a. Действительно, в литературе описано, что линия НТ29 имеет транскрипционный дефект гена р16INK4a и не синтезирует белок р16 (Fang et al., 2003). Активация апоптоза при добавлении экзогенного фрагмента р16, ингибирующего Cdk 4/ Cdk 6 и останавливающего клетки в контрольной точке G1/S, по-видимому, позволяет запустить процесс проверки целостности генома, отсутствующий в данной линии клеток, что и приводит к активации апоптоза. Опухолевые линии, длительно пассируемые ин витро, имеют гетерогенный популяционный состав, и часть клеток популяции являются анеуплоидными, по-видимому, именно в этой части клеток и инициируется апоптоз. Те клетки, которые смогли преодолеть переход G1/S, вступают в деление. То, что именно задержка в G1 является причиной активации апоптоза, подтверждается и анализом доли клеток в G1 и S фазах клеточного цикла (рис.1). Т.о., полученные результаты проясняют возможный механизм активации апоптоза пептидом (82-103) р^-pANTP. Цитостатический эффект этого пептида, может являться причиной активации процессов
апоптоза в клетках, имеющих дефект гена р16ШК4а, таких как линия аденокарциномы толстой кишки HT29 и, по-видимому, других линий и опухолей с дефектом этого белка.
Заключение
Полученные результаты показывают, что последовательность аминокислот 83-103 из белка р16INK4a обладает способностью не только ингибировать пролиферацию клеток, вызывая остановку клеточного деления в фазе G1, но и активировать процессы апоптоза в клетках аденокарциномы человека. Показано также, что активация апоптоза происходит в узком интервале клеточного цикла и начинается через 2-4 часа после активации пролиферации в Go синхронизированных клетках и продолжается 4-6 часов - до вступления клеток в S фазу. После преодоления этого временного рубежа и вступления клеток в S-фазу уровень апоптоза резко снижается. Т.о., использование экзогенного введения фрагмента белка р16 в виде интернализуемого пептида может быть использовано для элиминации опухолевых клеток, имеющих дефекты в системе контроля пролиферации, такие как: гиперэкспрессия циклина D или циклиновых киназ CDK4/6, мутации гена р16ШК4а или его выключение по другим механизмам и позволяет рассматривать последовательность р16-pANTP как новый и перспективный противоопухолевый препарат.
Список литературы
1. Харченко В.П., Кулинич Т.М., Лунин В.Г. и др. Цитотоксические свойства химерных пептидов, содержащих активные центры ингибиторов циклиновых киназ. Вопросы онкологии. 2007. Т. 53. № 4. С. 448-452.
2. Aleem E., Arceci R.J. Targeting cell cycle regulators in hematologic malignancies. Front Cell Dev Biol. 2015. V. 3. Article 16.
3. Alhakamy N.A., Kaviratna A., Berkland C.J., et al. Dynamic Measurements of Membrane Insertion Potential of Synthetic Cell Penetrating Peptides. Langmuir. 2013. V. 29. №. 49. P. 15336-15349.
4. Bardeesy N., Aguirre A.J., Chu G.C., et al. Both p16Ink4a and the p19Arf-p53 pathway constrain progression of pancreatic adenocarcinoma in the mouse. PNAS. 2006. V. 103. No. 15. P. 5947-5952.
5. Bhattacharya S., Ray R.M., Johnson L.R. Cyclin-dependent kinases regulate apoptosis of intestinal epithelial cells. Apoptosis. 2014. V. 19. No. 3. P. 451-466.
6. de Araujo C.B., Russo L.C., Castro L.M., et al. A Novel Intracellular Peptide Derived from G1/S Cyclin D2 Induces Cell Death. J Biol Chem. 2014. V. 289. No. 24. P. 1671116726.
7. Coupade C.D., Fittipaldi A., Chagnas V., et al. Novel human-derived cell-penetrating peptides for specific subcellular delivery of therapeutic biomolecules. Biochem. J. 2005. V. 390. Pt. 2. P. 407-418.
8. Donnellan R, Chetty R. Cyclin D1 and human neoplasia. Mol Pathol. 1998. V. 51. No. 1. P. 1-7.
9. Fang J.Y., Lu J., Chen Y.X., Yang L. Effects of DNA methylation on expression of tumor suppressor genes and proto-oncogene in human colon cancer cell lines. World J Gastroenterol. 2003. V. 9. No. 9. P. 1976-1980.
10. Felix A.S., Sherman M.E., Hewitt S.M., et al. Cell-cycle protein expression in a population-based study of ovarian and endometrial cancers Front Oncol. 2015. V. 5. Article 25.
11. Gelbert L.M., Cai S., Lin X., et al. Preclinical characterization of the CDK4/6 inhibitor LY2835219: in-vivo cell cycle-dependent/independent anti-tumor activities alone/in combination with gemcitabine. Invest New Drugs. 2014. V. 32. No. 5. P. 825-837.
12. Kulinich T.M., Kharchenko V.P., Filyasova E.I., et al. Cytostatic and cytotoxic
properties of chimeric peptides containing cyclin-inhibiting fragments. Bull Exp Biol Med. 2008 . V. 145. No. 1. P. 37-40.
13. Malumbres M, Barbacid M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nat Rev Cancer. 2009. V. 9. No. 3. P. 153-166.
14. Oricchio E., Ciriello G., Jiang M., et al. Frequent disruption of the RB pathway in indolent follicular lymphoma suggests a new combination therapy. J Exp Med. 2014. V. 211. No. 7. P. 1379-1391.
15. Peyressatre M., Prevel C., Pellerano M., Morris M.C. Targeting Cyclin-Dependent Kinases in Human Cancers: From Small Molecules to Peptide Inhibitors. Cancers (Basel). 2015. V. 7. No. 1. P. 179-237.
16. Rittner K., Benavente A., Bompard-Sorlet A., et al. New Basic Membrane-Destabilizing Peptides for Plasmid- Based Gene Delivery in Vitro and in Vivo. Mol Ther. 2002. V. 5. No. 2. P. 104-114.
17. Schulz P., Scholz A., Rexin A., et al. Inducible re-expression of p16 in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer inhibits lymphangiogenesis and lymphatic metastasis. Br J Cancer. 2008. V. 99. No. 1. P. 110-117.
18. Sherwood S.W., Sheridan J.P., Schimke R.T. Induction of apoptosis by the anti-tubulin drug colcemid: relationship of mitotic checkpoint control to the induction of apoptosis in HeLa S3 cells. Exp Cell Res. 1994. V. 215. No. 2. P.373-379.
19. Shi M.D., Shiao C.K., Lee Y.C., et al. Apigenin, a dietary flavonoid, inhibits proliferation of human bladder cancer T-24 cells via blocking cell cycle progression and inducing apoptosis. Cancer Cell Int. 2015. V. 15. Article 33.
20. The I., Ruijtenberg S., Bouchet B.P., et al. Rb and FZR1/Cdh1 determine CDK4/6-cyclin D requirement in C. elegans and human cancer cells. Nat Commun. 2015. V. 6. Article 5906.
21. Toogood P. L., Harvey P.J., Repine J.T., et al. Discovery of a potent and selective inhibitor of cyclin-dependent kinase 4/6. J Med Chem. 2005. V. 48. P. 2388-2406.
22. Lu Y., Zhang X., Zhang J. Inhibition of Breast Tumor Cell Growth by Ectopic Expression of p16/INK4A Via Combined Effects of Cell Cycle Arrest, Senescence and Apoptotic Induction, and Angiogenesis Inhibition. J Cancer. 2012. V. 3. Р. 333-344.
