CC BY
58
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 576.36.044:546.11'221.1
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯТОРНОГО ВЛИЯНИЯ СУЛЬФИДА ВОДОРОДА НА ПРОГРЕССИЮ ФАЗ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
Вячеслав Викторович НОВИЦКИЙ, Елена Григорьевна СТАРИКОВА, Любовь Александровна ТАШИРЕВА, Наталья Владимировна РЯЗАНЦЕВА
ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России 634050, г. Томск, Московский тракт, 2
Цель исследования: определить молекулярные механизмы влияния сульфида водорода на прогрессию фаз клеточного цикла. Материал и методы. Клетки линии Jurkat служили материалом для проведения данного исследования. Методы исследования включали проточную лазерную цитометрию, вестерн-блоттинг, ПЦР в режиме «реального времени». Результаты и обсуждение. Замедление фазы клеточного цикла G1 при воздействии на клетки линии Jurkat 50 мкм NaHS сопряжено со снижением содержания фосфорилированной формы белка ре-тинобластомы. Фосфорилирование последнего возможно при активации циклин-зависимых киназ циклинами. Показано, что сульфид водорода в низкой концентрации вызывает снижение уровня циклина D1 за счет уменьшения экспрессии соответствующего гена.
Ключевые слова: сульфид водорода, клеточный цикл, циклин D1, белок ретинобластомы.
Сигнальные свойства сульфида водорода (H2S) были открыты сравнительно недавно. В 1996 г. Abe и Kimura показали, что в клетках мозга присутствуют ферменты, синтезирующие данный газотрансмиттер [3]. В настоящее время определены вазодилататорная и нейротрансмис-сионные функции сульфида водорода, мишени (калиевые АТФ-чувствительные каналы) и молекулярные механизмы (сульфгидрирование, взаимодействие с гемом) действия H2S [15]. На разных стадиях клинических испытаний находятся соединения, высвобождающие сульфид водорода [13].
Пристальное внимание исследователей привлекает протекторное влияние H2S на клетки при различных патологических состояниях, реализуемое, в частности, за счет восстановительных свойств данного вещества [9, 11]. При этом было показано проапоптотическое действие сульфида водорода в отношении ряда опухолевых линий [5]. Нами установлено, что H2S может избирательно индуцировать апоптоз опухолевых клеток, не влияя на «здоровые» клетки [1]. В ряде исследований обнаружено, что сульфид водорода ингибирует прогрессию фаз клеточного цикла, в
частности, за счет активации р53-зависмых генов [4, 6]. Chattopadhyay е! а1. [2012] показали, что Н28-высвобождающие нестероидные противовоспалительные агенты эффективно ингибируют рост 11 различных опухолевых клеточных линий за счет ареста фазы клеточного цикла 00/01 [5].
Регуляция продолжительности фаз клеточного цикла (01, 8 и 02) осуществляется на уровне транскрипционного контроля экспрессии цикли-нов. При этом прогрессия фазы 01 происходит под влиянием циклинов периода 01, которые поддерживают свой синтез на определенном уровне и промотируют прогрессию 8-фазы и ми-тотических циклинов, последние репрессируют циклины 01-фазы [14]. Наличие нескольких контрольных «сверочных» точек обеспечивает блок клеточного цикла при повреждении ДНК [8].
Поскольку арест 01-фазы клеточного цикла под действием сульфида водорода может осуществляться как за счет изменения транскрипции генов, кодирующих циклины, так и за счет включения защитных механизмов при повреждении ДНК, необходимо исследование молекулярных механизмов антипролиферативного действия сульфида водорода в отношении опухолевых
Новицкий В. В. - д.м.н., проф., академик РАМН, зав. кафедрой патофизиологии, e-mail: rector@ssmu.ru Старикова Е.Г. - к.м.н., интерн кафедры молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики, e-mail: to-elen@yandex.ru
Таширева Л.А. - интерн кафедры молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики, e-mail: lkleptsova@mail.ru
Рязанцева Н.В. - д.м.н., проф., зав. кафедрой молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики, e-mail: nv_ryazan@mail.ru
клеток. Целью настоящего исследования явилась оценка влияния донора H2S на экспрессию и содержание циклина D1, уровень циклин-зависи-мой киназы 4 (Cdk4), фосфорилированной формы белка ретинобластомы (pRb).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Клетки линии Jurkat (T-лимфобластная лейкемия) были получены из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург). Клетки инкубировали при температуре 37 оС в полной питательной среде, содержащей 90 % RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), 10 % эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург), инактивированной при 56 оС в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Для определения влияния сульфида водорода на прогрессию фаз клеточного цикла в питательную среду инкубации клеток добавляли донор сульфида водорода (натрия гидросульфид гидрат, «Sigma», США) в концентрации 10 и 1 мМ, 500 и 50 мкМ, продолжительность экспозиции - 24 ч.
Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла проводили с помощью программного пакета ModFit7 для проточной лазерной цитометрии (Fax Canto2, «Beckton Dickinson», США). Для пермеабилизации и окрашивания клеток использовали набор CycleTestKit («BD Bioscience», США).
Содержание белков-регуляторов клеточного цикла определяли методом вестерн-блот. Равное количество цельноклеточных лизатов подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии 10 % додецилсульфата натрия, затем осуществляли перенос белков на нитроцел-люлозную мембрану. Далее мембрану блокировали 1 % желатином, трижды промывали TTBS (20 ммоль/л Tris HCl pH 7,6, 137 ммоль/л NaCl и 0,05 % Tween 20). Затем мембрану инкубировали с первичными антителами к циклину D1, pRb, Сdk4 («Sigma») в течение часа. Трижды промывали TTBS и добавляли вторичные антитела с пероксидазной меткой («Biosource», США). Для визуализации результатов исследования использовали хемилюминесцентный метод («NOVEX ECL Chemiluminescent Substrate Reagent kit», Invitrogen, США). Содержание белков определяли путем подсчета интенсивности полос на рентгеновской пленке с помощью программы TotalLab v.2.01. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфатдегидрогеназу («Chemicon», США), выражая содержание исследуемых протеинов как
отношение сигнала определяемого белка к сигналу глицеро-3-фосфатдегидрогеназы в исследуемых образцах.
Метод ПЦР в режиме «реального времени» использовался для количественного определения уровня мРНК гена, кодирующего циклин D1. Выделение тотальной РНК из клеток осуществляли сорбентно-колоночным методом (QIAmp RNA Blood mini Kit, QIAGEN, Германия) согласно инструкции производителя. На следующем этапе синтезировали кДНК на матрице мРНК при участии обратной транскриптазы. Полученный фрагмент кДНК амплифицировали методом ПЦР в режиме «реального времени» с использованием SYBR Green I («Molecular Probe», США) на амплификаторе Mini Opticon («Bio-Rad», США). Результаты выражали в условных единицах (отношение числа циклов амплификации исследуемого гена к количеству циклов амплификации гена «домашнего хозяйства»).
Оценку нормальности распределения полученных результатов проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий (р < 0,05) оценивали с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни (для независимых выборок) и Вилкоксона (для зависимых выборок). Данные представлены в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q1-Q3).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Деление клеток состоит из двух основных событий, характеризующихся репликацией ДНК и разделением хромосом на две отдельные клетки. Репликация ДНК происходит в S-фазу интерфазы. Последней предшествует фаза G1, в течение которой клетки подготавливаются к синтезу ДНК. После S-фазы следует на кото-
рой клетки подготавливаются к митозу. Многочисленные данные литературы свидетельствуют о том, что выбор клеткой пути дифференцировки, пролиферации, апоптоза и старения определяется в течение Gl-фазы клеточного цикла. Одним из ключевых различий между «здоровой» и опу-холевотрансформированной клеткой является длительность G1. Исследования показывают, что продолжительность Gl-фазы опухолевых клеток значительно короче таковой в «нормальных» клетках [10, 12].
Воздействие 50 мкМ и 10 мМ донора сульфида водорода приводило к возрастанию числа клеток, находящихся в Gl-фазе клеточного цикла, за счет уменьшения количества Т-лимфобластных лейкоцитов в S-фазе (p < 0,05). 24-часовая инкубация клеток с 50 мкМ и 10 мМ NaHS не приво-
дила к изменению числа клеток в G2-фазе клеточного цикла относительно контроля (р > 0,05). Распределение клеток по фазам G1, S, G2 клеточного цикла было сопоставимо с таковым в ин-тактной культуре после воздействия 0,5 и 1 мМ NaHS (р > 0,05) (см. рисунок). Полученные результаты наводят на мысль о том, что в основе антипролиферативного действия 50 мкМ и 10 мМ сульфида водорода лежат разные молекулярные механизмы. Для подтверждения данной гипотезы необходимы дальнейшие исследования.
Переход из одной фазы клеточного цикла в другую происходит в строгом порядке и регулируется рядом внутриклеточных протеинов. Ключевыми белками-регуляторами являются циклин-зависимые киназы (Cdk), представляющие собой семейство серин/треониновых протеинкиназ, активируемых в определенных точках клеточного цикла. В проведенном нами исследовании установлено, что количество циклин-зависимой киназы 4 в интактных клетках линии Jurkat составляло 8,06 (7,65-8,38) усл. ед. Известно, что содержание данного фермента в клетках высококонсервативно и не регулируется на уровне экспрессии [10]. Действительно, воздействие доноров сульфида водорода в обеих концентрациях не влияло на содержание Cdk4 в клетках линии Jurkat (р > 0,05) (см. таблицу).
Для активации циклин-зависимых киназ необходимо присутствие циклинов, которые являются необходимыми адаптерами ферментов, активируя их и соединяя с субстратами. Уровень циклинов повышается и снижается по мере прогрессии клеточного цикла, что позволяет данным протеином активировать Сdk в строго определенном порядке [14]. Нами показано, что донор сульфида водорода NaHS в концентрации 50 мкМ снижает содержание белка циклина D1 относительно величины аналогичного параметра в интактной культуре клеток линии Jurkat (р < 0,05). В концентрации 10 мМ сульфид водорода вызывал увеличение уровня циклина D1 по сравнению с интактными
%
1
— г!
1 гр!
1 -гкг
II
□ интактные клетки
I I клетки после воздействия 50 мкМ №Н8
□ клетки после воздействия 500 мкМ ЫаНв
□ клетки после воздействия 1 мМ ЫаНЭ ■ клетки после воздействия 10 мМ №Н8
Рис. Распределение клеток линии Jurkat по фазам клеточного цикла под воздействием различных концентраций донора сульфида водорода, Ме
(01-03)
клетками (р < 0,05) (см. таблицу). Для оценки молекулярных механизмов, лежащих в основе изменения содержания циклина D1 под действием сульфида водорода, сделан анализ ПЦР в режиме «реального времени». В результате показано, что экспрессия мРНК гена, кодирующего изучаемый белок, снижается относительно контроля после обработки клеток NaHS в обеих концентрациях. Таким образом, снижение содержания циклина D1 в клетках при воздействии 50 мкМ донора сульфида водорода опосредовано уменьшением уровня экспрессии соответствующего гена. Установлено, что при действии на клетки 10 мМ NaHS повышается продукция активных форм кислорода, приводящая к эффективному запуску редокс-зависимых сигнальных систем [2]. Возможно, увеличение содержания циклина D1 на
Таблица
Содержание белков-регуляторов клеточного цикла и экспрессия мРНК циклина D1 в клетках линии Зи^Л после воздействия различных концентраций донора сульфида водорода, Ме (01-03)
Условия эксперимента Экспрессия мРНК циклина D1, усл. ед Содержание pRB, усл. ед. Содержание С&4, усл. ед. Содержание циклина D1, усл. ед.
Интактные клетки 1,80 (1,321,76) 9,83 (9,22-14,96) 8,06 (7,65-8,38) 9,83 (8,74-15,58)
Клетки после воздействия 10 мМ N8^ 0,62 (0,57-0,69) 24,16* (23,05-25,11) 7,84 (7,52-8,19) 31,09* (27,84-36,48)
Клетки после воздействия 50 мкМ N0^ 0,83 (0,79-0,90) 7,32* (6,90-8,25) 8,31 (8,0-8,59) 0,72* (0,63-0,74)
Примечание. * - отличие от величины соответствующего показателя интактных клеток статистически значимо при р < 0,05.
фоне уменьшения экспрессии мРНК соответствующего гена происходит за счет нарушения про-теасомальной деградации модифицированного сульфидом водорода и/или активными формами кислорода белка.
После активации Cdk фосфорилируют протеины-мишени, что приводит к дальнейшей прогрессии клеточного цикла. Наиболее изученным субстратом активации комплекса Cdk4/6-циклин D является продукт гена супрессора опухолей (pRb). Ген ретинобластомы локализован на хромосоме 13q14.2 и включает 27 экзонов, занимающих 180 тыс. пар оснований хромосомы 13. Ген продуцирует транскрипт длиной 4,7 тыс. пар оснований, кодирующий 928 аминокислот с молекулярной массой 110 кДа. Rb ингибирует транскрипционные активаторы за счет образования комплекса E2F и инактивации промоторных элементов [7]. В начале G1-фазы pRb становится фосфорилированным, что приводит к распаду комплексов с гистондеацетилазой (HDAC) и высвобождением транскрипционных факторов E2F-1 и DP-1, участвующих в позитивной регуляции генов, продукты которых отвечают за прогрессию S-фазы, включая циклин А, Е, СDC 25 [12].
Содержание pRb в клетках после инкубации с 50 мкМ было достоверно ниже, чем в контроле (р < 0,05). Следовательно, сульфид водорода в данной концентрации вызывает остановку клеток в G1-фазе клеточного цикла за счет уменьшения фосфорилирования белка ретинобластомы, опосредованного снижением уровня циклина D1 под действием указанного газа. Нами показано, что инкубация клеток линии Jurkat с 10 мМ NaHS приводит к возрастанию содержания фосфорили-рованного Rb по сравнению со значениями данного показателя в интактной культуре (р < 0,05) (см. таблицу). Ранее нами было продемонстрировано, что содержание Cdk4 не изменяется под действием газов, однако концентрация циклина D1, являющегося активатором данного фермента, резко увеличивалась при инкубации клеток с 10 мМ донора сульфида водорода. На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что в условиях значительного повышения внутриклеточной концентрации сульфида водорода происходит эффективное образование комплексов циклина D1/Сdk4, о чем свидетельствует возрастание содержания фосфорилированного белка ретинобластомы как продукта ферментативной деятельности активированной Cdk4. Однако несмотря на фосфорилирование Rb, отмечено замедление перехода клеток из G1- в S-фазу клеточного цикла под действием сульфида водо-
рода при введении в культуру его донора в концентрации 10 мМ. NaHS в указанной концентрации может вызывать повышение продукции активных форм кислорода, индуцирующих образование двойных разрывов ДНК. Последние активируют сверочные точки клеточного цикла (пути ATM(ATR)/CHK2(CHK1)-p53/MDM2-p21, ATR/CHK2-CDC25), способные ингибировать прогрессию фаз клеточного цикла [8].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, воздействие сульфида водорода (10 мМ NaHS) на клетки линии Jurkat обусловливает повышение содержания белков, способствующих прогрессии клеточного цикла (циклин D1, pRb). Полученные нами данные об увеличении числа клеток в G1-фазе на фоне возрастания содержания протеинов, промотирую-щих прогрессию данного этапа клеточного цикла, свидетельствует о том, что сульфид водорода в высокой концентрации обладает генотоксиче-ским эффектом, и задержка клеток в G1-фазе необходима для устранения возникших дефектов.
Донор сульфида водорода в концентрации 50 мкМ вызывал специфическое изменение соотношения белков-регуляторов клеточного цикла, приводящее к задержке клеток в G1 фазе. Данное свойство нуждается в дальнейшем изучении с целью применения доноров сульфида водорода в качестве антипролиферативных агентов.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки России в рамках Федеральных целевых программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (Государственное соглашение № 8302, Государственный контракт № П1311 и 14.740.11.0932), «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (Государственные контракты № 16.512.11.2087 и № 16.512.11.2282), а также Совета по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ № 16.120.11.614-НШ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Рязанцева Н.В., Старикова Е.Г., Новицкий В.В. и др. Роль сульфида водорода в регуляции апоптоза клеток // Бюл. эксперим. биол. мед. 2011. 151. (6). 656-659.
2. Старикова Е.Г., Таширева Л.А., Васильева О.А. и др. Участие редокс-сигнализации в опосредованной газами оксидом азота, монооксидом углерода и сульфидом водорода регуляции апоптоза
и клеточного цикла // Бюл. сиб. мед. 2013. 12. (1). 49-55.
3. Abe K., KimuraH. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulator // J. Neurosci. 1996. 76. (3). 1066-1071.
4. Calenic B., Yaegaki K., Ishkitiev N. et al. p53-Pathway activity and apoptosis in hydrogen sulfide-exposed stem cells separated from human gingival epithelium // J. Periodontal Res. 2012. doi: 10.1111/ jre.12011.
5. Chattopadhyay M., Kodela R., Olson K.R., Kashfi K. NOSH-aspirin (NBS-1120), a novel nitric oxide- and hydrogen sulfide-releasing hybrid is a potent inhibitor of colon cancer cell growth in vitro and in a xenograft mouse model // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2012. 419. (3). 523-528.
6. Fan H.N., Wang H.J., Yang-Dan C.R. et al. Protective effects of hydrogen sulfide on oxidative stress and fibrosis in hepatic stellate cells // Mol. Med. Rep. 2012. doi: 10.3892/mmr.2012.1153.
7. Giacinti C., Giordano A. RB and cell cycle progression // Oncogene. 2006. 25. 5220-5227.
8. Kasten M., Bartek J. Cell cycle checkpoints and cancer // Nature. 2004. 432. 316-323.
9. Li L., Rose P., Moore P.K. Hydrogen sulfide and cell signaling // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2011. 51. 169-187.
10. Massague J. G1 cell-cycle control and cancer // Nature. 2004. 432. (7015). 298-306.
11. Mikami Y., Shibuya N., Kimura Y. et al. Hydrogen sulfide protects the retina from light-induced degeneration by the modulation of Ca2+ influx // J. Biol. Chem. 2011. 286. 39379-39386.
12. Neganova I., Lako M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells // J. Anat. 2008. 213. (1). 30-44.
13. Predmore B.L., Lefer D.J. Development of hydrogen sulfide-based therapeutics for cardiovascular disease // J. Cardiovasc. Transl. Res. 2010. 3. 487-498.
14. Sherr C.M., Roberts J.M. Living with or without cyclins and cyclin dependent kinases // Genes. Dev. 2004. 18. 2699-2711.
15. Wang R. The gasotransmitter role of hydrogen sulfide // Antioxid. Redox Signal. 2003. 5. 493-501.
MOLECULAR MECHANISMS OF HYDROGEN SULFIDE REGULATORY INFLUENCE ON CELL CYCLING STATE PROGRESSION
Vyacheslav Viktorovich NOVITSKIY, Elena Grigorievna STARIKOVA, Lubov' Aleksandrovna TASHIREVA, Natalia Vladimirovna RYASANTSEVA
Siberian State Medical University of Minzdrav of Russia 634050, Tomsk, Moskovskiy tract, 2
The aim of the study: identification of molecular mechanisms of hydrogen sulfide influence on cell cycle progression. Material and methods: Jurkat cells were the material of the study. Methods included flow cytometry, western blotting, RT-PCR. Results and discussion: The delay of G1 cell cycle phase connected with the decrease in content of phosphorylated form of retinoblastoma protein in 50 ^M NaHS-treated cells. Phosphorylation of retinoblastoma protein takes place when cyclins activate cycline-dependent kinases. It has been shown that hydrogen sulfide in low concentration leads to decrease of cycline D1 level via decrease of respective gene expression.
Key words: hydrogen sulfide, cell cycle, cycline D1, retinoblastoma protein.
Novitsky V.V. - doctor of medical sciences, professor, academician of RAMS, head of the department of pathophysiology, e-mail: rector@ssmu.ru
Starikova E.G. - candidate of medical sciences, intern of the department of molecular medicine and clinical laboratory diagnostics, e-mail: to-elen@yandex.ru
Tashireva L.A. - intern of the department of molecular medicine and clinical laboratory diagnostics, e-mail: lkleptsova@mail.ru
Ryazantseva N.V. - doctor of medical sciences, professor, head of the department of molecular medicine and clinical laboratory diagnostics, e-mail: nv_ryazan@mail.ru
