CC BY
8
DOI 10.24412/2311-6447-2024-3-112-117
Исследование экзополисахаридного потенциала штаммов пробиотических микроорганизмов
Investigation of exopolysaccharide potential of probiotic
microorganism strains
Доцент Е.А. Пожидаева, профессор Е.С. Попов, студент М.С. Гребенникова, аспирант Я.А. Дымовских, ст. преподаватель О.А. Соколова, студент Ю.В. Дурова Воронежский государственный университет инженерных технологий, кафедра технологии продуктов животного происхождения, тел. +7(920)468-15-31 e_s_popov@mail. ru
Associate Professor E.A. Pozhidayeva, Professor E.S. Popov, Student M.S. Greben-nikova, Graduate student Ya.A. Dymovsky, Senior teacher O.A. Sokolova, Student Yu.V. Durova
Voronezh state university of engineering technologies, chair of technology of animal products, tel. +7(920)468-15-31 [email protected]
Аннотация. В настоящее время отмечается возрастание интереса к экзополисахаридам пробиотических микроорганизмов как эффективным биокорректорам и функциональным технологическим агентам, которые выступают в качестве эффективного альтернативного заменителя пищевых добавок, улучшающих потребительские свойства пищевых систем. Экзополисахариды повышают адгезионную активность пробиотических микроорганизмов на слизистых поверхностях желудочно-кишечного тракта, способствуют формированию антиканцерогенных, противовирусных и иммуномодулирующих свойств пробиотических продуктов. Проведены исследования активности синтеза экзополисахаридов различными штаммами пробиотических микроорганизмов Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, с микробным числом не ниже 109 КОЕ/мл. Ферментацию проводили при температуре в диапазоне 38-40 °С, с интервалом 1 ч. Контролировали активную кислотность среды до образования сгустка. Нормативное время ферментации, учитывающее кислотообразующие свойства штаммов пробиотических микроорганизмов, составляло 7-8 ч. Для определения количества вырабатываемых экзополисахаридов пробиоти-ческими микроорганизмами применялся фенол-серный метод, основанный на осаждении белков молока и отделении минеральных солей с последующим определением в полученном растворе оптической плотности с помощью фотометра КФК-3 при длине волны 490 нм. Установлены значения оптической плотности и концентрации экзополисахаридов биомасс штаммов пробиотических микроорганизмов, которые варьируются в диапазонах 467-612 А и 60,2-83,8 мкг/см3 соответственно. Величина активной кислотности в процессе ферментации снижалась в диапазоне 5,55-4,28 ед. рН. Концентрация активных клеток и выживаемость лиофилизированных клеток пробиотических микроорганизмов составила 8,38,9-108 КОЕ/мл и 88,3-90,6 для исследуемых штаммов пробиотических микроорганизмов. Полученные результаты позволяют констатировать наличие более выраженной экзополисахаридной активности у штамма Lactobacillus rhamnosus.
Abstract. Currently, there is an increasing interest in probiotic microorganism exopolysaccharides as effective biocorrectors and functional processing agents acting as an effective alternative to food additives that improve the consumer properties of food systems. Exopolysaccharides increase the adhesion activity of probiotic microorganisms on mucous surfaces of the gastrointestinal tract, contribute to the formation of anti-carcinogenic, antiviral and immunomodulatory properties of probiotic products. Experimental studies of the activity of exopolysaccharide synthesis by different strains of probiotic microorganisms Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, with a microbial count of not less than 109 CFU/ml were carried out. Fermentation was carried out at a temperature
© Е.А. Пожидаева, Е.С. Попов, М.С. Гребенникова, Я.А. Дымовских, О.А. Соколова, Ю.В. Дурова, 2024
УДК 664
in the range of 38-40 °С, the active acidity of the medium was monitored at intervals of 1 hour until clot formation. The standard fermentation time, taking into account the acid-forming properties of strains of pro-biotic microorganisms, was 7-8 hours. To determine the amount of exopolysaccharides produced by probiotic microorganisms, a phenol-sulfur method was used, based on the precipitation of milk proteins and the separation of mineral salts, followed by determining the absorbance in the resulting solution using a photometer KPK-3 at a wavelength of 490 nm. Values of optical density and concentration of biomass exopolysaccharides of strains of probiotic microorganisms, which vary in ranges 467-612 A and 60,2-83,8 mcg/cm3, respectively, were established. The value of active acidity during fermentation decreased in the range of 5,55-4,28 pH units. The concentration of active cells and the survival rate of lyophilized cells of probiotic microorganisms were 8,3-8,9-108 CFU/ml and 88,3-90,6 for the probiotic microorganism strains under study. Obtained results allow stating more pronounced exopolysaccharide activity in Lactobacillus rhamnosus strain.
Ключевые слова: экзополисахариды, оптическая плотность, биосинтез, штаммы, пробиотические микроорганизмы
Keywords: exopolysaccharides, optical density, biosynthesis, strains, probiotic microorganisms
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-26-00256.
Funding. The study was supported by a grant from the Russian Scientific Research Institute fund № 23-26-00256.
Роль и значение пищевых продуктов, содержащих пробиотики, для поддержания гомеостаза организма человека доказаны многочисленными работами [1, 5, 8]. Для увеличения сроков годности продуктов в пищевых технологиях применяют консерванты, загустители, антиоксиданты, стабилизаторы различного происхождения не всегда однозначно безопасные. Актуальность интереса к экзополисахаридной активности культур лакто- и бифидобактерий обусловлена тем, что им присвоен статус безопасности GRAS (Generallyrecognizedassafe), подтверждающий возможность рассматривать их в качестве ингредиентов безопасных пищевых продуктов.
Экзополисахаридам, синтезируемым пробиотическими микроорганизмами в процессе ферментации молочных или безмолочных систем, отводится важная физиологическая и технологическая роль. Данные продукты метаболизма могут выступать не только в качестве эффективного альтернативного заменителя пищевых добавок, улучшающего потребительские свойства продуктов, но ив качестве фактора, расширяющего спектр функциональных свойств, например, повышение адгезионной активности лакто- и бифидобактерий на слизистых поверхностях желудочно-кишечного тракта [1, 3, 8, 10, 12]. Имеются данные об антиканцерогенных, противовирусных, пребиотических, иммуномодулирующих и гипохолестеринемических свойствах экзополисахаридов [4, 6, 14].
Благодаря формированию экзополимерной капсулы у молочнокислых бактерий снижается вероятность лизиса клетки бактериофагами, возрастает устойчивость к агрессивным внешним факторам - кислотности, температуре, ультразвуку. Экзо-полисахариды являются естественными саморегуляторами биосистемы, выполняя барьерную функцию между клеткой и окружающей средой [2, 5, 9, 13]. Синтез экзо-полисахаридов способствует интенсификации ферментации молока, сокращению времени образования сгустка, улучшению реологических характеристик, биосинтезу самих бактерий и их метаболитов - аминокислот, короткоцепочечных жирных кислот, витаминов, ферментов [7, 11].
Цель исследования - изучение экзополисахаридного потенциала биомасс штаммов пробиотических микроорганизмов L. plantarum, L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus, L. fermentum, культивированных в диапазоне температур 0-42 С в концентрации не ниже 109 КОЕ/мл. Для проведения процесса синтеза биомассы пробио-тических микроорганизмов были исследованы штаммы пробиотических микроорганизмов L. plantarum, L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus, L. fermentum. Исследуемые заквасочные культуры характеризуются следующими показателями: массовая доля
влаги, % - не более 5,0; количество молочнокислых палочек в 1 г -не менее 7,0 млрд КОЕ; количество цитрат сбраживающих лактококков в 1 г -не менее 10,0 млрд КОЕ; дрожжи плесени в 1 г, бактерии группы кишечных палочек, патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, отсутствовали.
Ферментацию проводили при температуре в диапазоне 38-40 °С с интервалом 1 ч. Контролировали активную кислотность среды до образования сгустка. Нормативное время ферментации, учитывающее кислотообразующие свойства штаммов пробиотических микроорганизмов, составляло 7-8 ч. По окончании процесса концентрация пробиотических микроорганизмов составляла не менее 109 КОЕ/мл. В качестве питательного субстрата использовали молоко коровье обезжиренное ГОСТ Р 53503-2009.
Для определения количества вырабатываемых экзополисахаридов пробиотиче-скими микроорганизмами применяли фенол-серный метод. Данный метод основан на осаждении белков молока и отделении минеральных солей с последующим определением в полученном растворе оптической плотности с помощью фотометра КФК-3 при длине волны 490 нм.
Концентрацию клеток биомассы пробиотических микроорганизмов определяли путем высева на чашки Петри с плотной питательной средой и последующего подсчета колоний. Выживаемость клеток по истечении процесса вакуум-сублимационной сушки оценивали как процентное отношение содержания живых клеток в суспензии после лиофилизации к исходному их содержанию.
Содержание влаги в сублимированной биомассе пробиотических микроорганизмов определяли сушкой в печи при 102 °С. Содержание влаги анализировали путем определения разницы в массе до и после сушки, выраженной в процентах от первоначальной массы продукта. Показатели оптической плотности штаммов пробиотических микроорганизмов, А: Ь. /вттвпШт - 467,0; Ь. саввг - 489,0; Ь. р1аПаагит - 504,0; Ь. аайорЪйиз - 538,0; Ь. тИитповиз - 612,0.
По данным оптической плотности и концентрации раствора глюкозы получена калибровочная кривая, на основе которой проводили определение концентрации экзополисахаридов в растворе, что составило 60,2, 61,8, 65,5,70,4 и 83,8 мкг/см3 для биомассштаммов пробиотических микроорганизмов Ь. /вттвпШт, Ь. саввг, Ь. рШ^атит, Ь. асгйорНИиз, Ь. тНатповиз соответственно.
С целью изучения влияния штаммов пробиотических микроорганизмов на текстурные свойства конечного продукта были изучены величины активной кислотности (рН) до и после окончания процесса ферментации (табл. 1).
Таблица 1
Изменение активной кислотности в процессе ферментации
Наименование штамма Активная кислотность до Активная кислотность по оконча-
пробиотических процесса ферментации нии процесса ферментации (ед.
микроорганизмов (ед. рН) рН)
L. fermentum 5,55 4,41
L. casei 5,55 4,36
L. plantarum 5,52 4,35
L. acidophilus 5,53 4,32
L. rhamnosus 5,51 4,28
Установлено, что в процессе ферментации величина активной кислотности снижается в диапазоне 5,55-4,28 ед. рН, причем наиболее интенсивное снижение зафиксировано для штамма Ь. тНатповиз.
Особый интерес представляет получение сухой сублимированной биомассы пробиотических микроорганизмов с целью последующего применения в пищевых
114
технологиях. В связи с этим одним из направлений экспериментальных исследований являлось изучение выживаемости клеток пробиотических микроорганизмов, подвергнутых вакуум-сублимационной сушке, а также влажности полученной лиофили-зированной биомассы (табл. 2).
Таблица 2
Процентная выживаемость и влажность сублимированной биомассы __пробиотических микроорганизмов__
Наименование штамма пробиотических микроорганизмов Жизнеспособность перед вакуум-сублимационной сушкой, КОЕ/г Жизнеспособность после вакуум- сублимационной сушки, КОЕ/г Выживаемость, % Влажность, %
L. fermentum 9,2-109 8,4-108 88,3 4,62
L. casei 9,3-109 8,3-108 89,5 4,67
L. plantarum 9,4-109 8,6-108 89,8 4,42
L. acidophilus 9,3-109 8,7-108 90,2 4,34
L. rhamnosus 9,6-109 8,9-108 90,6 4,23
Установлено, что число активных клеток и выживаемость пробиотических микроорганизмов по окончании проведения процесса вакуум-сублимационной сушки составила 8,3-8,9'108 КОЕ/мл и 88,3-90,6 для исследуемых штаммов. Влажность опытных образцов варьировалась в диапазоне 4,23-4,62 %.
В процессе исследований выявлены величины оптической плотности и концентрации экзополисахаридов в диапазонах 467-612 А и 60,2-83,8 мкг/см3 для исследуемых штаммов пробиотических микроорганизмов L. fermentum, L. casei, L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus. Более ярко выраженную способность к синтезу экзополисахаридов проявил штамм L. rhamnosus. Установлено, что величина активной кислотности в процессе ферментации снижается в диапазоне 5,55-4,28 ед. рН. Концентрация активных клеток и выживаемость лиофилизированных клеток пробиотических микроорганизмов составила 8,3-8,9'108 и 88,3-90,6, что также свидетельствует о повышенном синтезе экзополисахаридов штаммом L. rhamnosus.
ЛИТЕРАТУРА
1. Andrew, M., Jayaraman G. Structural features of microbial exopolysaccharides in relation to their antioxidant activity // Carbohydrate Research. - 2020. - Vol. 2.
- рр. 68-73.
2. Lynch, K., Zannini E, Coffey A, Arendt E. Lactic acid bacteria exopolysaccharides in foods and beverages: isolation, properties, characterization, and health benefits // Annual Review of Food Science Technology. - 2018. - Vol. 4.
- рр. 47-53.
3. Пожидаева, Е.А. Влияние температурных режимов процесса культивирования на синтез экзополисахаридов консорциумом пробиотических микроорганизмов / Е.А.Пожидаева, Е.С. Попов, Я.А. Дымовских// Молочная промышленность. - 2023.
- № 6. - С. 67-70.
4. Abdalla, A.K., Ayyash M.M., Olaimat A.N. et al. Exopolysaccharides as antimicrobial agents: Mechanism and spectrum of activity Frontiers in Microbiology // Carbohydrate Research. - 2021. - Vol. - рр. 50-63.
5. Hussain, A., Zia K.M., Tabasum S. et al. Blends and composites of exopolysaccharides; properties and applications: a review // International Journal of Biological Mac-romolecules. - 2017. - Vol. 7. - рр. 24-30.
6. Zhou, Y., Cui Y., Qu X. Exopolysaccharides of lactic acid bacteria: structure, bioactivity and associations: a review // Carbohydrate Polymers. - 2019. - Vol. 8.
- рр. 70-73.
7. Пожидаева, Е.А. Разработка пробиотических пищевых комплексов с повышенным синтезом экзополисахаридов / Е.А. Пожидаева, Я.А. Дымовских, М.С. Гребенникова// Пищевая промышленность. - 2023.-№ 5. - С. 13-15.
8. Chen, Y.C., Wu Y.J., Hu C.Y. Monosaccharide composition influence and immunomodulatory effects of probiotic exopolysaccharides // International Journal of Biological Macromolecules. - 2019. - Vol. 9. - рр. 12-20.
9. Tang W., Dong M., Wang W. et al. Structural characterization and antioxidant property of released exopolysaccharides from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus SRFM-1 // Carbohydrate Polymers. - 2017. - Vol. 4. - рр. 10-15.
10. Di, W., Zhang L., Yi H. et al. Exopolysaccharides produced by Lactobacillus strains suppress HT-29 cell growth via induction of G0/G1 cell cycle arrest and apoptosis // Oncology Letters. - 2018. -Vol. 12. - рр. 2-10.
11. Barros, C.P., Guimaraes J.T., Esmerino E.A. et al Paraprobiotics and postbiot-ics: Concepts and potential applications in dairy products // Current Opinion in Food Science. - 2020. - Vol. 1. - рр. 9-16.
12. Angelin J., Kavitha M. Exopolysaccharides from probiotic bacteria and their health potential // International Journal of Biological Macromolecules. - 2020. -Vol. 3.
- рр. 13-19.
13. Rajoka, M. R., Wu Y., Mehwish H. M. et al. Lactobacillus exopolysaccharides: new perspectives on engineering strategies, physiochemical functions, and immunomodulatory effects on host health / Trends in Food Science and Technology. - 2020. - Vol. 1.
- рр. 80-89.
14. Daba, G. M., Elnahas M. O., Elkhateeb W. A. Contributions of exopolysaccha-rides from lactic acid bacteria as biotechnological tools in food, pharmaceutical, and medical applications // International Journal of Biological Macromolecules. - 2021. -Vol. 11. - рр. 90-100.
REFERENCES
1. Andrew, M., Jayaraman G. Structural features of microbial exopolysaccharides in relation to their antioxidant activity // Carbohydrate Research. -2020. - Vol. 2.
- рр. 68-73
2. Lynch, K., Zannini E, Coffey A, Arendt E. Lactic acid bacteria exopolysaccharides in foods and beverages: isolation, properties, characterization, and health benefits // Annual Review of Food Science Technology. - 2018. - Vol. 4.
- рр. 47-53.
3. Pozhidaeva, E.A., Popov E.S., Dymovskih Yа. A. Vliyanie temperaturnyh rezhimov processa kul'tivirovaniya na sintez ekzopolisaharidov konsorciumom probiotich-eskih mikroorganizmov [Influence of the temperature regimes of the cultivation process on the synthesis of exopolysaccharides by a consortium of probiotic microorganisms] Mo-lochnaya promyshlennost'. - 2023. - № 6. - рр. 67-70.
4. Abdalla, A.K., Ayyash M.M., Olaimat A.N. et al. Exopolysaccharides as antimicrobial agents: Mechanism and spectrum of activity Frontiers in Microbiology // Carbohydrate Research. - 2021. - Vol. - рр. 50-63.
5. Hussain, A., Zia K.M., Tabasum S. et al. Blends and composites of exopolysaccharides; properties and applications: a review // International Journal of Biological Macromolecules. - 2017. - Vol. 7. - рр. 24-30.
6. Zhou, Y., Cui Y., Qu X. Exopolysaccharides of lactic acid bacteria: structure, bioactivity and associations: a review // Carbohydrate Polymers. - 2019. - Vol. 8.
- рр. 70-73.
7. Pozhidaeva, E.A., Dymovskih YA.A., Grebennikova M.S. Razrabotka probiotich-eskih pishchevyh kompleksov s povyshennym sintezom ekzopolisaharidov [Development of probiotic food complexes with increased synthesis of exopolysaccharides] Pishchevaya promyshlennost'. - 2023. - № 5. - рр. 13-15.
8. Chen, Y.C., Wu Y.J., Hu C.Y. Monosaccharide composition influence and immunomodulatory effects of probiotic exopolysaccharides // International Journal of Biological Macromolecules. - 2019. - Vol. 9. - рр. 12-20.
9. Tang, W., Dong M., Wang W. et al. Structural characterization and antioxidant property of released exopolysaccharides from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus SRFM-1 // Carbohydrate Polymers. - 2017. -Vol. 4. - рр. 10-15.
10. Di, W., Zhang L., Yi H. et al. Exopolysaccharides produced by Lactobacillus strains suppress HT-29 cell growth via induction of G0/G1 cell cycle arrest and apoptosis // Oncology Letters. - 2018. - Vol. 12. - рр. 2-10.
11. Barros, C.P., Guimaraes J.T., Esmerino E.A. et al Paraprobiotics and postbiot-ics: Concepts and potential applications in dairy products // Current Opinion in Food Science. - 2020. - Vol. 1. - рр. 9-16.
12. Angelin, J., Kavitha M. Exopolysaccharides from probiotic bacteria and their health potential // International Journal of Biological Macromolecules. - 2020. - Vol. 3.
- рр. 13-19.
13. Rajoka, M. R., Wu Y., Mehwish H. M. et al. Lactobacillus exopolysaccharides: new perspectives on engineering strategies, physiochemical functions, and immunomod-ulatory effects on host health / / Trends in Food Science and Technology.
- 2020. - Vol. 1. - рр. 80-89.
14. Daba, G. M., Elnahas M. O., Elkhateeb W. A. Contributions of exopolysaccha-rides from lactic acid bacteria as biotechnological tools in food, pharmaceutical, and medical applications / / International Journal of Biological Macromolecules. -2021. - Vol. 11.
- рр. 90-100.
