CC BY
5
DOI 10.24412/2311-6447-2023-3-48-53
Исследование экзополисахаридной активности консорциума пробиотических микроорганизмов с применением дифференциально-термического анализа
Study of exopolysaccharide activity of a consortium of probiotic microorganisms using differential thermal analysis
Доцент Е.А. Пожидаева, доцент Е.С. Попов, аспирант Я.А. Дымовских, студент М.С. Гребенникова, студент В.С. Субботина, студент Ю.В. Дурова
Воронежский государственный университет инженерных технологий, кафедра технологии продуктов животного происхождения, тел. +7(920)468-15-31, e s [email protected]
Associate Professor E.A. Pozhidaeva, Associate Professor E.S. Popov, Graduate Student Y.A. Dymovskikh, Student M.S. Grebennikovа, Student V.S. Subbotina, Student Yu.V. Durova
Voronezh State University of Engineering Technologies, chair of Technology of Animal Products, tel. +7(920)468-15-31, e s [email protected]
Аннотация. Метаболиты пробиотических микроорганизмов являются эффективными биокорректорами и функционально-технологическими агентами, увеличивающими адгезию лакто- и бифидо-бактерий на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, способствующими улучшению функционально-технологических свойств пищевых систем, в том числе влагосвязывающей и влагоудерживаю-щей способности. Проведены экспериментальные исследования активности синтеза экзополисахари-дов консорциумом пробиотических микроорганизмов на основе Str. thermophiles, B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. breve, L. acidophilus, L. plantarum, L. fermentum. Изучены температурные режимы культивирования на основе комбинирования этапов оптимальных и неоптимальных условий для развития микроорганизмов, соответствующих варьированию температуры в диапазоне более высоких или менее низких значений. На основе данных термического анализа опытных образцов биомасс консорциумов пробиотических микроорганизмов, полученных при различных режимах ферментирования, установлен температурный диапазон равный 92-116 oC, при котором зафиксированы эндотермические эффекты, что свидетельствует о дополнительном возрастании степени связывания влаги полисахаридами пробиотического происхождения. Остаточная масса опытных образцов варьировалась в диапазоне 13,65-14,84 %. Массовая доля удаляемой физико-химически связанной влаги составила 9,48-11,39 %, что также подтверждает присутствие в пробиотических системах микробных метаболитов. Установлено, что максимальная активность синтеза влагосвязывающих метаболитов соответствует двухстадийному режиму ферментации в следующей последовательности температурных воздействий: 30-32 оС (4-5 ч), 38 - 42 оС (4-5 ч) с последующим охлаждением до 4-6 оС.
Abstract. Metabolites of probiotic microorganisms are effective biocorrectors and functional and technological agents that increase the adhesion of lacto and bifidobacteria on the mucous membrane of the gastrointestinal tract, contributing to the improvement of the functional and technological properties of food systems, including moisture-binding and water-retaining abilities. Experimental studies of the activity of synthesis of exopolysaccharides by a consortium of probiotic microorganisms based on Str. thermophiles, B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. breve, L. acidophilus, L. plantarum, L. fermentum. Temperature modes of cultivation have been studied on the basis of combining the steps of optimal and suboptimal conditions for the development of microorganisms corresponding to temperature variation in the range of higher or lower values. Based on the data of thermal analysis of prototypes of biomass consortia of probiotic microorganisms obtained under various fermentation modes, a temperature range of 92-116 °C was established, at which endothermic effects were recorded, which indicates an additional increase in the degree of moisture binding with polysaccharides of probiotic origin. The residual mass of the prototypes ranged from 13,65 % to 14,84 %. The mass fraction of the removed physicochemically bound moisture was 9,48-11,39 %, which also confirms the presence of microbial metabolites in probiotic systems. It was established that the maximum activity of the synthesis of moisture-binding metabolites corresponds to a two-step fermentation regime in the following sequence of temperature effects: 30-32 oC (4-5 hours), 38-42 oC (4- 5 hours), followed by cooling to 4-6 oC.
© Е.А. Пожидаева, Е.С. Попов, Я.А. Дымовских, М.С. Гребенникова, В.С. Субботина, Ю.В. Дурова, 2023
Ключевые слова: пробиотические микроорганизмы, микробные метаболиты, полисахарида:, формы связи влаги
Keywords: probiotic microorganisms, microbial metabolites, polysaccharides, moisture binding forms
Финансирование: исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-26-00256, https://rscf.ru/project/23-26-00256.
С развитием концепций здорового питания повышенное внимание мировых научных сообществ сосредоточено на возможностях обогащения пищевых продуктов биологически активными агентами и соединениями, в частности продуктами метаболизма пробиотических микроорганизмов, с целью получения новых функциональных пищевых систем [1-4]. Пищевые системы, содержащие молочнокислые и пробиотические микроорганизмы, а также продукты их метаболизма, белкового и полисахаридного происхождения, находят эффективное применение в различных областях медицины. Известно, что экзополисахариды повышают адгезионную активность лакто-и бифидобактерий на слизистых поверхностях желудочно-кишечного тракта, способствуют формированию антиканцерогенных, противовирусных и иммуномодулирующих свойств пробиотических продуктов [5-8]. Установлено, что синтез влагосвязывающих метаболитов пробиотиками активируется при неблагоприятных условиях для роста биомассы [9].
Цель экспериментальных исследований - изучение влияния комбинированных температурных режимов культивирования консорциума лакто - и бифидобактерий на интенсивность биосинтеза полисахаридов на основе оценки содержания связанной влаги с применением дифференциально-термического анализа.
Объектом исследований являлся консорциум лакто-и бифидобактерий Str. ther-mophiles, B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. breve, L. acidophilus, L. plantarum, L. fermentum, представляющий собой закваску прямого внесения со сле-дующими показателями: массовая доля влаги - не более 5,0 %; количество молочно-кислых бактерий (КОЕ) в 1 г не менее 5,0 млрд; количество термофильных стреп-тококков в 1 г не менее 1,0 млн; цитратсбраживающих лактококков в 1 г, не менее 3,0 млрд; бифидобактерий, в 1 г не менее 3,0 млрд; дрожжей и плесеней в 1 г не более 5,0. Патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы), бактерии группы кишечных палочек -отсутствовали.
Активизированную в течение 2 ч закваску вносили в питательную среду - молоко коровье нормализованное. Культивирование проводили при следующих режимных параметрах: 1 - температура t=47±2 оС, продолжительность 4-5 ч, охлаждение до t=40±2 оС с выдержкой в течение 4-5 ч, с последующим охлаждением до t=4±2 о С; 2 - t=32±2 оС, продолжительность 4-5 ч, подогрев до t=40±2 оС, продолжительность выдержки 4-5 ч, с последующим охлаждением до t=4±2 оС; 3 - t=40±2 оС (контроль), продолжительность 8-10 ч, с последующим охлаждением до t=4±2 оС. В ходе культивирования контролировали титруемую кислотность среды и рН, процесс осуществляли до замедления роста значений титруемой кислотности.
Концентрацию клеток биомассы пробиотических микроорганизмов определяли путем высева на чашки Петри с плотной питательной средой и последующего подсчета колоний.
Изучение форм связанной влаги в пробиотических системах проводили методом дифференциально-термического анализа с помощью прибора синхронного термического анализа модели STA 449 F3 Jupiter, обеспечивающего фиксацию физико -химических и структурных преобразований в продукте в результате управляемого воздействия высокой температурой [10]. Данный метод позволяет контролировать изменение массы исследуемого образца при нагреве или охлаждении в диапазоне температур, соответствующих фазовым превращениям влаги в образце.
;в производили в диапазоне температур 30-146 К, скорость нагрева составляла 5 0С/мин, использовали тигли из оксидированного алюминия, среда - газообразный азот, класс 5, расход продувочного газа - 40 мл/мин.
В табл. 1 приведены численные значения интервалов температуры, в которых зафиксированы фазовые превращения, энтальпии и изменения массы опытных и контрольного образцов, характеризующие выявленные в процессе термолиза тепловые эффекты.
Таблица 1
Тепловые эффекты термолиза опытных образцов биомасс консорциумов иро-биотических микроорганизмов, полученных при различных режимах культивиро-вания
Режим культивирования Температурный интервал, ЭТ, 0С Энтальпия, Дж/ кг Изменение массы образца, %
1 30-131 1,821 86,35
2 30-146 1,724 85,16
3 (контроль) 30-122 1,886 87,64
В результате термического анализа опытных образцов биомасс консорциумов пробиотических микроорганизмов установлены соответствующие эндотермические эффекты, соответствующие величине установленного диапазона температуры. По возрастанию величины температурного диапазона опытные образцы распределяются следующим образом: № 3 (контроль (92 0С), № 1 (101 0С), № 2 (116 0С), что объясняется процессом связывания влаги экзополисахаридами, синтезируемыми про-биотическими микроорганизмами. Применение термического воздействия привело к изменению массы навесок исследуемых образцов, остаточная масса составила: № 1 - 13,65 %, № 2 - 14,84 % № 3 (контроль) - 12,36 %. Наибольшая степень связанности влаги отмечается для режима культивирования № 2, наименьшая - для режима № 3.
Выявлено, что синтез влагосвязывающих метаболитов активизируется в условиях второго и третьего режимов культивирования, соответствующих отклонению температуры от оптимальной в область более высоких или низких значений.
В результате обработки экспериментальных данных по изменению массы в процессе дегидратации образцов при указанных выше температурах построены функции а (степень превращения вещества, мг/мг) от Т (температура образца, 0С) (рис. 1). Степень превращения вещества (а) вычисляли по отношению текущего изменения массы О в момент времени I к общему изменению массы О Шшах.
30 50 70 90 110 130 150
Температура Т, "С
Рис. 1. Графическая зависимость величины а (мг/мг) от температуры Т (0С ) для опытных образцов (1-3)
Полученные зависимости а=/(Т) имеют Я-образный вид, соответствующий сложному процессу дегидратации образцов, при которых последовательно высвобождаются фракции свободной, физически, физико-химически и химически связанной влаги.
Аппроксимация полученных кривых позволяет получить трехлинейные сплайны. Выделенные участки свидетельствуют о ступенчатом удалении влаги, в соответствии с формами ее связи с биополимерами экспериментальных образцов (рис. 2). Зависимость -1да=/(103/Т) позволяют идентифицировать три фазы дегидратации опытных и контрольного образцов: 1 фаза процесса - участки АВ - нагрев и удаление свободной влаги; 2 фаза - участки ВС - удаление адсорбционно и осмо-тически связанной влаги, частичное разложение продукта; 3 фаза процесса дегид-ратации -участки - разложение продукта, выделение газообразных продуктов термического разложения и удаление физико-химически связанной влаги.
2 1,8 1,6 1,4 1.2 я I
0,8 0,6 0,4 0,2
2,35
103/Т
Рис. 2. Графическая зависимость -1да=Д103/Т) при скорости нагрева среды 5 0С/мин для опытных образцов (1 -3)
Установлено, что в диапазоне температур 25-30 0С происходит нагрев образцов и удаление свободной влаги, находящейся в ячейках казеин-полисахаридных гелей. Интервал температур 31-70 0С соответствует протеканию процесса разрушения связей типа «вода-вода», количество удаляемой влаги составило 12,92, 12,25, 14,69 % в образцах № 1-3 соответственно. Диапазон температур 71-105 0С относится к интервалу удаления механически связанной, в том числе капиллярной и адсорбционной влаги, массовая доля удаляемой влаги составила 63,91 %, 63,75 %, 64,82 % для исследуемых образцов № 1-3. В диапазоне температур 106-146 0С происходит удаление физико-химически связанной влаги. Сравнение числовых значений характеристик изменения массы в этом диапазоне температур подтверждает увеличение в ферментированных образцах количества химически связанной влаги. Массовая доля удаляемой влаги составила 9,48 %, 11,39 % и 6,92 % для образцов № 1-3 соответственно. На основе полученных экспериментальных данных установлено, что опытные образцы № 1, 2 содержат в 1,36-1,64 раза больше связанной влаги по сравнению с контролем № 3, что обусловлено синтезом микробных метаболитов опытными образцами.
Результаты экспериментальных исследований позволяют сделать вывод, что применяемые режимы культивирования опытных образцов консорциума пробиоти-ческих микроорганизмов позволяют достичь требуемого микробного числа на уровне не менее 108КОЕ/г.
аким образом, применение метода дифференциально-термического анализа позволило провести количественную оценку содержания различных форм связанной влаги в экспериментальных образцах. Установлен температурный диапазон, составляющий 92 - 116 0С, при котором зафиксированы эндотермические эффекты в образцах биомасс консорциумов № 1-3, что свидетельствует о дополнительном возрастании степени связывания влаги полисахаридами пробиотического происхождения. Остаточная масса опытных образцов варьировалась в диапазоне 13,65 -14,84 %. Массовая доля удаляемой физико-химически связанной влаги составила 9,48-11,39 %, что является подтверждением присутствия в пробиотических системах микробных метаболитов. Концентрация пробиотических микроорганизмов в опытных образцах составляла не менее 108 КОЕ/г. Подтверждена перспективность применения двухступенчатого режима культивирования консорциума пробиотиче-ских микроорганизмов, обеспечивающего максимальный синтез метаболитов, в следующей последовательности температурных воздействий: 30-32 оС (4-5 ч), 38-42 оС (4-5 ч) с последующим охлаждением до 4-6 оС. Полученные результаты позволяют констатировать наличие экзополисахаридной активности у исследуемого консорциума пробиотических микроорганизмов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Korcz E., Varga L. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: techno-func-tional application in the food industry // Trends in Food Science and Technology.-2021. -Vol. 110.-P. 375-384.
2. Papadimitriou K., Alegia A., Bron P. Stress physiology of lactic acid bacteria // Microbiology and Molecular Biology Reviews.-2016.-Vol. 80(3).-P. 837-890.
3. Zhang, X., Jiang, X., Hao, Z., Qu, K. Advances in online methods for monitoring microbial growth // Biosensors and Bioelectronics.-2019.-Vol. 126.-P. 433-447.
4. Amiri S., Rezaei R., Mokarram M. Exopolysaccharides production by lactobacil-lus acidophilus LA5 and bifidobacterium animalis subsp. lactis BB 12: optimization of fermentation variables and characterization of structure and bioactivities // International journal of biological macromolecules.-2019.-Vol. 123.-P. 752-765.
5. Palanivelu J., Thanigaivel S., Vickram S. Probiotics in functional foods: Survival assessment and approaches for improved viability //Applied Sciences.-2022.-Vol. 12(1).-P. 1-13.
6. Terpou A., Papadaki A., Lappa I.K. Probiotics in food systems: significance and emerging strategies towards improved viability and delivery of enhanced beneficial value // Nutrients.-2019.-Vol. 11.- P. 1591.
7. Majee S.B., Avlani D., Biswas G.R. Rheological behavior and pharmaceutical applications of bacterial exopolysaccharides // Journal of Applied Pharmaceutical Sci-ence.-2017.-Vol. 7(9).-P. 224-232.
8. Silva L.A., Lopes Neto J.H.P., Cardarelli H.R. Exopolysaccharides produced by Lactobacillus plantarum: technological properties, biological activity, and potential application in the food industry // Annals of Microbiology. -2019.-Vol. 69.-P. 321-328.
9.Пожидаева Е.А., Дымовских Я.А., Гребенникова М.С. Разработка пробиотических пищевых комплексов с повышенным синтезом экзополисахаридов // Пищевая промышленность. - 2023. - № 5. - С. 13-15.
10. Родионова Н.С., Попов Е.С., Родионов А.А., Разинкова Т.А. Дифференциально-термический анализ в оценке экзополисахаридной активности консорциумов пробиотических микроорганизмов // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2018. - Т. 8. - № 4(27). - С. 95-105.
REFERENCES
1. Korcz E., Varga L. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: techno-func-tiona! application in the food industry // Trends in Food Science and Technology.-2021. -Vol. 110.-P. 375-384.
2. Papadimitriou K., Alegia A., Bron P. Stress physiology of lactic acid bacteria // Microbiology and Molecular Biology Reviews.-2016.-Vol. 80(3).-P. 837-890.
3. Zhang, X., Jiang, X., Hao, Z., Qu, K. Advances in online methods for monitor-ing microbial growth // Biosensors and Bioelectronics.-2019.-Vol. 126.-P. 433-447.
4. Amiri S., Rezaei R., Mokarram M. Exopolysaccharides production by lactobacil-lus acidophilus LA5 and bifidobacterium animalis subsp. lactis BB 12: optimization of fermentation variables and characterization of structure and bioactivities // International journal of biological macromolecules.-2019.-Vol. 123.-P. 752-765.
5. Palanivelu J., Thanigaivel S., Vickram S. Probiotics in functional foods: Survival assessment and approaches for improved viability //Applied Sciences.-2022.-Vol. 12(1).-P. 1-13.
6. Terpou A., Papadaki A., Lappa I.K. Probiotics in food systems: significance and emerging strategies towards improved viability and delivery of enhanced beneficial value // Nutrients.-2019.-Vol. 11.- P. 1591.
7. Majee S.B., Avlani D., Biswas G.R. Rheological behavior and pharmaceutical applications of bacterial exopolysaccharides // Journal of Applied Pharmaceutical Sci-ence.-2017.-Vol. 7(9).-P. 224-232.
8. Silva L.A., Lopes Neto J.H.P., Cardarelli H.R. Exopolysaccharides produced by Lactobacillus plantarum: technological properties, biological activity, and potential application in the food industry // Annals of Microbiology. -2019.-Vol. 69.-P. 321-328.
9. Pozhidaeva E.A., Dymovskikh Y.A., Grebennikova M.S. Razrabotka probiotich-eskih pishchevyh kompleksov s povyshennym sintezom ekzopolisaharidov [Development of probiotic food complexes with increased synthesis of exopolysaccharides] / / Pishchevaya promyshlennost'. - 2023., No 5, pp. 13-15 (Russian).
10. Rodionova N.S., Popov E.S., Rodionov A.A., Razinkova T.A. Differencial'no-termicheskij analiz v ocenke ekzopolisaharidnoj aktivnosti konsorciumov probiotich-eskih mikroorganizmov [Differential thermal analysis in evaluation of exopolysaccharide activity of probiotic microorganism consortia] // Izvestiya vuzov. Prikladnaya himiya i biotekhnologiya. 2018, Vol. 8, No 4(27), pp. 95-105 (Russian).
