CC BY
12
© Коллектив авторов, 2023
Атауллаханов Р.И.1, Ушакова Е.И.1, Пичугин А.В.1, Лебедева Е.С.1, Иванов С.В.2, Ожаровская Т.А.3, Попова О.3, Щербинин Д.Н.3, Банделюк А.С.3, Зубкова О.В.3, Шмаров М.М.3, Логунов Д.Ю.3, Народицкий Б.С.3, Гинцбург А.Л.3
Исследование антигенной специфичности Т-клеточных иммунных реакций в ответ на иммунизацию лабораторных мышей рекомбинантным аденовирусным вектором, кодирующим Spike-белок SARS-CoV-2
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук, Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Рекомбинантные аденовирусные векторы являются одной из ведущих технологических платформ при разработке и производстве современных вакцин. В России и в других странах мира на базе рекомбинантных аденовирусов созданы и зарегистрированы вакцинные препараты против вируса лихорадки Эбола и коронавирусной инфекции SARS-CoV-2. Проводятся клинические испытания вакцин против гриппа, вируса Мар-бург, вирусов папилломы человека.
Закодированный в ДНК аденовирусного вектора целевой антиген экспрессируется в организме вакцинированного и против этого целевого белка-антигена развиваются адаптивные иммунные реакции. Векторная частица является вирусной и содержит в себе десятки вирусных антигенов. Следовательно, наряду с иммунными реакциями на целевой антиген в организме вакцинированного могут развиваться иммунные реакции на антигены самого вектора.
Цель данной работы - исследовать, как соотносятся между собой по интенсивности и качеству две разнонаправленные по антигенной специфичности иммунные реакции: против целевого антигена коронавируса и антигенов аденовирусного вектора.
Материал и методы. У мышей C57BL/6 исследовали интенсивность иммунных реакций CD4- и СБ8-Т-клеток в ответ на иммунизацию рекомбинантным аденовирусным вектором, кодирующим S-белок SARS-CoV-2 (Ad5-S). Через 2 и 3 мес после иммунизации в селезенке мышей определяли количество и антигенную специфичность CD4-и CD8-T-клеток памяти. Реакцию Т-клеток индуцировали in vitro в совместной культуре с антиген-презентирующими дендритными клетками. Очищенные популяции CD4-и CD8-T-клеток получали сортировкой на лазерном проточном сортировщике BD FACS Aria II. Антиген-презентирующие клетки трансдуцировали аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-белок коронавируса, или контрольным рекомбинантным аденовирусным вектором без целевой вставки (Ad5-0). Ответ Т-клеток определяли методом ELISPOT по числу клеток, секретирующих ИФН-у. В отдельных экспериментах для реактивации CD4-Т-клеток антиген-презентирующие дендритные клетки нагружали рекомбинантным RBD-фрагментом S-белка SARS-CoV-2. Для усиления ответа Т-клеток антиген-презентирующие дендритные клетки стимулировали агонистом TLR4.
Результаты. Установлено, что однократная интраназальная иммунизация вектором Ad5-S в дозе 108 БОЕ индуцирует сильные системные Т-клеточные иммунные реакции у мышей C57BL/6. Через 2 мес после иммунизации в селезенке мышей обнаруживается около 100-200 тыс. антиген-реактивных Т-клеток памяти, секретирующих ИФН-у при реактивации in vitro дендритными клетками, презентирующими целевой S-антиген SARS-CoV-2. Большинство антиген-реактивных CD8-T-клеток памяти специфично к S-антигену SARS-CoV-2. Содержание таких клеток после иммунизации вектором
Для корреспонденции
Атауллаханов Равшан Иноятович -доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии, заведующий лабораторией активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Шмаров Максим Михайлович -доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: mmshmarov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-5268-1296
Ad5-S превышает 1 % от всех СБ8-Т-клеток. Количество антиген-реактивных CD8-T-клеток памяти, специфичных к аденовирусным антигенам вектора, было приблизительно в 3 раза ниже, чем количество антиген-реактивных CD8-T-клеток памяти, специфичных к целевому S-антигену. Интенсивность иммунной реакции CD4-T-клеток на иммунизацию вектором Ad5-S была сравнима с интенсивностью иммунной реакции CD8-T-клеток. Подавляющее большинство антиген-реактивных CD4-T-клеток памяти было специфично к антигенам аденовирусного вектора. Эти CD4-Т-клетки секретировали ИФН-у в ответ на рестимуляцию in vitro дендритными клетками, трансдуцированными рекомби-нантным аденовирусным вектором Ad5-0 без целевой вставки. Число CD4-T-клеток, реагирующих на рестимуляцию дендритными клетками, нагруженными рекомбинантным RBD, было исчезающе малым.
Показана возможность повышения интенсивности ответа CD8-T-клеток, специфичных к целевому S-антигену, путем увеличения дозы вектора Ad5-S при трансдукции антиген-презентирующих дендритных клеток, а также путем использования TLR4-агониста для стимуляции антиген-презентирующих дендритных клеток.
Предложены возможные механизмы кооперативного взаимодействия CD8-T-клеток, специфичных к целевому S-антигену SARS-CoV-2, и CD4-T-клеток, специфичных к антигенам аденовирусного вектора. Рассматриваются возможные пути усиления ответа CD4-T-клеток на целевой S-антиген.
Заключение. Иммунизация рекомбинантным аденовирусным вектором, кодирующим S-антиген SARS-CoV-2, индуцирует сильные CD8- и CD4-T-клеточные иммунные реакции с формированием массивного пула антиген-реактивных Т-клеток памяти. CD8- и CD4-T-клетки, реагирующие на иммунизацию вектором Ad5-S, различаются своей специфичностью к антигенам. CD8-T-клетки памяти в основном специфичны к целевому S-антигену SARS-CoV-2, CD4-T-клетки памяти специфичны к антигенам аденовирусного вектора.
Ключевые слова: рекомбинантный аденовирусный вектор; S-антиген SARS-CoV-2; Т-клетки памяти; антигенная специфичность
Статья получена 01.08.2023. Принята в печать 08.09.2023.
Для цитирования: Атауллаханов Р.И., Ушакова Е.И., Пичугин А.В., Лебедева Е.С., Иванов С.В., Ожаров-ская Т.А., Попова О., Щербинин Д.Н., Банделюк А.С., Зубкова О.В., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Народиц-кий Б.С., Гинцбург А.Л. Исследование антигенной специфичности Т-клеточных иммунных реакций в ответ на иммунизацию лабораторных мышей рекомбинантным аденовирусным вектором, кодирующим Spike-белок SARS-CoV-2. Иммунология. 2023; 44 (5): 557-574. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-5-557-574
Финансирование. Исследование выполнено в рамках Государственного задания (Соглашение № 388-03-2021010 от 20.01.2021). Публикация результатов исследования в открытой печати разрешена.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Идея исследования - Атауллаханов Р. И., Народицкий Б. С., Гинцбург А. Л.; дизайн экспериментов - Атауллаханов Р.И., Ушакова Е.И., Пичугин А.В., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л.; дизайн ДНК-конструкта, получение и очистка рекомбинантного RBD-фрагмента S-белка корона-вируса - Иванов С.В.; получение генетических конструкций, несущих гены коронавируса в составе генома аденовирусного вектора - Ожаровская Т. А.; очистка и титрование рекомбинантных аденовирусных векторов -Щербинин Д.Н.; культивирование клеток человека линии 293 и наращивание рекомбинантных аденовирусных векторов - Попова О.; дизайн рекомбинантных аденовирусных векторов, несущих гены коронавируса в составе генома аденовирусного вектора - Зубкова О.В.; иммунизация животных, отбор образцов органов и тканей - Банделюк А.С.; цитометрия и сортировка клеток - Пичугин А.В.; ELISPOT - Ушакова Е.И.; анализ результатов - Атауллаханов Р.И., Ушакова Е.И., Пичугин А.В., Лебедева Е.С., Шмаров М.М.; статистическая обработка и техническое оформление статьи - Ушакова Е.И.; концепция статьи - Атауллаханов Р.И.; написание статьи - Атауллаханов Р.И., Ушакова Е.И., Лебедева Е.С.
Ataullakhanov R.I.1, Ushakova E.I.1, Pichugin A.V.1, Lebedeva E.S.1, Ivanov S.V.2, Ozharovskaia T.A.3, Popova O.3, Shcherbinin D.N.3, Bandelyuk A.S.3, Zubkova O.V.3, Shmarov M.M.3, Logunov D.Yu.3, Naroditsky B.S.3, Gintsburg A.L.3
Study of the antigenic specificity of T-cell immune reactions in response to immunization of laboratory mice with a recombinant adenoviral vector encoding the Spike-protein of SARS-CoV-2
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, Ministry of Science and High Education of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
3 Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Recombinant adenoviral vectors become the leading technological platform in the development and production of modern vaccines. In Russia and other countries of the world, vaccines based on recombinant adenoviruses have been designed and registered against the Ebola virus and SARS-CoV-2 coronavirus infections. Clinical trials of vaccines against influenza, Marburg virus, human papillomaviruses are ongoing. The target antigen encoded in the DNA of the adenoviral vector is expressed in the body of the vaccine recipient, and adaptive immune responses develop against this target antigen protein. The vector particle is viral and contains dozens of viral antigens. Therefore, along with immune responses to the encoded target antigen, immune responses to the antigens of the vector itself can develop in the body of the vaccinated.
The aim of this work is to investigate the intensity and quality of two immune responses that are different in their antigenic specificity, i.e. directed against the target coronavirus antigen and adenovirus vector antigens.
Material and methods. In C57BL/6 mice, the intensity of immune responses of CD4 and CD8 T cells was studied in response to immunization with a recombinant adenoviral vector encoding the SARS-CoV-2 S-protein (Ad5-S). 2 and 3 months after immunization, the number and antigenic specificity of CD4 and CD8 T memory cells were determined in the spleen of mice. The T cell response was induced in vitro in co-culture with antigen-presenting dendritic cells. Purified CD4 and CD8 T cell populations were obtained by sorting on a BD FACS Aria II laser flow sorter machine. Antigen-presenting cells were transduced with the Ad5-S adenoviral vector encoding the SARS-CoV-2 S-protein or a control recombinant adenoviral vector without a target insert (Ad5-0). The T cells response was determined by ELISPOT according to the number of cells secreting IFN-y. In some experiments, to reactivate CD4 T cells, antigen-presenting dendritic cells were loaded with a recombinant RBD-fragment of the SARS-CoV-2 S-protein. To enhance the T cell response, antigen presenting dendritic cells were stimulated with a TLR4 agonist.
Results. A single intranasal immunization with the Ad5-S vector at a dose of 108 PFU induced strong systemic T-cell immune responses in C57BL/6 mice. Two months after immunization, about 100-200 thousand antigen-reactive memory T-cells were found in the spleen of mice, secreting IFN-y when reactivated in vitro by dendritic cells presenting the target SARS-CoV-2 S-antigen. Most antigen-reactive CD8-T memory cells were specific for the SARS-CoV-2 S-antigen. The contents of such cells after immunization with the Ad5-S vector exceeds 1 % of all CD8-T cells. The number of antigen-reactive CD8-T memory cells specific to the adenoviral antigens of the vector was approximately 3-fold lower than the number of antigen-reactive CD8-T memory cells specific to the target S-antigen. The intensity of the immune response of CD4-T cells to immunization with the Ad5-S vector was comparable to the intensity of the immune response of CD8-T cells. The vast majority of antigen-reactive CD4-T memory cells were specific for adenovirus vector antigens. These CD4-T cells secreted IFN-y in response to in vitro restimulation by dendritic cells transduced with the recombinant adenoviral Ad5-0 vector without a targeted insert. The number of CD4-T cells responding to restimulation by dendritic cells loaded with recombinant RBD was vanishingly small.
An intensity of the response of CD8-T cells specific to the target S-antigen can be increased by elevating of the Ad5-S vector dose during transduction of antigen-presenting dendritic cells, as well as by stimulation of antigen-presenting dendritic cells with a TLR4 agonist.
Possible mechanisms of cooperative interaction between CD8-T cells specific for the target coronavirus S-antigen and CD4-T cells specific for adenovirus vector antigens have been proposed. Possible ways to enhance the response of CD4-T cells to the target S-antigen are considered.
Conclusion. Immunization with a recombinant adenoviral vector encoding the coronavirus S-antigen induces strong CD8- and CD4-T cell immune responses with the formation of a mas-
For correspondence
Ravshan I. Ataullakhanov -MD, PhD, Professor, Head of the Immune Biotechnology Dept., Head of the Immunity Activation Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Maksim M. Shmarov -Dr.Sci., PhD, Head of the Molecular Biotechnology Lab., N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mmshmarov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-5268-1296
sive pool of antigen-reactive memory T cells. CD8- and CD4-T cells responding to immunization with the Ad5-S vector differ in their antigen specificity. Memory CD8-T cells are generally specific for the target coronavirus S-antigen. Memory CD4-T cells are specific to adenovirus vector antigens.
Keywords: recombinant adenoviral vector; coronavirus S-antigen; memory T-cells; antigen specificity
Received 01.08.2023. Accepted 08.09.2023.
For citation: Ataullakhanov R.I., Ushakova E.I., Pichugin A.V., Lebedeva E.S., Ivanov S.V., Ozharovskaia T.A., Popova O., Shcherbinin D.N., Bandelyuk A.S., Zubkova O.V., Shmarov M.M., Logunov D.Yu., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Study of the antigenic specificity of T-cell immune reactions in response to immunization of laboratory mice with a recombinant adenoviral vector encoding the Spike-protein of SARS-CoV-2. Immunologiya. 2023; 44 (5): 557-74. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-5-557-574 (in Russian)
Funding. The study was supported by State assignment (Agreement No. 388-03-2021-010 of 01/20/2021). Open publication of the research results is allowed.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Idea of the study - Ataullakhanov R.I., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L.; design of experiments - Ataullakhanov R.I., Ushakova E.I., Pichugin A.V., Shmarov M.M., Logunov D.Yu., Naroditsky B.S., Gints-burg A.L.; DNA construct design, production and purification of the recombinant RBD-fragment of the coronavirus S-protein - Ivanov S.V.; obtaining genetic constructs carrying coronavirus genes as part of the adenoviral vector genome -Ozharovskaia T.A.; purification and titration of recombinant adenoviral vectors - Shcherbinin D.N., cultivation of human cells line 293 and the growth of recombinant adenoviral vectors - Popova O.; design of recombinant adenoviral vectors carrying coronavirus genes as part of the adenoviral vector genome - Zubkova O.V.; immunization of animals, sampling of organs and tissues - Bandelyuk A.S.; cytometry and cell sorting - Pichugin A.V.; ELISPOT -Ushakova E.I.; analysis of results - Ataullakhanov R.I., Ushakova E.I., Pichugin A.V., Lebedeva E.S., Shmarov M.M.; statistical processing and technical design of the article - Ushakova E.I.; conception of the article - Ataullakhanov R.I.; writing of the article - Ataullakhanov R.I., Ushakova E.I., Lebedeva E.S.
Введение
Рекомбинантные аденовирусные векторы стали одной из ведущих технологических платформ при разработке и производстве современных вакцин. В России зарегистрированы вакцинные препараты против вируса лихорадки Эбола на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа [1], а также вакцинные препараты против 8ЛК8-СоУ-2-инфекции/СОУШ-19 на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов [2, 3]. В других странах мира зарегистрированы вакцины против COVID-19 на основе рекомбинантных аденовирусов человека и шимпанзе -Ad5-nCov (CanSino Biologies, Китай) [4], COVID-19 Ad26COVs1 (Johnson & Johnson, Нидерланды/США) [5] и ChAdOx1 nCoV-19 (Oxford University/AstraZeneca, Великобритания) [6]. Кроме указанных, на основе аденовирусных векторов разработаны и находятся на разных стадиях клинических испытаний вакцины против гриппа [7], вируса Марбург [8], вирусов папилломы человека [9].
Закодированный в ДНК аденовирусного вектора целевой антиген экспрессируется в организме вакцинированного и против этого целевого белка-антигена развиваются адаптивные иммунные реакции. Производятся специфические антитела, размножаются и дифференцируются Т-клетки, способные защищать от инфекции и регулировать различные варианты противо-инфекционной защиты, формируются долгоживущие Т- и В-клетки памяти, которые обеспечивают организм многолетней защитой.
Векторная частица является вирусной и содержит в себе десятки вирусных антигенов. Следовательно,
наряду с иммунными реакциями на закодированный целевой антиген, в организме вакцинированного могут развиваться иммунные реакции на антигены самого вектора. В случае аденовирусного вектора, кодирующего целевой антиген коронавируса, эти две антигенные сущности представляют собой антигены двух совершенно различных вирусов - аденовируса и коронавируса. Обе группы антигенов иммуногенны. В организме вакцинированного могут развиваться адаптивные реакции иммунной системы против целевого антигена коронавируса и против антигенов аденовируса.
Как соотносятся между собой по интенсивности и качеству две разнонаправленные по своей антигенной специфичности иммунные реакции: против целевого антигена коронавируса и антигенов аденовирусного вектора? Исследованию ответов на этот вопрос посвящена данная статья.
Мы исследовали интенсивность и антигенную специфичность адаптивных реакций СБ4- и СБ8-Т-клеток после иммунизации лабораторных мышей вакциной против коронавируса, представляющей собой аденовирусный вектор, кодирующий белковый 8-антиген 8ЛЯ8-СоУ-2. Интенсивность и качество Т-клеточных реакций, направленных против белковых компонентов вектора и целевого белка, закодированного в этом векторе, мы определяли по количеству СБ4- и СБ8-Т-клеток, специфичных к 8-антигену или антигенам аденовирусного вектора, в селезенке иммунизированных мышей. Полученные данные весьма интересны, поскольку не только характеризуют интенсивность и природу Т-клеток, различающихся специфичностью к антигенам аденовируса и 8-белка, но и указывают на ранее неизвестный
синергизм CD4- и СБ8-Т-клеток с разной антигенной специфичностью. Обсуждаются практически полезные аспекты использования полученных данных для повышения эффективности иммуногенов на основе аденовирусных векторов, кодирующих целевой антиген.
Материал и методы
Экспериментальные животные. В работе использованы инбредные мыши линии C57BL/6, самки 2-месячного возраста, полученные из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН (Пущино, Московская область). Животные содержались в стандартных условиях вивария ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.
Рекомбинантные аденовирусные векторы. В работе использован рекомбинантный аденовирус человека, серотипа 5 (Ad5-S), экспрессирующий ген S-белка коронавируса SARS-CoV-2 штамма Ухань (UniProt Id: P0DTC2). Искусственный синтез гена проведен компанией «Евроген» (Россия), нуклеотидная последовательность гена была оптимизирована для экспрессии в клетках человека и добавлена последовательность Козак.
Для получения рекомбинантного аденовируса Ad5-SAN был использован ген S-белка SARS-CoV-2 с удаленной генетической последовательностью, кодирующей 13 N-концевых аминокислотных остатков, составляющих лидерный пептид. Рекомбинантный аденовирусный вектор Ad5-0 без целевой вставки был получен коллективом авторов ранее [10].
Иммунизация. Мыши были иммунизированы вектором Ad5-S в дозе 108 БОЕ путем однократного интраназального введения в объеме 50 мкл. В качестве контрольных использовались мыши, получившие интраназально однократно 50 мкл буфера, в котором вводилась суспензия векторных частиц.
Культуры клеток in vitro. Суспензии клеток селезенки и костного мозга мыши получали в асептических условиях стандартными методами. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM (Thermo Fisher Scientific, США) с 25 мМ HEPES, дополненной смесью заменимых аминокислот, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Cytiva, GE Healthcare Life Sciences HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ ß-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы «ПанЭко», Россия), при 37 оС, в увлажненной атмосфере с содержанием 5 % СО2.
Мышей выводили из эксперимента с помощью цер-викальной дислокации. В асептических условиях выделяли селезенку. Клеточную суспензию готовили в фосфатном буфере с 0,5 % бычьего альбумина (ФБ-БСА). Фракцию мононуклеарных клеток получали с помощью центрифугирования в градиенте фиколла («ПанЭко», Россия). Клетки отмывали ФБ-БСА. Для сортировки
CD4- и СБ8-Т-клеток суспензию окрашивали антителами CD4-PE и CD8-APC (BD Biosciences, США). Лейкоциты подсчитывали с окрашиванием CD45-BV510 (BioLegend, США). Жизнеспособность суспензий определяли при окрашивании DAPI. Сортировку клеток проводили с помощью проточного цитометра-сорти-ровщика BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США). Чистота полученных популяций CD4- и CD8-Т-клеток составляла 98 %.
Получение антиген-презентирующих дендритных клеток. Дифференцировку дендритных клеток и макрофагов костного мозга мышей осуществляли in vitro в присутствии гранулоцитарно-макрофа-гального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) (Sigma, США). В асептических условиях выделяли бедренные и большие берцовые кости мышей. Костный мозг вымывали шприцем (игла 25G) в чашку Петри с раствором ФБ-БСА и тщательно суспендировали. Клетки отмывали ФБ-БСА. Эритроциты удаляли осмотическим лизисом. Ядро содержащие клетки культивировали в ПС с добавлением 10 нг/мл ГМ-КСФ при 37 оС и 5 % CO2. Через 3-4 дня в культуры вносили равный объем ПС с теми же добавками. На 7-й день дендритные клетки активировали липополисахаридом (LPS) из E. coli (Sigma, США) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл и нагружали антигеном. В качестве антигена использовали рекомбинантные аденовирусные векторы rAd5-S, rAd5-SAN, rAd5-0, а также рекомбинантный RBD-фрагмент S-белка SARS-CoV-2.
Анализ Т-клеточных реакций, специфичных к целевым антигенам. Антиген-специфический ответ Т-клеток оценивали по секреции ИФН-у через 2 и 3 мес после иммунизации. Специфический Т-клеточный ответ индуцировали в совместной культуре Т-клеток с антиген-презентирующими дендритными клетками, предварительно нагруженными целевым антигеном. Для анализа Т-клеток, распознающих эпитопы S-анти-гена SARS-CoV-2, дендритные клетки трансдуцировали Ad5-S или Ad5-SAN, или нагружали рекомбинантным RBD-фрагментом S-белка SARS-CoV-2. Для анализа Т-клеток, распознающих антигены аденовирусного вектора, дендритные клетки трансдуцировали аденовирусным вектором Ad5-0 без целевой вставки. При трансдукции дендритных клеток одним из трех использованных Ad-векторов использовалась концентрация 100 БОЕ Ad-вектора в расчете на 1 дендритную клетку. В отдельных экспериментах сравнивали две концентрации Ad5-S - 30 и 100 БОЕ в расчете на 1 дендритную клетку.
В лунки планшета для ELISPOT (BD TM ELISPOT Mouse IFN-y, кат. 551083, BD Bioscience, США) помещали 70 тыс. мононуклеаров или 30 тыс. CD4-Т-клеток, или 30 тыс. CD8-Т-клеток, выделенных из селезенки мыши и очищенных с помощью проточного сортировщика BD FACS Aria II. В те же лунки планшета в качестве антиген-презентирующих клеток вносили 50 тыс. дендритных клеток. Совместные культуры Т-клеток и дендритных клеток инкубировали в течение 36 ч при
Сортировка клеток на BD FACS Aria II
Иммунизация Ad5-S
Сингенные дендритные
Суспензия спленоцитов
Дендритные клетки
Очищенные популяции, CD4- и CDS-T-клетки
ELISPOT
Определение количества СБ4- и С08-Т-клеток, секретирующих ИФН-у
Рис. 1. Схема экспериментов по исследованию интенсивности и качества Т-клеточных реакций у мышей С57БЬ/6 после иммунизации аденовирусным вектором А(!5-8, кодирующим Б-белок 8ЛК8-СоУ-2
клетки
37 °C и 5 % CO2, после чего выявляли клетки, секре-тирующие ИФН-у, в соответствии с инструкцией производителя ELISPOT. Фотографии каждой лунки делали с помощью микроскопа Levenhuk DTX 700 LCD (Levenhuk, США), количество спотов определяли с помощью компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Количество ИФН-у-секретирующих антиген-реактивных Т-клеток представляли в расчете на 1 млн CD4- или CDS-Т-клеток.
Число антиген-реактивных Т-клеток памяти определяли по секреции ИФН-у после реактивации in vitro соответствующим антигеном. Число Т-клеток-эффек-торов определяли по секреции ИФН-у в культурах без рестимуляции антигеном.
Статистическая обработка. Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения Graph-Pad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., США). Для оценки достоверности различий между двумя независимыми выборками использовали ^-критерий Манна-Уитни. Для анализа различия между двумя связанными выборками применяли критерий Вилкоксона. Для анализа трех связанных групп использовали метод Фридмана. Различия между выборками при значениях p < 0,05 считались достоверными. На графиках представлены медианы, а также 25-й и 75-й процентили. В табл. 1 и на рис. 9 представлены средние значения и стандартное отклонение.
Результаты
Иммунизация мышей C57BL/6 вектором Ad5-S индуцирует мощный адаптивный Т-клеточный иммунный ответ
Принципиальная схема экспериментов представлена на рис. 1. Мышей C57BL/6 однократно иммуни-
зировали рекомбинантным вектором Ad5-S. Через 2 и 3 мес в селезенках иммунизированных мышей определяли содержание Т-клеток, специфически реагирующих секрецией ИФН-у на антигены аденовируса или закодированного в векторе Б-белка 8АЯБ-СоУ-2. Индивидуальные ИФН-у-секретирующие клетки выявляли методом ЕЫБРОТ. В различных вариантах этого метода в популяциях мононуклеаров селезенки или очищенных сортировкой СБ4- и СБ8-Т-клеток селезенки мы анализировали содержание клеток, секретирующих ИФН-у. Уровни Т-клеточной реакции на вакцину сравнивали с фоновым уровнем ИФН-у-секретирующих клеток в селезенке контрольных мышей, получавших ложную иммунизацию - введение соответствующего объема буферного раствора.
На рис. 2 и в табл. 1 представлены результаты репрезентативного эксперимента, демонстрирующие иммунный ответ мышей С57БЬ/6 на вакцинацию вектором Ad5-S. В селезенках иммунизированных мышей накапливалось >5000 ИФН-у-секретирующих клеток в расчете на 1 млн мононуклеарных клеток. Количество ИФН-у-секретирующих клеток в расчете на селезенку достигало 150-200 тыс., что доказывает высокий уровень иммунной реакции в ответ на иммунизацию.
Имея два вектора Ad5-S и Ad5-SЛN, которые кодируют две различные структуры Б-белка SARS-CoV-2, мы могли трансдуцировать антиген-презентирующие дендритные клетки каждым из этих векторов, чтобы сравнить две версии Б-антигена. Принципиальное различие между ними состояло в том, что полноразмерный Б-белок, синтезирующийся при трансдукции Ad5-S, проникает с помощью лидирующего ^концевого пептида в эндоплазматический ретикулум. Напротив, лишенный ^концевого пептида Б-белок, закодиро-
Рис. 2. Адаптивная клеточная иммунная реакция у мышей через 2 мес после иммунизации вектором Ad5-S
Визуализация одиночных секретирующих ИФН-у клеток методом ELISPOT в суспензии мононуклеаров из селезенки мышей, получивших иммунизацию вектором Ad5-S, по сравнению с контрольными мышами, получавшими ложную иммунизацию физиологическим раствором (PBS). Мононуклеары, полученные разделением на градиенте плотности фиколла, культивировали совместно с антиген-презентирующими дендритными клетками (ДК). Для презентации антигенов ДК трансдуцировали указанными векторами в концентрации 100 БОЕ на 1 ДК.
ванный в Ad5-SAN, не способен проникать в эндо-плазматический ретикулум и остается в цитозоле, что оптимально для последующего процессинга через про-теасому и презентации пептидных фрагментов белка в контексте MHC класса I. Сравнение количества клеток, секретирующих ИФН-у при реактивации дендритными клетками, трансдуцированными Ad5-S или Ad5-SAN, показало небольшое преимущество Ad5-SAN, но оно не было статистически достоверным (табл. 1, рис. 2).
При трансдукции антиген-презентирующих дендритных клеток аденовирусным вектором Ad5-0 без целевой вставки мы имеем возможность представлять на поверхности дендритной клетки пептидные фрагменты белковых антигенов аденовируса. При этом наиболее вероятным является представление антигенных пептидов аденовируса в контексте MHC класса II, поскольку вектор Ad5-0 - это нереплицирующийся рекомбинантный вирус и, следовательно, белки аденовируса не могут синтезироваться de novo в дендритной
клетке. Они должны процессироваться по пути, типичному для процессинга и презентации эндоцитиро-ванных антигенов, для которых характерна экспрессия на поверхности антиген-презентирующей клетки в комплексе с MHC класса II.
Результаты, представленные на рис. 2 и в табл. 1, свидетельствуют, что после иммунизации мышей C57BL/6 аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-антиген SARS-CoV-2, в селезенке мышей накапливались не только клетки, секретирующие ИФН-у в ответ на реактивацию in vitro S-антигеном (в виде Ad5-S или Ad5-SAN), но и клетки, секретирующие ИФН-у в ответ на реактивацию in vitro антигенами аденовируса (в виде Ad5-0). Так, реактивация дендритными клетками, трансдуцированными аденовирусным вектором Ad5-0 без какой-либо целевой вставки, выявляла более 6000 ИФН-у-секретирующих клеток в расчете на 1 млн мононукле-аров селезенки, что было вполне сравнимо с уровнем иммунной реакции в ответ на целевой S-антиген.
Таблица 1. Количество ИФН-у-секретирующих клеток в культуре мононуклеаров из селезенки мышей в условиях реактивации in vitro дендритными клетками (ДК), нагруженными векторами Ad5-0, Ad5-S или Ad5-SAN
Иммунизация in vivo Количество моно] п нуклеаров селезенки, секретирующих ИФН-у (на 1 млн клеток) ри реактивации дендритными клетками in vitro
ДК Ad5-0 + ДК Ad5-S + ДК Ad5-SAN + ДК
PBS 468 ± 222 1446 ± 92 1357±78 1204±230
Ad5-S 279 ± 99 6404±2721 5539±2171 6539±2109
Примечание. Представлены средние значения (M± SD) в группе мышей, иммунизированныхAd5-S (n = 4), по сравнению с группой контрольных мышей, получивших ложную иммунизацию буфером (PBS) (n = 4).
Рис. 3. Адаптивная иммунная реакция CD8-T-клеток селезенки мышей через 2 мес после иммунизации вектором Ad5-S Визуализация одиночных секретирующих ИФН-у клеток методом ELISPOT в суспензии очищенных сортировкой CDS-T-клеток из селезенки мышей, получивших иммунизацию вектором Ad5-S, по сравнению с контрольными мышами, получавшими ложную иммунизацию физиологическим раствором (PBS). CDS-T-клетки, полученные сортировкой на лазерном проточном сортировщике BD FACS Aria II, культивировали совместно с антиген-презентирующими дендритными клетками (ДК). Для презентации антигенов ДК трансдуцировали указанными векторами в концентрации 100 БОЕ в расчете на 1 ДК
Иными словами, иммунизация аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-антиген коронавируса, вызывает иммунные реакции против целевого S-анти-гена, а также антигенов самого аденовирусного вектора. Эти две разнонаправленные иммунные реакции равны по своей интенсивности.
Исследуя методом ELISPOT неразделенные клетки селезенки или фракцию мононуклеаров, невозможно определить природу клеток, реагирующих секрецией ИФН-у на реактивацию in vitro дендритными клетками, которые представляют на своей поверхности аденовирусные или коронавирусные антигенные пептиды, или те и другие одновременно. Для идентификации природы реагирующих клеток мы изучили реакции CD4-и CDS-Т-клеток, очищенных сортировкой из селезенки иммунизированных или контрольных мышей.
СБ8-Т-клетки, специфично реагирующие на целевой S-антиген и на антигены аденовирусного вектора
CDS-Т-клетки распознают чужеродные антигенные пептиды в контексте MHC класса I. Антигенные пептиды белков, de novo синтезирующихся в дендритной клетке, ассоциируются с MHC класса I и такой комплекс пригоден для распознавания рецепторами CDS-Т-клеток [9]. Имея в виду эти классические знания, мы нагружали дендритные клетки векторами, кодирующими S-антиген (Ad5-S или Ad5-SAN), или вектором Ad5-0 без экспрессионной кассеты с целевой вставкой.
В последнем случае не должно было происходить презентации каких-либо чужеродных антигенных пептидов в комплексе с MHC класса I, поскольку вектор Ad5-0 не индуцирует de novo синтеза каких-либо вирусных белков. В литературе имеются сообщения о так называемой кросс-презентации, когда классический путь презентации антигена нарушается и эндоцитированные белки, точнее их пептидные фрагменты, представляются в контексте MHC класса I. По этой причине мы проверили, не происходит ли кросс-презентации белков рекомбинантного аденовируса, что можно было бы увидеть по реактивации CDS-Т-клеток в контакте с дендритными клетками, нагруженными Ad5-0.
В наших экспериментах при культивировании CDS-T-клеток, выделенных сортировкой из селезенки иммунизированных Ad5-S мышей, совместно с антиген-презентирующими дендритными клетками, трансдуцированными Ad5-S, или Ad5-SAN, или Ad5-0, мы оценивали количество CDS-T-клеток, реагирующих на закодированный в указанных векторах S-антиген SARS-CoV-2 или на собственные антигены аденовирусного вектора.
Результаты исследования представлены на рис. 3 и 4. Они позволяют точно определить антигенную специфичность CDS-T-клеток памяти, сформировавшихся в организме мыши через 2 или 3 мес после иммунизации рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-белок SARS-CoV-2. В среднем в селезенке мышей, иммунизированных Ad5-S, накап-
rAdS-G-специфичные СБ8-Т-клетки
20 000 -,
15 000'
10 000-
5000-
p = 0,0286 I
е s
rAdS-S-специфичные СБ8-Т-клетки
p = 0,0009
Q "
g о 3 и
2 5
^ 2
ас ^
20 000 -,
15 000
10 000 -
5000-
ДК ДК+гАа5-0
ДК ДК+гАа5-0
ДК ДК+гАа5^ ДК ДК+rAd5-S
0
0
Рис. 4. Интенсивность CDS-Т-клеточной реакции у мышей C57BL/6 через 3 мес после иммунизации рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-S
Представлены медианные значения (25-й и 75-й процентили) количества CDS-T-клеток, секретирующих ИФН-у при реактивации in vitro дендритными клетками (ДК), которые были трансдуцированы Ad5-S или Ad5-0. Иммунные реакции у мышей, иммунизированных Ad5-S (n = 10), сравнивали с иммунными реакциями контрольных мышей, получивших ложную иммунизацию физиологическим раствором (PBS) (n = 4).
ливалось более 10 тыс. СВ8-Т-клеток, специфично распознающих целевой Б-антиген коронавируса (в расчете на 1 млн СЭ8-Т-клеток селезенки). Следовательно, иммунный ответ мышей С57БЬ/6 на иммунизацию вектором Ad5-S был так силен, что число СЭ8-Т-клеток памяти, специфично распознающих целевой Б-антиген, составило > 1 % от всех СЭ8-Т-клеток.
Известно, что только самые большие клонотипы Т-клеток памяти, специфичные к какому-либо антигену, достигают размеров > 1 % относительно всей популяции Т-клеток.
Через 2 и 3 мес после иммунизации Ad5-S содержание в селезенке иммунизированных мышей СЭ8-
T- клеток памяти, реагирующих на антигены аденовируса (реактивация вектором Ad5-0), было в несколько раз ниже, чем содержание антиген-реактивных CDS-T-клеток, реагирующих на целевой S-антиген SARS-CoV-2 (реактивация векторами Ad5-S или Ad5-SAN) (рис. 3 и 4). Следовательно, кросс-презентация собственных белков аденовирусного вектора в какой-то мере происходила, что обеспечивало представление антигенных пептидов аденовируса в контексте MHC класса I и позволяло CDS-T-клеткам распознавать и реагировать на антигены рекомбинантного аденовирусного вектора, несмотря на отсутствие синтеза de novo белков аденовируса в антиген-презентирующих дендритных клетках.
^ Е-
Реактивация ДК + Ad5-0
25 000
20 000
15 000
10 000 -5000 - -j-0 —-1
Реактивация ДК + Ad5-S
25 000 1 ns
20 000 - -р
15 00010 000 -50000-1--1-
S 2 fa ^
10000
§ & -F
к 5 &
л ©
« S
Сроки после иммунизации Ad5-S
* й
н
х
Реактивация ДК + Ad5-SAN
25 000 -,
20 000 -
н
ЕВ В 4
S 2 а
fa ^ ^н ир
н к 2 ш н я аее о & н S м о
F » К
К
©
S
15 000-
10 000-
5000-
ns
0
Рис. 5. Содержание антиген-реактивных CDS-T-клеток памяти в селезенке мышей C57BL/6 через 2 (n = 4) и 3 мес (n = 6) после иммунизации вектором Ad5-S
Представлены медианные значения (25-й и 75-й процентили) количества CDS-T-клеток, секретирующих ИФН-у при реактивации in vitro дендритными клетками (ДК), которые были трансдуцированы Ad5-0, Ad5-S или Ad5-SAN.
CDS-Т-клетки-эффекторы
оин
S s ч ^ a s
ииа
ч ¡3 и оее
& H
m и S
(U F о о
2000 -,
1500 -
té, ©
p = 0,0190
I
1000500- _L
0 -I--1-
s 2 3 мес
Сроки после иммунизации Ad5-S
Рис. 6. Содержание секретирующих ИФН-у CDS-T-клеток-эффекторов в селезенке мышей C57BL/6 через 2 (n = 4) и 3 (n = 6) мес после иммунизации вектором Ad5-S Т-клетки-эффекторы определяли методом ELISPOT в очищенной сортировкой суспензии CDS-T-клеток из селезенки иммунизированных мышей, без реактивации антигеном in vitro.
Сравнение через 2 и 3 мес после иммунизации количества СБ8-Т-клеток памяти, реагирующих секрецией ИФН-у на S-антиген или на антигены аденовируса, не выявило достоверных различий в эти два срока иммунной реакции мышей C57BL/6 на иммунизацию Ad5-S (рис. 5). Это означает, что уже через 2 мес после иммунизации завершилась экспоненциальная (проли-феративная) фаза иммунной реакции и произошла кон-
тракция размножившейся популяции Т-клеток с формированием пула долгоживущих СБ8-Т-клеток памяти. Количество СБ8-Т-клеток-эффекторов в селезенке мышей через 2 и 3 мес после иммунизации Ad5-S было на порядок меньше количества СБ8-Т-клеток памяти, что тоже свидетельствовало о завершении эффекторной фазы иммунной реакции и наступлении фазы долговременной иммунной памяти (рис. 6).
CD4-Т-клетки, специфично реагирующие на целевой S-антиген и на антигены аденовирусного вектора
Исследование антигенной специфичности очищенной популяции СБ4-Т-клеток, выделенных сортировкой из селезенки мышей, иммунизированных Ad5-S, показало, что практически все СБ4-Т-клетки памяти реагируют на антигены аденовирусного вектора. СБ4-Т-клеток, специфичных к S-белку коронави-руса, либо было очень мало, либо они вообще отсутствовали в селезенке мышей, иммунизированных Ad5-S (рис. 7, 8). При реактивации дендритными клетками, нагруженными Ad5-0, количество СБ4-Т-клеток, секретирующих ИФН-у, было таким же, как и при реактивации дендритными клетками, нагруженными Ad5-S или Ad5-SAN. Эти данные указывают на то, что практически все антиген-реактивные СБ4-Т-клетки памяти распознают антигены аденовирусного вектора, а не целевой S-антиген. С таким заключением согласуется и отсутствие реакции СБ4-Т-клеток из селезенки
Рис. 7. Адаптивная иммунная реакция CD4-T-клеток селезенки мышей через 2 мес после иммунизации вектором Ad5-S Визуализация одиночных секретирующих ИФН-у клеток методом ELISPOT в суспензии очищенных сортировкой CDé-T-клеток из селезенки мышей, получивших иммунизацию вектором Ad5-S, по сравнению с контрольными мышами, получавшими ложную иммунизацию физиологическим раствором (PBS). CDé-T-клетки, полученные сортировкой на лазерном проточном сортировщике BD FACS Aria II, культивировали совместно с антиген-презентирующими дендритными клетками (ДК). Для презентации антигенов ДК трансдуцировали указанными векторами в концентрации 100 БОЕ в расчете на 1 ДК.
rAd5-0-cпeцифичныe CD4-T-KíeTra
и
Îî ре ил
н w е
20 000
15 000
10 000
5000
p = 0,0008
ДК
ДК + TAd5-0
ДК ДК + гAd5-0
20 000
е. s
ре ил
15 000
10 000
¡SJS 8 í-¥ к
H ©
ÎÎ s о
о
5000
rAd5-S-cпeцифичныe CD4-T-^eTra
p = 0,0096
ДК ДК + ДК +
^d5-S ^d5-S-AN
ДК ДК + ДК +
^d5-S ^d5-S-AN
0
0
Иммунизация in vivo:
PBS
гAd5-S
RBD-cпeцифичныe CD4-T-KneTra
и
3 у.
у
20 000
Й 15 000
о, Я
* 5
ем
10 000
5000
Рис. 8. Интенсивность CD4-Т-клеточной реакции у мышей C57BL/6 через 3 мес после иммунизации рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-S
Представлены медианные значения (25-й и 75-й процентили) количества CD4-T-клеток, секретирующих ИФН-у при реактивации in vitro дендритными клетками (ДК), которые были трансдуцированы Ad5-S, Ad5-SAN или Ad5-0. Нижняя панель -реактивация CD4-T-клеток ДК, нагруженными рекомбинантным RBD-белком. Иммунные реакции у мышей, иммунизированных Ad5-S (n = 10), сравнивали с иммунными реакциями контрольных мышей, получивших ложную иммунизацию физиологическим раствором (PBS) (n = 4)
0
мышей, иммунизированных Ad5-S, на реактивацию in vitro дендритными клетками, нагруженными рекомбинантным RBD-фрагментом S-белка коронавируса (рис. 8, нижняя панель).
Возможности усиления Т-клеточного ответа путем повышения дозы вектора Ad5-S и/или использования молекулярного адъюванта
В предшествующих разделах статьи мы представили данные о том, что иммунизация Ad5-S индуцирует интенсивную реакцию CD8-Т-клеток, специфически реагирующих на целевой S-белок коронавируса. Одновременно вакцина вызывает интенсивный ответ CD4-T-клеток, специфичных к антигенам аденовирусного вектора, но не вызывает желаемого ответа CD4-T-клеток на целевой S-антиген.
Интенсивность слабых иммунных реакций можно повысить. Для этого имеются различные методы. Один из простых способов - увеличить дозу иммуногена. Другой метод - использовать усилитель иммунных реакций, молекулярный адъювант, действующий на уровне антиген-презентирующих клеток. В данной работе мы испытали оба указанных метода для усиления ответа Т-клеток, специфичных к S-антигену SARS-CoV-2. Результаты представлены на рис. 9-11.
Повышение дозы иммуногена действительно может существенно повысить ответ Т-клеток, распознающих данный антиген на поверхности антиген-презентиру-ющих дендритных клеток (рис. 9А). При увеличении дозы Ad5-S с 30 до 100 БОЕ (в расчете на 1 дендритную клетку), количество CD8-Т-клеток, реагирующих на S-антиген, повысилось приблизительно в 2 раза. Еще большего усиления удалось добиться при активации антиген-презентирующих клеток с помощью молекулярного адъюванта. В данном случае мы использовали агонист TLR4, кислый пептидогликан с молекулярной массой более 2 млн Да (Авексима, Россия) (рис. 9Б, 10). При дозе 30 БОЕ Ad5-S стимуляция дендритных клеток агонистом TLR4 увеличивала количество реагирующих CD8-T-клеток примерно в 6 раз, а при дозе 100 БОЕ Ad5-S Т-клеточный ответ усиливался в 4 раза (см. рис. 9, 10).
Примечательно, что использование того же молекулярного адъюванта, агониста TLR4, не позволило достоверно усилить исчезающе слабый ответ CD4-T-клеток на RBD (см. рис. 11). Под влиянием агониста TLR4 в реакции ELISPOT проявились единичные ИФН-у-секретирующие CD4-T-клетки, но их число оставалось слишком малым, чтобы считать это достоверной иммунной реакцией Т-клеток на RBD-антиген.
CDS-T-клетки памяти, специфичные к S-антигену SARS-CoV-2
О ■
go g я
s s
^
а ^
5 и
6 и й H
^ S « «
s
5000 п
4000-
3000-
2000-
5 1000-
I
0
30 100
Концентрация Ad5-S при трансдукции ДК (БОЕ/1 ДК)
Э
15 000-,
10 000-
5000
100 БОЕ/1 ДК Ad5-S
30 БОЕ/1 ДК Ad5-S
Среда
1 2 3 4 5 6 7 8 Концентрация агониста TLR4 (мкг/мл) для стимуляции антиген-презентирующих ДК
0
0
Рис. 9. Усиление реакции СБ8-Т-клеток на Ad5-S путем увеличения дозы вектора при трансдукции антиген-презентируюшдх дендритных клеток (ДК) и/или стимуляции антиген-презентирующих клеток агонистом TLR4 (кислый пептидогликан) CDS-T-клетки получали из селезенки мышей (n = 2) через 3 мес после иммунизации вектором Ad5-S методом сортировки на лазерном проточном сортировщике BD FACS Aria II. Количество антиген-реактивных CDS-T-клеток, секретирующих ИФН-у, определяли методом ELISPOT в совместной культуре очищенных CDS-T-клеток и антиген-представляющих ДК, трансдуциро-ванныхуказанной концентрацией Ad5-S. Представлены средние значения и стандартное отклонение количества CDS-T-клеток, секретирующих ИФН-у.
Обсуждение
В данной работе мы провели подробное исследование интенсивности и антигенной специфичности иммунных реакций CD8- и СБ4-Т-клеток, индуцированных в организме мыши рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-белок SARS-CoV-2. Иммунизация таким аденовирусным вектором, в принципе, имеет потенциал для индукции иммунных
реакций, направленных против антигенов двух совершенно различных вирусов - коронавируса и аденовируса. На рис. 12 представлены мажорные антигены аденовируса и их количество в расчете на каждую аденовирусную частицу. При иммунизации человека дозой 1011 частиц аденовирусного вектора общая масса только мажорных вирусных белков составляет ~ 75 мкг. Этой дозы вполне достаточно для индукции иммунных реакций против антигенов аденовируса. На самом деле
Вектор для нагрузки дендритных клеток in vitro
Рис. 10. Адаптивная иммунная реакция CDS-T-клеток селезенки мышей, иммунизированных вектором Ad5-S Визуализация одиночных секретирующих ИФН-у клеток методом ELISPOT в суспензии очищенных сортировкой CDS-T-клеток из селезенки мышей (n = 2) через 3 мес после иммунизации вектором Ad5-S. CDS-T-клетки, полученные сортировкой на лазерном проточном сортировщике BD FACS Aria II, культивировали совместно с антиген-презентирующими дендритными клетками (ДК). Для презентации антигенов ДК трансдуцировали вектором Ad5-S в концентрации 30 или 100 БОЕ в расчете на 1 ДК. Антиген-презентирующие ДК стимулировали агонистом TLR4 (IMM, кислый пептидогликан) в конечной концентрации 1, 3 или 10 мкг/мл.
Антиген для нагрузки дендритных клеток in vitro
Рис. 11. Реакция CD4-T-клеток селезенки мышей, иммунизированных вектором Ad5-S, на реактивацию in vitro дендритными клетками (ДК), нагруженными рекомбинантным белком RBD (фрагмент S-белка коронавируса)
Визуализация одиночных секретирующих ИФН-у клеток методом ELISPOT в суспензии очищенных сортировкой CD4-T-memoK из селезенки мышей через 3 мес после иммунизации вектором Ad5-S. CD4-T-клетки, полученные сортировкой на лазерном проточном сортировщике BD FACS Aria II, культивировали совместно с антиген-презентирующими ДК, нагруженными рекомбинантным белком RBD в указанной концентрации. Антиген-презентирующие ДК стимулировали агонистом TLR4 (IMM, кислый пептидогликан) в конечной концентрации 1 или 3 мкг/мл.
хорошо известно, что при иммунизации подобными рекомбинантными векторами с целевой вставкой в организме вакцинируемых развиваются достаточно интенсивные реакции не только против целевого антигена, но и против антигенов самого вектора. Чтобы минимизировать влияние антител, специфичных к аденовирусному вектору, на эффективность иммунизации, вакцина «Спутник V» против коронавирусной инфекции COVID-19 составлена из двух компонентов на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов [2, 3].
Описанные в данной статье результаты исследования антигенной специфичности CD4- и CD8-Т-клеток
доказывают, что вакцинный вектор Ad5-S индуцирует у мышей C57BL/6 сильные Т-клеточные иммунные реакции. Через 2 мес после иммунизации количество Т-клеток, распознающих целевой коронавирусный S-антиген, превысило 1 % от всех Т-клеток селезенки (см. рис. 3, 4). Такой большой размер популяции Т-клеток, реагирующих на один антиген, сравним с самыми крупными (hyper-expanded) клонотипами T-клеток, образующимися в организме мыши или человека в результате интенсивных реакций в ответ на инфекции или вакцинацию.
Интенсивная Т-клеточная реакция имела системный характер, поскольку вакцина вводилась интраназально,
Мажорные антигены аденовирусного вектора
Гексон - всего 240 молекул в 1 вирионе, каждая состоит из 3 полипептидных цепей
Полипептид IX - 240 молекул в 1 вирионе,
по 12 молекул pIX + 12 молекул гексона в каждой из 20 фасеток
Пентон - 12 молекул в 1 вирионе, каждая состоит из 5 полипептидных цепей
Фибер - 12 молекул в 1 вирионе, каждая состоит из 3 идентичных цепей
При каждой иммунизации вводится 1011 частиц гАс1, которые содержат:
• Гексона 0,72 • 1014 молекул 70 мкг)
• Фибера 3,6 • 1012 молекул (= 2 мкг)
• Пентона 6 • 1012 молекул (= 4 мкг)
Рис. 12. Схема строения аденовируса
Показаны мажорные антигены и оценочное количество этих антигенов в дозе 1011 частиц рекомбинантного аденовирусного вектора (rAd), являющейся разовой дозой для иммунизации человека.
а указанное большое количество СБ8-Т-клеток, специфичных к 8-антигену, мы регистрировали в селезенке мышей. Сравнение количества специфичных к 8-антигену СБ8-Т-клеток памяти через 2 и 3 мес после иммунизации доказывает, что пролиферативная и эффек-торная фазы иммунной реакции завершились уже через 2 мес. К этому времени произошло образование устойчивого пула долгоживущих Т-клеток памяти. Через 2 мес после иммунизации вектором Ad5-S 9 из 10 СБ8-Т-клеток, специфичных к 8-антигену, находились в фазе долгоживущих клеток памяти, и лишь 1 из 10 клеток имела свойства Т-клеток-эффекторов (см. рис. 5, 6).
СБ8-Т-клетки памяти, специфически реагирующие на антигены аденовирусного вектора, тоже обнаруживались в достаточно большом количестве в селезенке мышей через 2-3 мес после иммунизации Ad5-S. И хотя количество этих клеток было в несколько раз меньше, чем количество СБ8-Т-клеток памяти, специфично реагирующих на целевой 8-антиген коронавируса, полученные результаты свидетельствуют о кросс-презентации антигенов рекомбинантного аденовирусного вектора.
Интенсивность реакции СБ4-Т-клеток на вакцинацию вектором Ad5-S была так же высока, как интенсивность реакции СБ8-Т-клеток. Однако подавляющее большинство СБ4-Т-клеток памяти в селезенке мышей через 2-3 мес после иммунизации Ad5-S было специфично к антигенам аденовирусного вектора, а не к целевому S-антигену, закодированному в этом векторе (см. рис. 7, 8).
Мы показали, что интенсивную реакцию СБ8-Т-клеток, специфичных к S-антигену, можно дополнительно усилить путем увеличения дозы аденовирусного вектора (см. рис. 9) и/или с помощью агониста ТЬЯ4 (см. рис. 10), стимулирующего антиген-презентиру-ющие клетки [11]. Исчезающе слабый ответ СБ4-Т-клеток на S-антиген повысить с помощью ТЬЯ4-аго-ниста не удалось (см. рис. 11).
Дефицитный ответ СБ4-Т-клеток, специфичных к S-антигену, вполне реально существенно повысить. Для этого достаточно слегка модифицировать целевой ген S-белка в аденовирусном векторе Ad5-S. Вместо мембранной версии S-белка коронавируса или вместе с ней можно закодировать секреторную версию этого же S-белка. Секреторная форма S-белка будет секрети-роваться в среду вблизи дендритной клетки, в которой экспрессируется модифицированный таким образом вектор Ad5-S. Возникнет реальная возможность эндоци-тоза секреторного S-белка, процессинга этого антигена по эндоцитозному пути и презентации пептидных фрагментов в контексте с МНС класса II. Такой вариант презентации фрагментов S-белка на поверхности антиген-презентирующей дендритной клетки индуцирует ответ СБ4-Т-клеток, специфичных к эпитопам S-антигена. Дефицит S-специфичных хелперов будет устранен.
Хорошо известно, что помощь СБ4-Т-клеток необходима на начальной стадии первичной реакции СБ8-Т-клеток, в эффекторной фазе и при формиро-
вании долговременной СБ8-Т-клеточной памяти, а также при индукции вторичной реакции СБ8-Т-клеток [12-16]. Наше исследование показало, что после иммунизации Ad5-S интенсивная СБ8-Т-клеточная реакция на S-антиген с формированием большого количества СБ8-Т-клеток памяти происходила в отсутствие ответа СБ4-Т-клеток, специфичных к S-антигену. Одновременно происходил сильный СБ4-Т-клеточный ответ на антигены аденовирусного вектора. Эти данные позволяют предположить, что в процессе своего реагирования на S-антиген СБ8-Т-клетки получали помощь от многочисленных СБ4-Т-клеток, специфичных к антигенам аденовирусного вектора. Такое вполне возможно, если вспомнить, что аденовирусный вектор Ad5-S несет в себе обе коллекции антигенных пептидов - коронави-русного S-белка и аденовирусных белков капсида. Когда векторные частицы Ad5-S трансдуцируют дендритную клетку, возникает мозаичная презентация разных по своей природе антигенов на поверхности одной и той же антиген-презентирующей клетки. Антигенные пептиды S-белка экспонируются в комплексе с МНС класса I, а пептиды белков аденовирусного вектора экспонируются на поверхности этой же дендритной клетки в комплексе с МНС класса II (рис. 13). СБ8-Т-клетки распознают и реагируют на пептиды S-белка в комплексе с МНС класса I, а СБ4-Т-клетки распознают и реагируют на антигенные пептиды аденовирусных белков в комплексе с МНС класса II (рис. 13 А). Находясь в непосредственной близости друг от друга на поверхности одной и той же антиген-презентирующей клетки, СБ4- и СБ8-Т-клетки вполне могут взаимодействовать. В частности, СБ4-Т-клетки могут способствовать активации, пролиферации и дифференцировке соседствующих с ними СБ8-Т-клеток с помощью ИЛ-2, ФНОа, ИФН-у и других секретируемых цитокинов (рис. 13Б). Такое взаимодействие СБ4- и СБ8-Т-клеток никак не будет зависеть от происхождения антигенных пептидов (коронавирусные или аденовирусные), которые распознают эти две Т-клетки. Важно пространственное соседство СБ4- и СБ8-Т-клеток на одной антиген-презентирующей клетке, а также активное состояние обеих клеток, т. е. наличие необходимых для активации этих Т-клеток сигналов на поверхности дендритной клетки.
Описанный выше механизм взаимодействия СБ4-и СБ8-Т-клеток на поверхности антиген-презентиру-ющей клетки - это гипотеза, подлежащая экспериментальной проверке. В литературе имеются сообщения о кооперации СБ4- и СБ8-Т-клеток, специфичных к одному и тому же антигену, при их контакте с антиген-презентирующей дендритной клеткой [17]. Новизна нашей гипотезы в том, что мы предполагаем наличие взаимодействия СБ4- и СБ8-Т-клеток, специфичных к двум разным антигенам, при условии, что пептидные фрагменты этих антигенов экспонируются на поверхности одной и той же антиген-презентирующей клетки. Такое условие в полной мере соблюдается, когда антиген-презентирующие клетки трансдуцированы
Э
ИЛ-2, ИФН-y, ФНОа и другие
ГУ Ad5-S
Ad-антиген
S-антиген
ft Ф
ДК
Рис. 13. Схематическое представление одновременной презентации антигенных пептидов Б-белка коронавируса и белков аденовирусного вектора на поверхности одной и той же антиген-презентирующей дендритной клетки (ДК), трансдуцированной рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим В-белок SARS-CoV-2
рекомбинантным вирусом со вставкой, кодирующей целевой антиген. Частный случай, когда выполняется это условие, мы рассмотрели в данной работе - это аденовирусный вектор, кодирующий коронавирусный S-антиген.
Выводы
1. Иммунизация мышей линии С57БЬ/6 рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим полноразмерный S-белок SARS-CoV-2, вызывает интен-
сивные реакции СБ4- и СБ8-Т-клеток, завершающиеся через 2 мес образованием массивной популяции долго-живущих антиген-реактивных Т-клеток памяти.
2. Большинство образующихся в результате иммунизации рекомбинантным вектором Ad5-S антиген-реактивных СБ8-Т-клеток памяти специфично распознает и реагирует на антигенные эпитопы S-белка коронавируса. СБ4-Т-клетки, индуцированные иммунизацией Ad5-S, распознают и реагируют на антигенные эпитопы аденовирусного вектора.
■ Литература
1. Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatulin A.I., Dzharulla-eva A.S., Tukhvatulina N.M., Shcheblyakov D.V., Shmarov M.M., Tokars-kaya E.A., Simakova Y.V., Egorova D.A., Scherbinin D.N., Tutykhi-na I.L., Lysenko A.A., Kostarnoy A.V., Gancheva P.G., Ozharovskaya T.A., Belugin B.V., Kolobukhina L.V., Pantyukhov V.B., Syromyatnikova S.I.,
Shatokhina I.V., Sizikova T.V., Rumyantseva I.G., Andrus A.F., Boyars-kaya N.V., Voytyuk A.N., Babira V.F., Volchikhina S.V., Kutaev D.A., Bel's-kih A.N., Zhdanov K.V., Zakharenko S.M., Borisevich S.V., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Safety and immunogenicity of GamEvac-Combi, a heterologous VSV- and Ad5-vectored Ebola vaccine: An open
phase I/II trial in healthy adults in Russia. Hum Vaccin Immunother. 2017; 13 (3): 613-20. DOI: https://doi.org/10.1080/21645515.2016.1238535. PMID: 28152326
2. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatullin A.I., Shcheblyakov D.V., Dzharullaeva A.S., Grousova D.M., Erokhova A.S., Kovyrshina A.V., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovs-kaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voro-nina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Simakova Y.V., Tokars-kaya E.A., Lubenets N.L., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikitenko N.A., Morozova L.F., Smolyarchuk E.A., Kryukov E.V., Babira V.F., Borise-vich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Safety and immunogenicity of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine in two formulations: two open, non-randomised phase 1/2 studies from Russia. Lancet. 2020; 396 (10255): 887-97. DOI: https://doi. org/10.1016/S0140-6736(20)31866-3
3. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., Tukhvatu-lin A.I., Zubkova O.V., Dzharullaeva A.S., Kovyrshina A.V., Lube-nets N.L., Grousova D.M., Erokhova A.S., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovskaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voronina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Sima-kova Y.V., Tokarskaya E.A., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikiten-ko N.A., Gushchin V.A., Smolyarchuk E.A., Zyryanov S.K., Borise-vich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Gam-COVID-Vac Vaccine Trial Group. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet. 2021; 397 (10275): 671-81. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)00234-8
4. Zhu F.C., Li Y.H., Guan X.H., Hou L.H., Wang W.J., Li J.X., Wu S.P., Wang B.S., Wang Z., Wang L., Jia S.Y., Jiang H.D., Wang L., Jiang T., Hu Y., Gou J.B., Xu S.B., Xu J.J., Wang X.W., Wang W., Chen W. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 2020; 395 (10240): 1845-54. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31208-3
5. Solforosi L., Kuipers H., Jongeneelen M., Rosendahl Huber S.K., van der Lubbe J.E.M., Dekking L., Czapska-Casey D.N., Izquierdo Gil A., Baert M.R.M., Drijver J., Vaneman J., van Huizen E., Choi Y., Vreugdenhil J., Kroos S., de Wilde A.H., Kourkouta E., Custers J., van der Vlugt R., Veldman D., Huizingh J., Kaszas K., Dalebout T.J., Myeni S.K., Kikkert M., Snijder E.J., Barouch D.H., Böszörmenyi K.P., Stammes M.A., Kondova I., Verschoor E.J., Verstrepen B.E., Koop-man G., Mooij P., Bogers W.M.J.M., van Heerden M., Muchene L., Tol-boom J.T.B.M., Roozendaal R., Brandenburg B., Schuitemaker H., Wegmann F., Zahn R.C. Immunogenicity and efficacy of one and two doses of Ad26.COV2.S COVID vaccine in adult and aged NHP. J Exp Med. 2021; 218 (7): e20202756. DOI: https://doi.org/10.1084/jem. 20202756
6. ChAdOx1-S vaccine for prevention of COVID-19. Aust Prescr. 2021; 44 (2): 59-61. DOI: https://doi.org/10.18773/austprescr. 2021.012
■ References
1. Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatulin A.I., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shcheblyakov D.V., Shmarov M.M., Tokarskaya E.A., Simakova Y.V., Egorova D.A., Scherbinin D.N., Tutykhina I.L., Lysen-ko A.A., Kostarnoy A.V., Gancheva P.G., Ozharovskaya T.A., Belugin B.V., Kolobukhina L.V., Pantyukhov V.B., Syromyatnikova S.I., Shatokhina I.V., Sizikova T.V., Rumyantseva I.G., Andrus A.F., Boyarskaya N.V., Voy-tyuk A.N., Babira V.F., Volchikhina S.V., Kutaev D.A., Bel'skih A.N., Zhdanov K.V., Zakharenko S.M., Borisevich S.V., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Safety and immunogenicity of GamEvac-Combi, a heterologous VSV- and Ad5-vectored Ebola vaccine: An open phase I/II trial in healthy adults in Russia. Hum Vaccin Immunother. 2017; 13 (3): 613-20. DOI: https://doi.org/10.1080/21645515.2016. 1238535
2. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatullin A.I., Shcheblyakov D.V., Dzharullaeva A.S., Grousova D.M., Erokhova A.S., Kovyrshina A.V., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovs-kaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voroni-na D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Simakova Y.V., Tokars-kaya E.A., Lubenets N.L., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikitenko N.A., Morozova L.F., Smolyarchuk E.A., Kryukov E.V., Babira V.F., Borisevich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Safety and immunogenicity of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine in two formulations: two open, non-randomised phase 1/2 studies
7. Online database of Clinical trials. URL: https://www.clinicaltrials. gov/study/NCT01006798?cond=%20Influenza%20Vaccines&page=4&li mit=100&rank=371
8. Online database of Clinical trials. URL: https://www.clinicaltrials. gov/study/NCT05817422?cond=adenovirus%20vectored%20vaccine%20 &limit=100&rank=5
9. Kedzierska K., Koutsakos M. The ABC of major histocompatibility complexes and T cell receptors in health and disease. Viral Immunol. 2020; 33 (3): 160-78. DOI: https://doi.org/10.1089/vim.2019.0184.
10. Шмаров М.М., Седова Е.С., Верховская Л.В., Руднева И.А., Богачева Е.А., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Лысенко А. А., Туты-хина И.Л., Логунов Д.Ю., Смирнов Ю.А., Народицкий, Б.С., Гинц-бург А.Л. Индукция протективного гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа при иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами, экспрессирующими гемагглютинин вируса гриппа H5. Acta Naturae. 2010; 2 (1): 111-18.
11. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B., Ataullakha-nov R. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunol. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x
12. Janssen E.M., Lemmens E.E., Wolfe T., Christen U., von Herrath M.G., Schoenberger S.P. CD4+ T cells are required for secondary expansion and memory in CD8+ T lymphocytes. Nature. 2003; 421 (6925): 852-56. DOI: https://doi.org/10.1038/nature01441
13. Sun J.C., Bevan M.J. Defective CD8 T cell memory following acute infection without CD4 T cell help. Science. 2003; 300 (5617): 339-42. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1083317
14. Shedlock D.J., Shen H. Requirement for CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science. 2003; 300 (5617): 337-39. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1082305
15. Novy P., Quigley M., Huang X., Yang Y. CD4 T cells are required for CD8 T cell survival during both primary and memory recall responses. J Immunol. 2007; 179 (12): 8243-51. DOI: https://doi.org/10.4049/ jimmunol.179.12.8243
16. Phares T.W., Stohlman S.A., Hwang M., Min B., Hinton D.R., Bergmann C.C. CD4 T cells promote CD8 T cell immunity at the priming and effector site during viral encephalitis. J Virol. 2012; 86 (5): 2416-27. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.06797-11
17. Gressier E., Schulte-Schrepping J., Petrov L., Brumhard S., Stubbemann P., Hiller A., Obermayer B., Spitzer J., Kostevc T., Whitney P.G., Bachem A., Odainic A., van de Sandt C., Nguyen T.H.O., Ash-hurst T., Wilson K., Oates C.V.L., Gearing L.J., Meischel T., Hochheiser K., Greyer M., Clarke M., Kreutzenbeck M., Gabriel S.S., Kastenmüller W., Kurts C., Londrigan S.L., Kallies A., Kedzierska K., Hertzog P.J., Latz E., Chen Y.E., Radford K.J., Chopin M., Schroeder J., Kurth F., Gebhardt T., Sander L.E., Sawitzki B., Schultze J.L., Schmidt S.V., Be-doui S. CD4+ T cell calibration of antigen-presenting cells optimizes antiviral CD8+ T cell immunity. Nat Immunol. 2023; 24 (6): 979-90. DOI: https://doi.org/10.1038/s41590-023-01517-x
from Russia. Lancet. 2020; 396 (10255): 887-97. DOI: https://doi. org/10.1016/S0140-6736(20)31866-3
3. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., Tukhvatu-lin A.I., Zubkova O.V., Dzharullaeva A.S., Kovyrshina A.V., Lube-nets N.L., Grousova D.M., Erokhova A.S., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovskaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voronina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Sima-kova Y.V., Tokarskaya E.A., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikiten-ko N.A., Gushchin V.A., Smolyarchuk E.A., Zyryanov S.K., Borise-vich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Gam-COVID-Vac Vaccine Trial Group. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterolo-gous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet. 2021; 397 (10275): 671-81. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)00234-8
4. Zhu F.C., Li Y.H., Guan X.H., Hou L.H., Wang W.J., Li J.X., Wu S.P., Wang B.S., Wang Z., Wang L., Jia S.Y., Jiang H.D., Wang L., Jiang T., Hu Y., Gou J.B., Xu S.B., Xu J.J., Wang X.W., Wang W., Chen W. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adeno-virus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 2020; 395 (10240): 1845-54. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31208-3
5. Solforosi L., Kuipers H., Jongeneelen M., Rosendahl Huber S.K., van der Lubbe J.E.M., Dekking L., Czapska-Casey D.N., Izquier-
do Gil A., Baert M.R.M., Drijver J., Vaneman J., van Huizen E., Choi Y., Vreugdenhil J., Kroos S., de Wilde A.H., Kourkouta E., Custers J., van der Vlugt R., Veldman D., Huizingh J., Kaszas K., Dalebout T.J., Myeni S.K., Kikkert M., Snijder E.J., Barouch D.H., Boszormenyi K.P., Stammes M.A., Kondova I., Verschoor E.J., Verstrepen B.E., Koop-man G., Mooij P., Bogers W.M.J.M., van Heerden M., Muchene L., Tolboom J.T.B.M., Roozendaal R., Brandenburg B., Schuitemaker H., Wegmann F., Zahn R.C. Immunogenicity and efficacy of one and two doses of Ad26.COV2.S COVID vaccine in adult and aged NHP. J Exp Med. 2021; 218 (7): e20202756. DOI: https://doi.org/10.1084/jem. 20202756
6. ChAdOx1-S vaccine for prevention of COVID-19. Aust Prescr. 2021; 44 (2): 59-61. DOI: https://doi.org/10.18773/austprescr.2021.012
7. Online database of Clinical trials. URL: https://www.clinicaltrials. gov/study/NCT01006798?cond=%20Influenza%20Vaccines&page=4&li mit=100&rank=371
8. Online database of Clinical trials. URL: https://www.clinicaltrials. gov/study/NCT05817422?cond=adenovirus%20vectored%20vaccine%20 &limit=100&rank=5
9. Kedzierska K., Koutsakos M. The ABC of major histocompatibility complexes and T cell receptors in health and disease. Viral Immunol. 2020; 33 (3): 160-78. DOI: https://doi.org/10.1089/vim.2019.0184
10. Shmarov M.M., Sedova E.S., Verkhovskaya L.V., Rud-neva I.A., Bogacheva E.A., Barykova Y.A., Shcherbinin D.N., Lysen-ko A.A., Tutykhina I.L., Logunov D.Y., Smirnov Y.A., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Induction of a protective heterosubtypic immune response against the influenza virus by using recombinant adenoviral vectors expressing hemagglutinin of the influenza H5 Virus. Acta Naturae. 2010; 2 (1): 111-18. (in Russian)
11. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B., Ataullakha-nov R. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and
Сведения об авторах
Атауллаханов Равшан Иноятович - д-р мед. наук, проф., рук. отд. иммунной биотехнологии, зав. лаб. активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Ушакова Екатерина Игоревна - мл. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отдела иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ekaterina.ushakova95@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2143-1021
Пичугин Алексей Васильевич - канд. физ.-мат. наук, вед. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отдела иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: pichalvas@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5356-3331
Лебедева Екатерина Семеновна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отдела иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ekaterinalebedeva2612@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0384-9299
Иванов Сергей Валерьевич - инженер-исследователь группы экспрессии белковых факторов роста и диф-ференцировки ФГБУН ИБХ им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: ivansergey@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-1802-6351
TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunol. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x
12. Janssen E.M., Lemmens E.E., Wolfe T., Christen U., von Herrath M.G., Schoenberger S.P. CD4+ T cells are required for secondary expansion and memory in CD8+ T lymphocytes. Nature. 2003; 421 (6925): 852-56. DOI: https://doi.org/10.1038/nature01441
13. Sun J.C., Bevan M.J. Defective CD8 T cell memory following acute infection without CD4 T cell help. Science. 2003; 300 (5617): 339-42. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1083317
14. Shedlock D.J., Shen H. Requirement for CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science. 2003; 300 (5617): 337-39. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1082305
15. Novy P., Quigley M., Huang X., Yang Y. CD4 T cells are required for CD8 T cell survival during both primary and memory recall responses. J Immunol. 2007; 179 (12): 8243-51. DOI: https://doi.org/10.4049/ jimmunol.179.12.8243
16. Phares T.W., Stohlman S.A., Hwang M., Min B., Hinton D.R., Bergmann C.C. CD4 T cells promote CD8 T cell immunity at the priming and effector site during viral encephalitis. J Virol. 2012; 86 (5): 2416-27. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.06797-11
17. Gressier E., Schulte-Schrepping J., Petrov L., Brumhard S., Stubbemann P., Hiller A., Obermayer B., Spitzer J., Kostevc T., Whitney P.G., Bachem A., Odainic A., van de Sandt C., Nguyen T.H.O., Ash-hurst T., Wilson K., Oates C.V.L., Gearing L.J., Meischel T., Hochheiser K., Greyer M., Clarke M., Kreutzenbeck M., Gabriel S.S., Kastenmüller W., Kurts C., Londrigan S.L., Kallies A., Kedzierska K., Hertzog P.J., Latz E., Chen Y.E., Radford K.J., Chopin M., Schroeder J., Kurth F., Gebhardt T., Sander L.E., Sawitzki B., Schultze J.L., Schmidt S.V., Bedoui S. CD4+ T cell calibration of antigen-presenting cells optimizes antiviral CD8+ T cell immunity. Nat Immunol. 2023; 24 (6): 979-90. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41590-023-01517-x
Authors' information
Ravshan I. Ataullakhanov - MD, PhD, Prof., Head of Immune Biotechnology Dept., Head of Immunity Activation Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Ekaterina I. Ushakova - Junior Researcher of Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ekaterina.ushakova95@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2143-1021
Alexey V. Pichugin - PhD, Leader Researcher of Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: pichalvas@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5356-3331
Ekaterina S. Lebedeva - PhD, Senior Researcher of Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ekaterinalebedeva2612@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0384-9299
Sergey V. Ivanov - Engineer-Researcher of the Protein Growth and Differentiation Factors Expression Group, M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov IBCH RAS, MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ivansergey@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-1802-6351
Ожаровская Татьяна Андреевна - канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. иммунобиотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: t.ozh@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-7147-1553
Попова Ольга - мл. науч. сотр. лаб. иммунобиотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: olga.popova31@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-3248-1227
Щербинин Дмитрий Николаевич - канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: dim284@inbox.ru https://orcid.org/0000-0002-8518-1669
Банделюк Алина Сергеевна - науч. сотр. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: alinabond88@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-8453-797X
Зубкова Ольга Вадимовна - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. иммунобиотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: olga-zubkova@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-7893-8419
Шмаров Максим Михайлович - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: mmshmarov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-5268-1296
Логунов Денис Юрьевич - академик РАН, д-р биол. наук, зам. директора по научной работе ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: ldenisy@yahoo.com https://orcid.org/0000-0003-4035-6581
Народицкий Борис Савельевич - д-р биол. наук, проф., гл. науч. сотр., рук. отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: bsnar1941@yahoo.com https://orcid.org/0000-0001-5522-8238
Гинцбург Александр Леонидович - академик РАН, д-р биол. наук, проф., директор ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
https://orcid.org/0000-0003-1769-5059
Tatiana A. Ozharovskaia - PhD, Researcher of Immu-nobiotechnology Lab., N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: t.ozh@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-7147-1553
Olga Popova - Junior Researcher of Immunobiotechnology Lab., N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: olga.popova31@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-3248-1227
Dmitriy N. Shcherbinin - PhD, Researcher of Molecular Biotechnology Lab., N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: dim284@inbox.ru https://orcid.org/0000-0002-8518-1669
Alina S. Bandelyuk - Researcher of Molecular Biotechnology Lab., N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: alinabond88@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-8453-797X
Olga V. Zubkova - PhD, Leader Researcher of Immu-nobiotechnology Lab., N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: olga-zubkova@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-7893-8419
Maksim M. Shmarov - Dr.Sci., PhD, Head of Molecular Biotechnology Lab., N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mmshmarov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-5268-1296
Denis Yu. Logunov - Corresponding Member of RAS, Dr.Sci., Deputy Director for Science of the N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ldenisy@yahoo.com https://orcid.org/0000-0003-4035-6581
Boris S. Naroditsky - Dr.Sci., PhD, Prof., Chief Researcher, Head of Genetics and Molecular Biology of Bacteria Dept., N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: bsnar1941@yahoo.com https://orcid.org/0000-0001-5522-8238
Alexandr L. Gintsburg - Academician of RAS, Dr.Sci., Prof, Director of the N.F. Gamaleya FRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation https://orcid.org/0000-0003-1769-5059
