CC BY
20
© Коллектив авторов, 2023
Иващенко Т.А., Романенко Я.О., Марьин М.А., Карцева А.С., Силкина М.В., Зенинская Н.А., Шемякин И.Г., Фирстова В.В.
Оценка эффективности различных адъювантов при получении мышиных моноклональных антител к рецептор-связывающему домену S-белка 8ЛК8-СоУ-2
Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 142279, п. Оболенск, Московская область, Российская Федерация
Резюме
Введение. Пандемия §АЯ§-СоУ-2-инфекции/СОУГО-19 началась в конце декабря 2019 г. В мае 2023 г. руководство Всемирной организации здравоохранения сделало заявление о завершении пандемии. Основанием для него послужило снижение смертности от SARS-СоУ-2-инфекции/СОУШ-19. Однако циркуляция вируса продолжается, возникают новые мутации, появляются новые эпидемически значимые штаммы. Разработка эффективных вакцин и препаратов для противодействия SARS-CoV-2-инфекции/COVTD-19 по-прежнему остается актуальной задачей. В качестве потенциальных препаратов для лечения SARS-CoV-2-инфекции рассматриваются моноклональные антитела (МкАт).
Большинство SARS-CoV-2-специфических сильнодействующих нейтрализующих МкАт направлено против рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка вируса. Для получения МкАт существует много подходов, однако до сих пор их получение остается сложной задачей. Правильный выбор антигена и адъюванта играет ключевую роль в формировании напряженного иммунного ответа. Мы провели сравнительную оценку эффективности использования рекомбинантного RBD и RBD, слитого с Fc-фрагментом иммуноглобулина (RBD-Fc), эмульгированных с различными адъювантами, для достижения высокого иммунного ответа у мышей линии BALB/с.
Цель работы - подобрать наиболее эффективные антиген и адъювант для увеличения иммунного ответа у животных с целью получения МкАт.
Материал и методы. Для выполнения работы были получены рекомбинантный RBD и RBD, слитый с Fc-фрагментом IgG1 человека. Для получения МкАт, специфичных к RBD-домену S-белка SARS-CoV-2, мышей линии BALB/c иммунизировали по 9 схемам. На 3-й день после последней иммунизации у каждой группы животных был проведен забор крови для определения титра специфических антител. У группы гипериммунных мышей изолировали селезенки для получения суспензии спленоцитов и их дальнейшего слияния с клетками-партнерами Sp2/0-Ag14. После слияния клетки культивировали и после образования монослоя проводили скрининг, клонирование и наращивание.
Результаты. Сравнительный анализ титров специфических антител к RBD в крови мышей показал, что адъюванты гидроксид алюминия, полный адъювант Фрейнда (ПАФ), гидроксид алюминия в сочетании с ПАФ и Magic™ Mouse обладают различной способностью индуцировать иммунный ответ в сочетании с рекомбинантным RBD или RBD-Fc. Наиболее эффективным иммуногеном является RBD-Fc, эмульгированный с гидроксидом алюминия и ПАФ, титр антител составил 1 : 256 000. По итогам электрослияния было получено 17 гибридов, 3 из них оказались стабильными.
Заключение. Адъювантная композиция гидроксида алюминия и ПАФ наиболее эффективна для стимуляции иммунного ответа с целью получения мышиных МкАт к RBD-домену S-белка SARS-CoV-2. Возможно, такой эффект в повышении иммуно-генности был достигнут за счет механизмов действия двух адъювантов. ПАФ выполнял функцию депо антигена за счет минерального масла в своем составе, а гидроксид алюминия - функцию доставки антигена. Так как молекулярная масса рекомбинантного RBD была увеличена нами в 2 раза, это позволило адъюванту на основе гидроксида алюминия задержать антиген на своей поверхности и длительное время представлять его иммунным клеткам, стимулируя гуморальный иммунный ответ.
Для корреспонденции
Иващенко Татьяна Александровна -кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область, Российская Федерация E-mail: [email protected] https: //orcid.org/0000-0002-4908-2524
Ключевые слова: SARS-CoV-2; рецептор-связывающий домен; ангиотензин-превращающий фермент 2; иммунизация; адъювант; моноклональные антитела
Статья получена 20.04.2023. Принята в печать 15.06.2023.
Для цитирования: Иващенко Т.А., Романенко Я.О., Марьин М.А., Карцева А.С., Силкина М.В., Зенин-ская Н. А., Шемякин И.Г., Фирстова В.В. Оценка эффективности различных адъювантов при получении мышиных моноклональных антител к рецептор-связывающему домену S-белка SARS-CоV-2. Иммунология. 2023; 44 (4): 481-90. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-4-481-490
Финансирование. Работа выполнена при поддержке Отраслевой научной программы Федеральной службы России по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Дизайн и проведение исследования - Иващенко Т.А.; сбор и обработка материала -Марьин М.А., Силкина М.В., Зенинская Н.А.; статистическая обработка - Карцева А.С.; оформление и редактирование текста - Иващенко Т. А., Романенко Я.О., Карцева А.С.; ответственность за целостность всех частей статьи - Шемякин И.Г.; концепция исследования и заключительное редактирование - Фирстова В.В.
Ivaschenko T.A., Romanenko Ya.O., Marin M.A., Kartseva A.S., Silkina M.V., Zeninskaya N.A., Shemyakin I.G., Firstova V.V.
Evaluation of the efficacy of different adjuvants in producing murine monoclonal antibodies to the receptor-binding domain of the S-protein of SARS-CoV-2
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology of the Russian Federal Consumer Rights Protection and Human Health Control Service (Rospotrebnadzor), 142279, Obolensk, Moscow region, Russian Federation
Abstract
Introduction. The SARS-CoV-2-infection/COVID-19 pandemic began at the end of December 2019. In May 2023, the WHO leadership declared the end of the pandemic. The reason for this conclusion was the reduction of SARS-CoV-2 infection/COVID-19-caused mortality. However, the circulation of the virus continues, new mutations appear, new epidemiologically significant strains arise. Monoclonal antibodies (MAbs) are considered as potential drugs for the treatment or prevention of SARS-CoV-2 infection. To date, most potent neutralizing MAb aim to neutralize the receptor-binding domain (RBD) of S-protein of the SARS-CoV-2. There are many approaches to obtain MAb, but they are still a challenge. The correct choice of antigen and adjuvant plays a key role in the formation of an intense immune response. We performed a comparative evaluation of the efficacy of recombinant RBD and RBD fused to Fc fragment of immunoglobulin (RBD-Fc) emulsified with different adjuvants to achieve a high immune response in BALB/c mice.
The purpose of this study was to select the most effective antigen and adjuvant to increase the immune response in animals in order to obtain MAb.
Material and methods. Recombinant RBD and RBD fused to Fc-fragment of human immunoglobulin G1 were obtained for this work. In the next step, BALB/c mice were immunized according to nine schemes to obtain MAb specific to the RBD domain of the S-protein of SARS-CoV-2. On the third day after the last immunization blood was collected from each group of animals to determine the antibody specificity titer. Spleens were extracted from the group of hyperimmune mice to obtain a suspension of splenocytes for further fusion with Sp2/0-Ag14 partner cells. After fusion, cells were cultured and screened, cloned, and expanded upon monolayer formation.
Results. Comparative analysis of specific antibody titers to RBD in the blood of mice showed that the adjuvants aluminum hydroxide, complete Freund's adjuvant (CFA), aluminum hydroxide in combination with PAF and MagicTM Mouse have different abilities to induce an immune response when combined with recombinant RBD or RBD-Fc. The most effective immunogen was RBD-Fc emulsified with aluminum hydroxide and CFA, the antibody titer was 1 : 256,000. Seventeen hybrids were obtained by electrofusion, three of which were stable.
Conclusion. Adjuvant composition of aluminum hydroxide and IFA is the most effective for stimulation of immune response to obtain murine MAb to RBD domain of the S-protein
For correspondence
Tatiana A. Ivashchenko - PhD, Researcher of Molecular Biology Lab.
of the FBIS SRCAMB, Rospotrebnadzor, Obolensk, Moscow region, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4908-2524
Иващенко Т. А., Романенко Я.О., Марьин М.А., Карцева А.С., Силкина М.В., Зенинская Н.А., Шемякин И.Г., Фирстова В.В. Оценка эффективности различных адъювантов при получении мышиных моноклональных антител к рецептор-связывающему домену S-белка SARS-CоV-2
of SARS-CoV-2. It is possible that this effect in enhancing immunogenicity was due to the mechanisms of action of the two adjuvants. IFA acted as an antigen depot due to the mineral oil in its composition, and aluminum hydroxide acted as antigen delivery. Since the molecular weight of the recombinant RBD protein was doubled, this allowed the aluminum hydroxide-based adjuvant to retain the antigen on its surface and provide it to the immune cells for a long time, stimulating the humoral immune response.
Keywords: SARS-CoV-2; receptor-binding domain; angiotensin-converting enzyme 2; immunization; adjuvant; monoclonal antibodies
Received 20.04.2023. Accepted 15.06.2023.
For citation: Ivaschenko T.A., Romanenko Ya.O., Marin M.A., Kartseva A.S., Silkina M.V., Zeninskaya N.A., Shemyakin I.G., Firstova V.V. Evaluation of the efficacy of different adjuvants in producing murine monoclonal antibodies to the receptor-binding domain of the S-protein of SARS-CoV-2. Immunologiya. 2023; 44 (4): 481-90. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-4-481-90 (in Russian)
Funding. The work was supported by the Sectoral Scientific Program of the Russian Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Design and conduct of the study - Ivashchenko T.A.; collection and processing of material -Marin M.A., Silkina M.V., Zeninskaya N.A.; statistical processing - Kartseva A.S.; design and text editing - Ivashchenko T.A., Romanenko Ya.O., Kartseva A.S.; responsibility for the integrity of all parts of the article - Shemyakin I.G.; research concept and final editing - Fyrstova V.V.
Введение
Коронавирусная инфекция (СОУГО-19), вызываемая 8ЛЯ8-СоУ-2, представляет собой новое респираторное заболевание и является серьезной проблемой для мирового здравоохранения [1]. В настоящее время продолжается интенсивное изучение иммунопатогенеза СОУГО-19, а также ведется разработка новых препаратов для профилактики и лечения новой коронави-русной инфекции [2, 3].
Ключевую роль в иммунопатогенезе коронавирус-ной инфекции играет 8-белок, который обусловливает прикрепление и проникновение вируса в клетку за счет связывания с рецептором клетки-хозяина - ангиотензин-превращающим ферментом 2 (ЛСЕ2) [4]. 8-белок состоит из двух субъединиц: М-концевой субъединицы 81, на которой находится рецептор-связывающий домен (КВБ), и мембрано связывающей субъединицы 82 [5]. В ходе инфекционного процесса вирус-нейтрализу-ющие антитела вырабатываются преимущественно к субъединице 81, а именно к КВБ, что делает его главной мишенью для создания вакцин и получения лекарственных препаратов на основе моноклональных антител (МкАт) [6].
Однако иммунизация рекомбинантным ИВБ вызывает сравнительно слабый иммунный ответ у экспериментальных животных [7]. Для увеличения иммуно-генности КВБ предлагалось использовать адъювант или добавить к С-концу ИВБ Бс-фрагмент человека, чтобы сформировать слитый белок ИВБ-Бс, что увеличивает молекулярную массу антигена в 2 раза и позволяет стимулировать В-клетки через Бс-рецептор [8]. Кроме того, Бс-фрагмент способствует правильному фолдингу слитого белка и усиливает связывание с антиген-презентирующими клетками [9].
Иммунизация животных является первым шагом в получении МкАт. На сегодняшний день не существует единого универсального способа иммунизации животных, который бы гарантировал получение продукта, идеально удовлетворяющего всем требованиям, но существуют определенные подходы [10]. Главное требование для получения достаточно высоких титров специфических антител - подбор подходящей схемы иммунизации. При ее разработке необходимо учитывать дозу антигена, количество инъекций и природу адъю-ванта. Применение адъювантов оказывает стимулирующее действие на иммунную систему животного для активной выработки антител [11].
В данном исследовании для получения мышиных МкАт мы использовали в качестве антигенов рекомби-нантный КВБ и ИВБ, слитый с Бс-фрагментом (ИВБ-Бс), эмульгированный с различными адъюван-тами.
Материал и методы
Лабораторные животные. Для проведения исследования были использованы мыши инбредной лини ВЛЬВ/с(И2а) (питомник «Пущино», ФИБХ РАН, Московская обл., г. Пущино). Масса мышей составляла 18-20 г, возраст 6-8 недель. Все стадии исследования соответствовали законодательству Российской Федерации [12] и Директиве Европейского парламента и Совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [13]. Мыши содержались по 5 штук в клетках типа «микроизолятор» в контролируемых условиях окружающей среды (температура воздуха 20-24 °С, относительная влажность 35-40 %, освещение в помещениях - искусственное, с фиксированным режимом день-ночь). В качестве подстила использовали древесные опилки нехвойных пород,
в качестве корма - стандартный комбикорм гранулированный полнорационный для лабораторных животных (экструдированный) ПК-120 ГОСТ 50258-92 производства ООО «Лабораторкорм» (Россия).
Получение и очистка рекомбинантных антигенов. Для иммунизации лабораторных животных было получено два варианта рекомбинантного антигена RBD с аминокислотными последовательностями, присущими рецептор-связывающему домену шиповидного (S-) белка коронавируса SARS-CoV-2 изолята Wuhan-Hu-1 (идентификационный номер UniProtKB: P0DTC2). Первый вариант антигена являлся доменом RBD (аминокислоты R319-F541) с C-концевым октагистидиновым кластером (RBD-His). Второй вариант антигена состоял из домена RBD (аминокислоты T333-K528), слитого с кристаллизующимся фрагментом IgG человека (RBD-Fc). Наработку рекомбинантных антигенов осуществляли в клетках линии ExpiCHO-S (Gibco, США).
Продукцию RBD-Fc осуществляли в режиме тран-зиентной экспрессии согласно инструкции к набору ExpiCHO Expression System Kit (Gibco, США). Плаз-мидный вектор для экспрессии антигена RBD-Fc pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-Fc (рис. 1А) был получен от K.K. Chan (плазмида Addgene # 141183) [14].
Для экспрессии белка RBD-His получали монокло-нальную клеточную линию-продуцент. Вначале сконструировали плазмидный вектор pcDNA3.4 RBD-His (рис. 1Б) на основе модифицированной нами плазмиды pcDNA3.4 (Invitrogen, США). Фрагмент ДНК RBD R319-F541 получали в результате амплификации участка плазмиды pLV-SpikeV1 (Invivogen, Франция) в ПЦР. Праймеры были сконструированы с учетом внедрения сигнального пептида «Secrecon»-Ala-Ala в N-конец [15] и последовательности Gly-Ser-Gly-8*His в С-конец белка. Продукт ПЦР клонировали в модифицированную плазмиду по сайтам XhoI и NotI, наличие которых было частью модификации pcDNA3.4. Далее проводили транс-фекцию рекомбинантной плазмидой клеток ExpiCHO-S с помощью Lipofectamine LTX с реагентом Plus (Invit-rogen, США). Штамм-продуцент получали благодаря селекции стабильно-экспрессирующей популяции под воздействием возрастающей концентрации пуроми-цина (0,5-5-10-15 мкг/мл) при субкультивировании, а затем выбирали максимально продуцирующий клон. Очищенный белок RBD-His получали после хрома-тографической очистки осветленной культуральной жидкости на колонке PureCube 100 INDIGO Ni-Cartridge (Cube Biotech, Германия). Чистоту и размер очищенных антигенов проверяли путем электрофореза в 10 % поли-акриламидном геле (ПААГ) по Лэммли.
Иммунизация животных. Для получения МкАт, специфичных к RBD-домену S-белка SARS-CoV-2, мышей линии BALB/c иммунизировали по девяти схемам.
Первой группе мышей в количестве 5 особей подкожно вводили рекомбинантный RBD в дозе 100 мкг/ мышь с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) (Sigma-Aldrich, США). Через 2 нед повторно иммунизировали
рекомбинантным RBD в дозе 100 мкг/мышь с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) (DIFCO Laboratories, США). Спустя 2 нед мышей реиммунизировали подкожно рекомбинантным RBD в дозе 100 мкг/мышь в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), pH 7,4, без адъю-ванта.
Второй группе мышей в количестве 5 особей подкожно вводили рекомбинантный RBD в дозе 100 мкг/ мышь, эмульгированный в ПАФ и гидроксиде алюминия (Al(OH)3) (Brenntag Biosector, Дания). Через 2 нед мышей иммунизировали повторно рекомбинантным RBD в дозе 100 мкг/мышь с НАФ и гидроксидом алюминия. На 28-е сутки проводили реиммунизацию внутрибрюшинным введением рекомбинантного RBD в дозе 100 мкг/мышь в ФСБ, pH 7,4, без адъювантов.
Третьей группе мышей в количестве 5 особей вводили подкожно в дозе 100 мкг/мышь рекомбинантный RBD, эмульгированный с гидроксидом алюминия в объеме 0,2 мл. Через 14 дней проводили повторную иммунизацию по той же схеме, а через 28 дней животных реиммунизировали рекомбинантным RBD в дозе 50 мкг/мышь в ФСБ, рН 7,4, без адъюванта.
Четвертой группе мышей в количестве 5 особей внутримышечно вводили рекомбинантный RBD в дозе 100 мкг/мышь, эмульгированный с адъювантом Magic™ Mouse (Creative Diagnostics, США) в соотношении 1 : 1. На 35-е сутки проводили реиммунизацию по той же схеме.
Иммунизацию еще четырех групп животных проводили по описанным выше схемам, но в качестве антигена использовали RBD-Fc. Девятая группа животных выступала в качестве отрицательного контроля. Данной группе животных вводили раствор ФСБ, pH 7,4.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Для тестирования использовали 96-луночные планшеты (Costar, USA), сенсибилизированные RBD-His в концентрации 10 мкг/мл. На 3-и сутки после последней иммунизации у животных осуществляли забор цельной крови для определения титров специфических IgG-антител. Для анализа использовали последовательные 2-кратные разведения образцов в диапазоне от 1 : 1000 до 1 : 512 000. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови интакт-ных мышей. В рабочем разведении применяли конъ-югат кроличьих иммуноглобулинов с пероксидазой хрена против иммуноглобулинов мыши (Sigma-Aldrich, США). Реакцию проявляли раствором субстрата — 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB, Sigma). Оптическую плотность измеряли на фотометре Multiskan (Labsystems, США) при длине волны 450 нм (ОП 450).
Получение гибридом. Слияние В-лимфоцитов селезенок гипериммунных мышей с клетками-партнерами Sp2/0-Ag14 (ATCC® CRL-1581™- США) проводили методом электрослияния с помощью системы BTX ECM 2001 (Harvard Bioscience, США). Параметры и методика электрослияния были опубликованы ранее [16]. По окончании электрослияния к суспензии
Иващенко Т. А., Романенко Я.О., Марьин М. А., Карцева А.С., Силкина М.В., Зенинская Н. А., Шемякин И.Г., Фирстова В.В. Оценка эффективности различных адъювантов при получении мышиных моноклональных антител к рецептор-связывающему домену S-белка SARS-CоV-2
Рис. 1. Генетические карты плазмид pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-Fc (А) и RBD-His (Б)
Neo-R - ген неомицин-фосфотрансферазы (neo); pUC ori - область начала репликации плазмиды pUC; Amp-R - открытая рамка считывания (ОРС) в-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину (ген bla); E CMVIE1 Hs - энхансер предраннего гена-1 цитомегаловируса человека; P CMVIE1 Hs - промотор предраннего гена-1 цитомегаловируса человека; SS HA - сигнальная последовательность гемагглютинина вируса гриппа; hIgG1 Fc - рамка считывания кристаллизующегося фрагмента IgG1 человека; pA GH bt - сигнал полиаденилирования гена гормона роста быка; SS Syn - синтетическая сигнальная последовательность «Secrecon»; IRESatt - аттенуированная последовательность IRES (сайт внутренней посадки рибосомы); T2A - элемент, кодирующий «саморасцепляющийся» пептид 2A вируса Thosea asigna; Puro-R - ОРС пуромицин-трансферазы, обеспечивающей устойчивость к пуромицину (ген pac); WPRE - посттрансляционный регуляторный элемент вируса гепатита суслика; pA HSV TK - сигнал полиаденилирования гена тимидинкиназы вируса герпеса человека.
клеток добавляли 60 мл среды RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), содержащей 20 % ФСБ, однократный раствор HAT (Gibco, ThermoFisher, США), и переносили в 96-луночные культуральные планшеты по 100 мкл.
Результаты
Рекомбинантные антигены RBD-Fc и RBD-His были получены в системе экспрессии ExpiCHO-S. Для производства RBD-His была сконструирована плазмида pcDNA3.4 RBD-His (рис. 1А), которую использовали для создания стабильно экспрессирующей моноклональной клеточной линии. Продукция RBD-Fc осуществлена в режиме транзиентной экспрессии благодаря транс-фекции клеток плазмидой pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-Fc (рис. 1Б). Выход очищенного белка составил
3 мг и 50 мг белка на 1 литр культуральной жидкости для RBD-Fc и RBD-His соответственно.
После проведения электрофореза в ПААГ (рис. 2) установили, что степень чистоты антигенов составляет > 95 %, белки в редуцирующих условиях (рис. 2, дорожки
4 и 5) обладают молекулярной массой ~ 50 и 30 кДа, что соответствует ожидаемым значениям и несколько больше расчетной молекулярной массы по аминокислотам (48 и 26 кДа) по причине гликозилирования.
Иммуногенность полученных рекомбинантных антигенов RBD и RBD-Fc определяли в комбинации с различными адъювантами на мышах линии BALB/c. Титры RBD-специфических антител в крови определяли с помощью непрямого твердофазного ИФА. Для покрытия лунок планшетов использовали белок RBD-His, а не RBD-Fc, поскольку иммунизированные мыши могли продуцировать антитела против Fc человека.
кДа 250 130
100
70
55
35
25
Рис. 2. Электрофореграмма рекомбинантного RBD и RBD-Fc в 10 % ПААГ
1 - маркеры молекулярных масс PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific, США); 2 - белок RBD-Fc в неденатурирующих условиях; 3 - белок RBD-His в неденатурирующих условиях; 4 - белок RBD-Fc в денатурирующих условиях; 5 - белок RBD-His в денатурирующих условиях.
486
Методы
2,5 -i
Ч> ^ ^b ^ ^ A Л
ч- ч- ч-
ч- ч- ч-
Разведение крови
ПАФ + RBD
TM ,
MagicTM Mouse + RBD -Д- Гидроксид алюминия + RBD
Гидроксид алюминия + ПАФ + RBD —О— Контроль
Рис. 3. Титр антител в крови животных после введения реком-бинантного RBD, эмульгированного с адъювантами
ч> ч> ч" ^ Ч.ч> ^
ч
Разведение крови
ПАФ + RBD-Fc -ф- MagicTM Mouse + RBD-Fc -Д- Гидроксид алюминия + RBD-Fc
Гидроксид алюминия + ПАФ + RBD-Fc —О- Контроль
Рис. 4. Титр антител в крови животных после введения реком-бинантного RBD-Fc, эмульгированного с адъювантами
Иммунизация мышей рекомбинантными белками RBD и RBD-Fc не вызывала у животных местных реакций или летальных исходов. Нами было установлено, что реком-бинантный RBD обладал более низкой иммуногенно-стью по сравнению с RBD-Fc, независимо от того, какой из адъювантов при этом использовался (рис. 3, 4).
Титры антител в группе животных, иммунизированных RBD или RBD-Fc в сочетании с ПАФ, составили 1 : 16 000 и 1 : 32 000 соответственно. В группе животных, иммунизированных RBD или RBD-Fc в сочетании с адъювантом Magic™ Mouse, титры антител составили 1 : 8000 и 1 : 16 000 соответственно. В группе животных, иммунизированных RBD или RBD-Fc в сочетании с гидроксидом алюминия, титры антител составили 1 : 64 000 и 1 : 128 000 соответственно. В группе животных, иммунизированных RBD или RBD-Fc в сочетании со смесью адъюванта Фрейнда и гидроксида алюминия, титры антител составили 1 : 128 000 и 1 : 256 000 соответственно. Таким образом, совместное использование двух адъювантов - гидроксида алюминия и ПАФ - позволило получить наиболее напряженный иммунный ответ в группе животных, иммунизированных антигеном RBD-Fc.
По результатам ИФА для получения гибридом была выбрана группа мышей, иммунизированных RBD-Fc
в сочетании со смесью адъюванта Фрейнда и гидроксида алюминия. В результате гибридизации методом электрослияния нами было получено 17 гибридных клонов, продуцирующих МкАт к КББ 8-белка 8АЯ8-СоУ-2. Результаты скрининга перспективных клонов представлены в таблице.
Культуральную жидкость из лунок, в которых наблюдался рост гибридных клеток, тестировали с помощью ИФА в отношении специфического взаимодействия с рекомбинантным КББ. После образования монослоя гибридных клеток проводили скрининг, клонирование и наращивание. В результате исследования было получено 3 стабильных клона: 1Е6, 5С3 и 3Б11.
Обсуждение
Адъюванты делятся на природные и синтетические. Их добавляют в вакцины для стимуляции иммунной системы, но сами по себе адъюванты не вызывают специфического иммунного ответа [17]. Функция адъю-вантов заключается в транспортировке антигена или формировании его депо, уменьшении дозы антигена и количества повторных иммунизаций, достаточных для получения высоких титров антител [18].
Механизм действия адъювантов разнообразен. Самая распространенная схема - активация макрофагов
Результаты проведенного электрослияния
Гибридома Результаты ИФА после 1 скрининга (оптическая плотность) Результаты ИФА после клонирования (оптическая плотность) Результаты ИФА после масштабирования (оптическая плотность)
1. 1E6 2,601 2,307 2,116
2. 5C3 2,325 2, 105 1,986
3. 3F11 1,864 1,813 1,743
Иващенко Т. А., Романенко Я.О., Марьин М.А., Карцева А.С., Силкина М.В., Зенинская Н.А., Шемякин И.Г., Фирстова В.В. Оценка эффективности различных адъювантов при получении мышиных моноклональных антител к рецептор-связывающему домену 8-белка SARS-CоV-2
с помощью инактивированных бактерий или вирусов. Рецепторы на поверхности макрофагов взаимодействуют с компонентами адъюванта, что приводит к активации продукции цитокинов, медиатора острого и хронического воспаления ИЛ-1 и фактора роста Т-клеток ИЛ-2 [19]. Таким образом, происходит усиление иммунного ответа и активация Т-клеточного звена иммунной системы. По такому принципу работает ПАФ [20].
Гидроксид алюминия относится к классу минеральных адъювантов и является одним из основных компонентов в составе вакцинных препаратов [21, 22]. Механизм действия адъювантов, в основу которых входит гидроксид алюминия, основан на эффекте депо [23]. Физические свойства гидроксида алюминия позволяют задерживать на поверхности антиген и передавать его длительное время иммунным клеткам. Гидроксид алюминия избирательно стимулирует гуморальный иммунный ответ, а также Т-хелперный иммунный ответ 2-го типа, который сопровождается выработкой ИЛ-4 и ИЛ-5, индуцируя синтез иммуноглобулина IgG1 [24]. Однако по данным литературы известно, что при сочетании гидроксида алюминия с другими адъювантами функция депо антигена заменяется на функцию доставки антигена [25].
Адъювант Magic™ Mouse (Creative Diagnostics, США) на основе нуклеиновых кислот состоит из ДНК микобактерий и содержит большое количество CpG-мотивов, которые активируют врожденную иммунную систему через Toll-подобный рецептор 9 (TLR9) [26], локализующийся преимущественно в эндосомах B-кле-ток и отвечающий за распознавание неметилирован-ных CpG-мотивов ДНК [27, 28]. TLR9 активирует сигнальный каскад, ведущий к продукции провоспали-тельных цитокинов и активации врожденной иммунной системы [29].
Результаты проведенного исследования показали, что различные адъюванты в сочетании с рекомбинантным RBD или RBD-Fc неодинаково повышают иммунный ответ у экспериментальных животных. В нашем исследовании наименьшей активностью обладал адъювант Magic™ Mouse. Такая закономерность была отмечена как при иммунизации рекомбинантным RBD, так и RBD-Fc. В группе животных, иммунизированных RBD или RBD-Fc в сочетании с адъювантом MagicTM Mouse, титр антител составил 1 : 8000 и 1 : 16 000 соответственно. В исследовании 2023 г. T.Y. Kuo и соавт. показали, что иммунизация животных с использованием адъюванта на основе CpG-мотивов также не способствовала индукции высокого иммунного ответа [30].
В группе животных, иммунизированных RBD-Fc, эмульгированным с ПАФ, титр антител составил
■ Литература
1. Yang H., Rao Z. Structural biology of SARS-CoV-2 and implications for therapeutic development. Nat. Rev. Microbiol. 2021; 19 (11): 685-700. DOI: https://doi.org/10.1038/s41579-021-00630-8
2. Гудима Г. О., Хаитов Р.М., Кудлай Д. А., Хаитов М.Р. Молекулярно-иммунологические аспекты диагностики, профилактики и лечения
1 : 32 000, а с рекомбинантным антигеном RBD -1 : 16 000. Недавно Z. Liu и соавт. продемонстрировали, что иммунизация животных антигеном RBD-Fc, эмульгированным с ПАФ, способствует индукции высокого титра специфических антител, который составил 1 : 117 000, но это несопоставимо с нашими результатами [31].
Наиболее выраженный иммунный ответ проявлялся в группе животных, иммунизированных RBD-Fc с гидроксидом алюминия. В 2021 г. Y-S. Sun и соавт. продемонстрировали схему иммунизации мышей, которая в качестве антигена включала RBD-Fc, эмульгированный с адъювантом на основе гидроксида алюминия. Титр антител у животных составил 1 : 100 000 [32]. В нашем исследовании при аналогичной схеме иммунизации титр антител в сыворотке крови составил 1 : 128 000, что является сопоставимым результатом.
На основе полученных нами экспериментальных данных было принято решение о совместном использовании ПАФ и гидроксида алюминия в качестве адъю-вантов для достижения наиболее эффективного иммунного ответа. Результаты наших исследований показали, что совместное использование гидроксида алюминия и ПАФ в сочетании с RBD-Fc заметно усиливало иммунный ответ по сравнению только с гидроксидом алюминия или ПАФ. Данная адъювантная композиция эффективна для стимуляции иммунного ответа с целью получения МкАт к S-белку SARS-COV-2. Использование гидроксида алюминия и ПАФ в сочетании с RBD-Fc позволило достичь наиболее напряженного иммунного ответа, что отражалось в получении у мышей титра антител к RBD 1 : 256 000. Использование спленоцитов этой группы животных для гибридизации методом электрослияния позволило получить 17 гибридом, 3 из них оказались стабильными и продуцировали МкАт к RBD S-белка SARS-CoV-2.
Заключение
Использование для иммунизации мышей RBD, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека, привело к увеличению молекулярной массы антигена в 2 раза, что усилило его иммуногенность. Благодаря использованию RBD-Fc в сочетании одновременно с двумя адъюван-тами - гидроксидом алюминия и ПАФ - удалось достигнуть высоких тиров антител (1 : 256 000) в сыворотке крови мышей через 6 нед после первой иммунизации. Данный подход может быть использован для получения МкАт к RBD различных штаммов SARS-CoV-2, что актуально как для получения препаратов МкАт как для диагностики, так и для лечения COVID-19.
коронавирусной инфекции. Иммунология. 2021; 42 (3): 198-210. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-198-210
3. Gudlma G., Kofiadl I., Shllovskly I., Kudlay D., Khaltov M. Antlvlral Therapy of COVID-19. Int J Mol Scl. 2023 May 1б; 24 (10): 88б7. DOI: 10.3390/^241088б7.
4. Hoffmann M., Kleine-Weber H., Schroeder S., Krüger N., Herrler T., Erichsen S., Schiergens T.S., Herrler G., Wu N.H., Nitsche A., Müller M.A., Drosten C., Pöhlmann S. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 2020; 181 (2): 271-80.e8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.052
5. Zhang H., Penninger J.M., Li Y., Zhong N., Slutsky A.S. Angio-tensin-converting enzyme 2 (ACE2) as a SARS-CoV-2 receptor: molecular mechanisms and potential therapeutic target. Intensive Care Med. 2020; 46 (4): 586-90. DOI: https://doi.org/10.1007/s00134-020-05985-9
6. Huang Y., Yang C., Xu X.F., Xu W., Liu S.W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacol. Sin. 2020; 41 (9): 1141-9. DOI: https://doi.org/10.1038/s41401-020-0485-4
7. Dai L., Zheng T., Xu K., Han Y., Xu L., Huang E., An Y., Cheng Y., Li S., Liu M., Yang M., Li Y., Cheng H., Yuan Y., Zhang W., Ke C., Wong G., Qi J., Qin C., Yan J., Gao G.F. A universal design of betacorona-virus vaccines against COVID-19, MERS, and SARS. Cell. 2020; 182 (3): 722-33.e11. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.035
8. Liu L. Pharmacokinetics of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins. Protein Cell. 2018; 9: 15-32. DOI: https://doi.org/10.1007/ s13238-017-0408-4
9. Martyn J.C., Cardin A.J. Wines B.D., Cendron A., Li S., Mackenzie J., Powell M., Gowans E.J. Surface display of IgG Fc on baculo-virus vectors enhances binding to antigen-presenting cells and cell lines expressing Fc receptors. Arch. Virol. 2009; 154 (7): 1129-38. DOI: https:// doi.org/10.1007/s00705-009-0423-8
10. Antipova N.V., Larionova T.D., Siniavin A.E., Nikiforova M.A., Gushchin V.A., Babichenko I.I., Volkov A.V., Shakhparonov M.I., Pavlyu-kov M.S. Establishment of murine hybridoma cells producing antibodies against spike protein of SARS-CoV-2. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21 (23): 9167. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms21239167
11. Сердюкова Н.С., Радкович Е.В., Родькина И. А., Гуща Г.Н., Халимоненко Ю.А. Применение адъювантов Фрейнда и ISA-70 в схеме иммунизации для получения высокоактивной антисыворотки к ХВК. Картофелеводство. 2022; 28 (1): 97-106.
12. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 года №№ 267 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации».
13. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Санкт-Петербург: 48.
14. Chan K.K., Dorosky D., Sharma P., Abbasi S.A., Dye J.M., Kranz D.M., Herbert, A.S., Procko E. Engineering human ACE2 to optimize binding to the spike protein of SARS coronavirus 2. Science. 2020; 369 (6508): 1261-5. DOI: https://doi.org/10.1126/science.abc0870
15. Güler-Gane G., Kidd S., Sridharan S., Vaughan T.J., Wilkinson T. C., Tigue N.J. Overcoming the refractory expression of secreted recombinant proteins in mammalian cells through modification of the signal peptide and adjacent amino acids. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155340. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155340
16. Силкина М.В., Карцева А.С., Рябко А.К., Марьин М.А., Рома-ненко Я.О., Калмантаева О.В., Хлынцева А.Е., Шемякин И.Г., Дятлов И.А., Фирстова В.В. Оптимизация условий электрослияния для получения гибридом, синтезирующих человеческие моноклональные антитела. Биотехнология. 2021; 37 (2): 77-87.
17. Vogel F.R. Adjuvants in perspective. Dev. Biol. Stand. 1998; 92: 241-8. PMID: 9554280.
18. Wu J.Y., Gardner B.H., Kushner N.N., Pozzi L.A., Kensil C.R., Cloutier P.A., Coughlin R.T., Newman M.J. Accessory cell requirements
for saponin adjuvant-induced class I MHC antigen-restricted cytotoxic T-lymphocytes. Cell. Immunol. 1994; 154 (1): 393-406. DOI: https://doi. org/10.1006/cimm
19. Vogel F.R. Improving vaccine performance with adjuvants. Clin. Infect. Dis. 2000; 30 (suppl 3): 266-70. DOI: https://doi.org/10.1086/313883
20. Freund J., Casals J., Hosmer E.P. Sensitization and antibody formation after injection of tubercle bacilli and paraffin oil. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1937; 37 (3): 509-13. DOI: https://doi.org/10.3181/00379727-37-9625
21. He P., Zou Y., Hu Z. Advances in aluminum hydroxide-based adjuvant research and its mechanism. Hum. Vaccin. Immunother. 2015; 11 (2): 477-88. DOI: https://doi.org/10.1080/21645515.2014.1004026
22. Dai L., Zheng T., Xu K., Han Y., Xu L., Huang E., An Y., Cheng Y., Li S., Liu M., Yang M., Li Y., Cheng H., Yuan Y., Zhang W., Ke C., Wong G., Qi J., Qin C., Yan J., Gao G.F. A universal design of betacorona-virus vaccines against COVID-19, MERS, and SARS. Cell. 2020; 182 (3): 722-33. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.035
23. Hem S.L., Hogenesch H. Relationship between physical and chemical properties of aluminum-containing adjuvants and immunopo-tentiation. Expert Rev. Vaccines. 2007; 6 (5): 685-98. DOI: https://doi. org/10.1586/14760584.6.5.685
24. Gupta R.K. Aluminum compounds as vaccine adjuvants. Adv. Drug Deliv. Rev. 1998; 32: 155-72. DOI: https://doi.org/10.1016/s0169-409x(98)00008-8
25. Алпатова Н.А., Авдеева Ж.И., Лысикова С.Л., Головинская О.В., Гайдерова Л.А. Общая характеристика адъювантов и механизм их действия (часть 1). Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020; 20 (4): 245-56.
26. Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Лысикова С.Л., Гайдерова Л.А., Бондарев В.П. Анализ механизмов развития иммунного ответа при инфицировании вирусом гепатита В и способы повышения эффективности вакцинации. Иммунология. 2021; 42 (4): 403-14. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-403-414
27. Weiner G.J., Liu H.M., Wooldridge J.E., Dahle C.E., Krieg A.M. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997; 94 (20): 10 833-7. DOI: https://doi.org/10.1073/ pnas.94.20.10833
28. Андреев Ю.Ю., Топтыгина А.П. Адъюванты и иммуномодуля-торы в составе вакцин. Иммунология. 2021; 42 (6): 720-9. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-720-729
29. Greenfield E.A. Standard immunization of mice, rats, and hamsters. Cold Spring Harb. Protoc. 2020; 2020 (3). DOI: https://doi.org/10.1101/ pdb.prot100297
30. Kuo T.Y., Lin M.Y., Coffman R.L., Campbell J.D., Traquina P., Lin Y.J., Liu L.T., Cheng J., Wu Y.C., Wu C.C., Tang W.H., Huang C.G., Tsao K.C., Chen C. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Sci. Rep. 2020; 10 (1): 20085. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-77077-z
31. Liu Z., Xu W., Xia S., Gu C., Wang X., Wang Q., Zhou J., Wu Y., Cai X., Qu D., Ying T., Xie Y., Lu L., Yuan Z., Jiang S. RBD-Fc-based COVID-19 vaccine candidate induces highly potent SARS-CoV-2 neutralizing antibody response. Signal Transduct. Target. Ther. 2020; 5 (1): 282. DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-020-00402-5
32. Sun Y.S., Zhou J.J., Zhu H.P., Xu F., Zhao W.B., Lu H.J., Wang Z., Chen, S.Q., Yao P.P., Jiang J.M., Zhou Z. Development of a recombinant RBD subunit vaccine for SARS-CoV-2. Viruses. 2021; 13 (10): 1936. DOI: https://doi.org/10.3390/v13101936
■ References
1. Yang H., Rao Z. Structural biology of SARS-CoV-2 and implications for therapeutic development. Nat. Rev. Microbiol. 2021; 19 (11): 685-700. DOI: https://doi.org/10.1038/s41579-021-00630-8
2. Gudima G.O., Khaitov R.M., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Molecular immunological aspects of diagnostics, prevention and treatment of corona-virus infection. Immunologiya. 2021; 42 (3): 198-210. DOI: https://doi.org/ 10.33029/0206-4952-2021-42-3-198-210 (in Russian)
3. Gudima G., Kofiadi I., Shilovskiy I., Kudlay D., Khaitov M. Antiviral Therapy of COVID-19. Int J Mol Sci. 2023; 24 (10): 8867. DOI: https://doi. org/10.3390/ijms24108867.
4. Hoffmann M., Kleine-Weber H., Schroeder S., Krüger N., Herrler T., Erichsen S., Schiergens T.S., Herrler G., Wu N.H., Nitsche A., Müller M.A., Drosten C., Pöhlmann S. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 2020; 181 (2): 271-80.e8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020. 02.052
5. Zhang H., Penninger J.M., Li Y., Zhong N., Slutsky A.S. Angio-tensin-converting enzyme 2 (ACE2) as a SARS-CoV-2 receptor: molecular mechanisms and potential therapeutic target. Intensive Care Med. 2020; 46 (4): 586-90. DOI: https://doi.org/10.1007/s00134-020-05985-9
Иващенко Т. А., Романенко Я.О., Марьин М.А., Карцева А.С., Силкина М.В., Зенинская Н.А., Шемякин И.Г., Фирстова В.В. Оценка эффективности различных адъювантов при получении мышиных моноклональных антител к рецептор-связывающему домену S-белка SARS-^V-2
6. Huang Y., Yang C., Xu X.F., Xu W., Liu S.W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacol. Sin. 2020; 41 (9): 1141-9. DOI: https://doi.org/10.1038/s41401-020-0485-4
7. Dai L., Zheng T., Xu K., Han Y., Xu L., Huang E., An Y., Cheng Y., Li S., Liu M., Yang M., Li Y., Cheng H., Yuan Y., Zhang W., Ke C., Wong G., Qi J., Qin C., Yan J., Gao G.F. A universal design of betacorona-virus vaccines against COVID-19, MERS, and SARS. Cell. 2020; 182 (3): 722-33.e11. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.035
8. Liu L. Pharmacokinetics of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins. Protein Cell. 2018; 9: 15-32. DOI: https://doi.org/10.1007/ s13238-017-0408-4
9. Martyn J.C., Cardin A.J. Wines B.D., Cendron A., Li S., Mackenzie J., Powell M., Gowans E.J. Surface display of IgG Fc on baculo-virus vectors enhances binding to antigen-presenting cells and cell lines expressing Fc receptors. Arch. Virol. 2009; 154 (7): 1129-38. DOI: https:// doi.org/10.1007/s00705-009-0423-8
10. Antipova N.V., Larionova T.D., Siniavin A.E., Nikiforova M.A., Gushchin V.A., Babichenko I.I., Volkov A.V., Shakhparonov M.I., Pavlyu-kov M.S. Establishment of murine hybridoma cells producing antibodies against spike protein of SARS-CoV-2. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21 (23): 9167. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms21239167
11. Serdyukova N.S., Radkovich E.V., Rodkina I.A., Gushcha G.N., Khalimonenko Yu.A. The use of Freund's adjuvants and ISA-70 in the immunization regimen to obtain highly active antiserum against PVX. Kartofelevodstvo. 2022; 28 (1): 97-106. (in Russian)
12. Order of the Ministry of Health of the Russian Federation from June 19, 2003 № 267 «The rules of laboratory practice in the Russian Federation» (in Russian).
13. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of the European Union on the protection of animals used for scientific purposes. St. Petersburg: 48. (in Russian)
14. Chan K.K., Dorosky D., Sharma P., Abbasi S.A., Dye J.M., Kranz D.M., Herbert, A.S., Procko E. Engineering human ACE2 to optimize binding to the spike protein of SARS coronavirus 2. Science. 2020; 369 (6508): 1261-5. DOI: https://doi.org/10.1126/science.abc0870
15. Güler-Gane G., Kidd S., Sridharan S., Vaughan T.J., Wilkinson T. C., Tigue N.J. Overcoming the refractory expression of secreted recombinant proteins in mammalian cells through modification of the signal peptide and adjacent amino acids. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155340. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155340
16. Silkina M.V., Kartseva A.S., Ryabko A.K., Mar'in M.A., Romanenko Ya.O., Kalmantaeva O.V., Khlyntseva A.E., Shemyakin I.G., Dyatlov I.A., Firstova V.V. Optimization of electrofusion conditions for obtaining hybridomas synthesizing human monoclonal antibodies. Biotekhnologiya. 2021; 37 (2): 77-87. (in Russian)
17. Vogel F.R. Adjuvants in perspective. Dev. Biol. Stand. 1998; 92: 241-8. PMID: 9554280.
18. Wu J.Y., Gardner B.H., Kushner N.N., Pozzi L.A., Kensil C.R., Cloutier P.A., Coughlin R.T., Newman M.J. Accessory cell requirements for saponin adjuvant-induced class I MHC antigen-restricted cytotoxic T-lymphocytes. Cell. Immunol. 1994; 154 (1): 393-406. DOI: https://doi. org/10.1006/cimm
Сведения об авторах
Иващенко Татьяна Александровна - канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4908-2524
Романенко Яна Олеговна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1698-6516
19. Vogel F.R. Improving vaccine performance with adjuvants. Clin. Infect. Dis. 2000; 30 (suppl 3): 266-70. DOI: https://doi.org/10.1086/313883
20. Freund J., Casals J., Hosmer E.P. Sensitization and antibody formation after injection of tubercle bacilli and paraffin oil. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1937; 37 (3): 509-13. DOI: https://doi.org/10.3181/00379727-37-9625
21. He P., Zou Y., Hu Z. Advances in aluminum hydroxide-based adjuvant research and its mechanism. Hum. Vaccin. Immunother. 2015; 11 (2): 477-88. DOI: https://doi.org/10.1080/21645515.2014.1004026
22. Dai L., Zheng T., Xu K., Han Y., Xu L., Huang E., An Y., Cheng Y., Li S., Liu M., Yang M., Li Y., Cheng H., Yuan Y., Zhang W., Ke C., Wong G., Qi J., Qin C., Yan J., Gao G.F. A universal design of betacoronavirus vaccines against COVID-19, MERS, and SARS. Cell. 2020; 182 (3): 722-33. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.035
23. Hem S.L., Hogenesch H. Relationship between physical and chemical properties of aluminum-containing adjuvants and immunopo-tentiation. Expert Rev. Vaccines. 2007; 6 (5): 685-98. DOI: https://doi. org/10.1586/14760584.6.5.685
24. Gupta R.K. Aluminum compounds as vaccine adjuvants. Adv. Drug Deliv. Rev. 1998; 32: 155-72. DOI: https://doi.org/10.1016/s0169-409x(98)00008-8
25. Alpatova N.A., Avdeeva Zh.I., Lysikova S.L., Golovinskaya O.V., Gayderova L.A. General characteristics of adjuvants and their mechanism of action (part 1). Biopreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie. 2020; 20 (4): 245-56. (in Russian)
26. Avdeeva Zh.I., Alpatova N.A., Lysikova S.L., Gayderova L.A., Bondarev VP. Analysis of the mechanisms of development of the immune response in hepatitis B virus infection and ways to improve the effectiveness of vaccination. Immunologiya. 2021; 42 (4): 403-14. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-403-414 (in Russian)
27. Weiner G.J., Liu H.M., Wooldridge J.E., Dahle C.E., Krieg A.M. Immu-nostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997; 94 (20): 10 833-7. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.94.20.10833
28. Andreev Yu.Yu., Toptygina A.P. Adjuvants and immunomodulators in vaccines. Immunologiya. 2021; 42 (6): 720-9. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-720-729 (in Russian)
29. Greenfield E.A. Standard immunization of mice, rats, and hamsters. Cold Spring Harb. Protoc. 2020; 2020 (3). DOI: https://doi.org/10.1101/ pdb.prot100297
30. Kuo T.Y., Lin M.Y., Coffman R.L., Campbell J.D., Traquina P., Lin Y.J., Liu L.T., Cheng J., Wu Y.C., Wu C.C., Tang W.H., Huang C.G., Tsao K.C., Chen C. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Sci. Rep. 2020; 10 (1): 20085. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-77077-z
31. Liu Z., Xu W., Xia S., Gu C., Wang X., Wang Q., Zhou J., Wu Y., Cai X., Qu D., Ying T., Xie Y., Lu L., Yuan Z., Jiang S. RBD-Fc-based COVID-19 vaccine candidate induces highly potent SARS-CoV-2 neutralizing antibody response. Signal Transduct. Target. Ther. 2020; 5 (1): 282. DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-020-00402-5
32. Sun Y.S., Zhou J.J., Zhu H.P., Xu F., Zhao W.B., Lu H.J., Wang Z., Chen, S.Q., Yao P.P., Jiang J.M., Zhou Z. Development of a recombinant RBD subunit vaccine for SARS-CoV-2. Viruses. 2021; 13 (10): 1936. DOI: https://doi.org/10.3390/v13101936
Authors' information
Tatiana A. Ivashchenko - PhD, Researcher of Molecular Biology Lab. of SRCAMB, Rospotrebnadzor, Obolensk, Moscow region, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4908-2524
Yana O. Romanenko - Junior Researcher of Molecular Biology Lab. of SRCAMB, Rospotrebnadzor, Obolensk, Moscow region, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1698-6516
490 Методы
Марьин Максим Александрович - науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотреб-надзора, п. Оболенск, Московская область, Российская Федерация
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0003-0560-915X
Карцева Алена Сергеевна - науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3159-6439
Силкина Марина Владимировна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотреб-надзора, п. Оболенск, Московская область, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5329-2807
Зенинская Наталья Алексеевна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотреб-надзора, п. Оболенск, Московская область, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5388-292X
Шемякин Игорь Георгиевич - д-р биол. наук, проф., зам. дир. по научной работе ФБУН ГНЦ ПМБ Рос-потребнадзора, п. Оболенск, Московская область, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9667-1674
Фирстова Виктория Валерьевна - д-р биол. наук, гл. науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-9898-9894
Maxim A. Marin - Researcher of Molecular Biology Lab. of SRCAMB, Rospotrebnadzor, Obolensk, Moscow region, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0003-0560-915X
Alena S. Kartseva - Researcher of Molecular Biology Lab. of SRCAMB, Rospotrebnadzor, Obolensk, Moscow region, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3159-6439
Marina V. Silkina - Junior Researcher of Molecular Biology Lab. of SRCAMB, Rospotrebnadzor, Obolensk, Moscow region, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5329-2807
Natalya A. Zeninskaya - Junior Researcher of Molecular Biology Lab. of SRCAMB, Rospotrebnadzor, Obolensk, Moscow region, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5388-292X
Igor G. Shemyakin - Dr.Sci., PhD, Prof., Deputy Director on Science, SRCAMB, Rospotrebnadzor, Obolensk, Moscow region, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-9667-1674
Victoria V. Firstova - Dr.Sci, PhD, Principal Researcher of Molecular Biology Lab. of SRCAMB, Rospotrebnadzor, Obolensk, Moscow region, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-9898-9894
