CC BY
10ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Научная статья
https://doi.org/10.36233/0372-9311-342
Двуспиральные РНК — перспективные адъюванты для повышения иммуногенности вакцин
Каплина О.Н.н, Гамалей С.Г., Иванова О.С., Даниленко Е.Д.
Институт медицинской биотехнологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор», Бердск, Россия
Аннотация
Введение. Наиболее эффективным способом предотвращения инфекционных заболеваний является вакцинопрофилактика. Оптимизировать уровень иммунного ответа вакцин призваны адъюванты. Одними из перспективных, но недостаточно изученных адъювантов являются двуспиральные рибонуклеиновые кислоты (дсРНК) из природных источников.
Цель исследования — изучение адъювантной активности дсРНК, полученной из киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, с использованием двух моделей индукции специфического иммунного ответа.
Материалы и методы. В экспериментах использовали субстанцию препарата ридостин с содержанием дсРНК 21,72% (производство ИМБТ ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора). Специфическую иммунную реакцию моделировали с помощью овальбумина (ОВА) или субстанции вакцины «ЭпиВакКорона» (ЭВК). Эксперименты проведены на 200 самках мышей линии BALB/c. Мышам опытных групп вводили двукратно с интервалом 28 дней антиген (ОВА или ЭВК) и адъювант, мышам группы сравнения — только антиген. На 10-е сутки после 2-й иммунизации забирали образцы крови для определения уровня специфических антител методом иммуноферментного анализа. Результаты оценивали, рассчитывая среднегеометрические титры специфических антител к ОВА или ЭВК.
Результаты. Двукратное введение ОВА или ЭВК мышам приводило к появлению в крови животных специфических антител в титрах, зависящих от дозы вводимого антигена. Совместное введение антигена и дсРНК вызывало увеличение интенсивности иммунного ответа. Наиболее высокий стимулирующий эффект дсРНК наблюдался в дозе 100 мкг/мышь при введении мышам, иммунизированным ОВА (1 мкг/мышь), и в дозе 50 мкг/мышь — при иммунизации субстанцией ЭВК (0,25 человеческой дозы). Заключение. Полученные данные свидетельствуют о наличии у субстанции дсРНК адъювантных свойств, что даёт основание рассматривать дсРНК в качестве перспективного адъюванта для пептидных вакцин.
Ключевые слова: двуспиральные РНК, дсРНК, адъювант, овальбумин, субстанция вакцины «ЭпиВакКорона», мыши
Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и международных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Приложением А Европейской конвенции об охране позвоночных животных, используемых для экспериментов и в других научных целях (ETS № 123, Страсбург, 1986), и Директивой 2010/63/Е11 Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Протокол исследования одобрен Биоэтической комиссией ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (протокол № 5 от 01.10.2020).
Благодарность. Коллектив авторов выражает благодарность Е.А. Рыжикову за предоставление субстанции вакцины против новой коронавирусной инфекции СОУЮ-19 «ЭпиВакКорона» (полупродукт, без гидроокиси алюминия) производства ООО «Эпивак».
Источник финансирования. Исследование проведено в рамках выполнения государственного задания ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», тема ГЗ-1/22 «Поиск и фармако-токсикологическое исследование новых вакцинных адъювантов».
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Для цитирования: Каплина О.Н., Гамалей С.Г., Иванова О.С., Даниленко Е.Д. Двуспиральные РНК — перспективные адъюванты для повышения иммуногенности вакцин. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022;99(6):661-668. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-342
© Коллектив авторов, 2022
JOURNAL OF MICROBIOLOGY, EPIDEMIOLOGY AND IMMUNOBIOLOGY. 2022; 99(6)
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-342
ORIGINAL RESEARCHES
Original article
https://doi.org/10.36233/0372-9311-342
Double-stranded RNAs are promising adjuvants for enhancing immunogenicity of vaccines
Olga N. Kaplina^, Svetlana G. Gamaley, Olga S. Ivanova, Elena D. Danilenko
Institute of Medical Biotechnology of the State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector'; Berdsk, Russia
Abstract
Background. The most effective way to prevent infectious diseases is vaccination. Adjuvants contribute to the optimization of the immune response of vaccines. Double-stranded ribonucleic acids (dsRNAs) from natural sources are promising, but insufficiently studied adjuvants.
The aim of the work was to study the adjuvant activity of dsRNA obtained from the killer strain of Saccharomyces cerevisiae using two models of induction of a specific immune response.
Materials and methods. In the experiments, the substance of the drug Ridostin containing dsRNA, 21.72% (produced by Institute of Medical Biotechnology of the State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector"), was used. A specific immune response was modeled using ovalbumin (OVA) or the substance of the EpiVacCorona vaccine (EVC). The experiments were carried out in 200 female BALB/c mice. Mice of the experimental groups were injected twice with antigen and adjuvant together with a 28-day interval, mice of the comparison group — with antigen only. On the 10th day after the second immunization, blood samples were collected to determine the level of specific antibodies using enzyme immunoassay. The results were evaluated by calculation of the average geometric titers of specific antibodies against OVA or EVC.
Results. OVA or EVC administered twice induced the specific antibodies in mice in dose-dependent titers. The combined administration of antigen and dsRNA increased the strength of the immune response. The highest stimulating effect of dsRNA was observed in the dose of 100 pg/mouse administered into mice immunized with OVA (1 pg/mouse) or in the dose of 50 pg/mouse in mice immunized with EVC substance (0.25 of a human dose per mouse).
Conclusion. The data obtained indicate that the substance of dsRNA exerts adjuvant properties, which gives reason to consider dsRNA as a promising adjuvant for peptide vaccines.
Keywords: double-stranded RNA, dsRNA, adjuvant, ovalbumin, EpiVacCorona vaccine, mice
Ethics approval. Authors confirm compliance with institutional and international standards for the use of laboratory animals in accordance with Appendix A of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes (ETS № 123, Strasbourg, 1986), and Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. The research protocol was approved by the Bioethical Commission of the State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" (protocol No. 5, October 01, 2020).
Acknowledgement. The authors express gratitude to E.A. Ryzhikov for providing the substance of the EpiVacCorona vaccine against a new COVID-19 coronavirus infection (semi-product, without aluminum hydroxide, Epivac LLC). Funding sources. This work was carried out as part of the State Assignment 1/22 of The State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" "Search and pharmaco-toxicological study of new vaccine adjuvants". Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
For citation: Kaplina O.N., Gamaley S.G., Ivanova O.S., Danilenko E.D. Double-stranded RNAs are promising adjuvants for enhancing immunogenicity of vaccines. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology = Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2022;99(6):661-668. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-342
Введение
Поиск природных веществ, усиливающих иммунный ответ организма на введение вакцин, разработка и получение синтетических соединений с адъювантыми свойствами имеют огромное значение для обеспечения эффективной вакцинации населения против вирусных агентов разной природы, в том числе особо опасных. Среди перспективных иммунобиологических препаратов, усиливающих иммунный ответ организма на введение вакцин, можно выделить цитокины (интерфероны (ИФН), интер-
лейкины, колониестимулирующие факторы), а также индукторы ИФН. На экспериментальных моделях с использованием разных видов животных показано, что такие цитокины, как ИФН-а, ИФН-у, фактор некроза опухоли-а, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, обладают адъю-вантной активностью при вакцинации против широкого спектра инфекций: ВИЧ, бешенства, гриппа, гепатита, герпеса, клещевого энцефалита [1-7].
Индукторы ИФН — двуспиральные рибонуклеиновые кислоты (дсРНК) в силу своей структу-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ры, близкой к структуре промежуточных продуктов вирусной репликации, способны взаимодействовать с клеточными рецепторами и инициировать внутриклеточные сигнальные каскады, ведущие к продукции ИФН-а/ИФН-ß [8-10]. ИФН активируют множественные ИФН-зависимые механизмы, необходимые для ингибирования репликации вирусов [9, 11-13]. Помимо индукции противовирусных реакций, дсРНК обладают широким спектром им-муномодулирующей активности. Так, они вызывают повышение поглотительной, метаболической и бактерицидной активности клеток-фагоцитов (макрофаги, нейтрофилы), активности натуральных киллеров, созревание и активацию дендритных клеток, что, в свою очередь, приводит к активации CD8+- и CD4+-Т-клеток [14]. Всё это позволяет говорить о том, что дсРНК играют роль своеобразных функциональных линкеров между системами врождённого и приобретённого иммунитета.
На основе синтетических и природных дсРНК создан ряд препаратов для лечения вирусных заболеваний: Ampligen, Hiltonol (США), Полиаденур (Франция), RGC100 (Германия), Ридостин, Полудан (Россия), Ларифан (Латвия). Способность дсРНК, как правило, синтетических, таких как Poly(I:C) и её производные, усиливать иммуногенность вакцин продемонстрирована в экспериментальных условиях при вакцинации против гриппа, в том числе птичьего [15], лихорадок Эбола [16], денге [17], ортопоксви-русных инфекций [18]. Эти данные свидетельствуют о перспективности использования препаратов дсРНК в качестве универсальных адъювантов для усиления иммунного ответа организма на введение вакцин.
Цель исследования — изучение адъювант-ной активности природных дсРНК, полученных из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, с использованием разных моделей индукции специфического иммунного ответа.
Материалы и методы
Препараты
В экспериментах использовали субстанцию препарата ридостин, полученную в отделе разработки технологии и пилотного производства биопрепаратов ИМБТ ГНЦ ВБ «Вектор». Субстанция ридостина (натриевая соль дсРНК, ФСП Р№ 002021/01 — 07 04 20090769-08) представляла собой смесь дрожжевых одноцепочечных и дсРНК с содержанием дсРНК 21,7%.
Для моделирования специфической иммунной реакции были выбраны следующие препараты:
• овальбумин (ОВА; Albumin from chicken egg white lyophilized powder, > 98% (agarose gel electrophoresis), кат. № A5503-5G, «Sigma»);
• субстанция вакцины «ЭпиВакКорона» (ЭВК; ООО «Эпивак», р.п. Кольцово, Россия), со-
держащая пептидные иммуногены, ковалент-но связанные с белком-носителем, без добавления адъюванта гидроокиси алюминия [19, 20]. Концентрация белка в субстанции ЭВК составляла 2,5 мг/мл.
Животные
Исследование проведено на 200 самках мышей линии BALB/c в возрасте 6 нед с массой тела 18-22 г, полученных из питомника ГНЦ ВБ «Вектор». Животные были разделены случайным образом на группы по 6 особей. Содержание и манипуляции с животными осуществляли с соблюдением принципов гуманного отношения к лабораторным животным согласно Приложению А к Европейской конвенции об охране позвоночных животных, используемых для экспериментов и в других научных целях (ETS № 123, Страсбург, 1986). Эксперименты были одобрены Биоэтической комиссией ГНЦ ВБ «Вектор» (ГНЦ ВБ «Вектор»/10-09.2020, утверждён протоколом Биоэтической комиссии № 5 от 01.10.2020).
Способ моделирования иммунного ответа
Для индукции иммунного ответа в I серии экспериментов мышам опытных групп вводили внутримышечно с интервалом 28 сут ОВА в дозах 1, 5, 10 и 20 мкг/мышь и субстанцию дсРНК в дозах 50, 100 или 200 мкг/мышь одновременно с антигеном в суммарном объёме 200 мкл/мышь. На каждую дозу ОВА использовали 3 дозы субстанции дсРНК. Мыши группы сравнения получали инъекции ОВА в тех же дозах в объёме 200 мкл/мышь по аналогичной схеме. Суммарный объём препаратов 200 мкл вводили по 100 мкл в левую и правую задние лапы.
Во II серии экспериментов субстанцию ЭВК вводили животным в дозах, соответствующих 0,25, 0,5, 1,0, и 2,0 человеческой дозы/мышь (1 человеческая доза — 225 ± 45 мкг белка/0,5 мл). Схема введения вакцины, схема и дозы введения субстанции дсРНК соответствовали описанному для экспериментов с ОВА.
Забор крови, получение сывороток крови
Процедура выполнялась на анестезированных с помощью углекислого газа животных [21]. Забор крови у мышей проводили на 10-й день после 2-й иммунизации пастеровской пипеткой из ретроорби-тального синуса в объёме 0,5 мл в чистые пробирки типа Эппендорф. Для формирования сгустка и отделения сыворотки кровь оставляли при комнатной температуре на 1 ч, затем выдерживали в холодильнике при 4 ± 2°С в течение 2 ч. Центрифугирование проводили на центрифуге 5810R («Eppendorf») при температуре 6 ± 2°С со скоростью 1800 об/мин в течение 20 мин. Сыворотки крови хранили при темпе-
JOURNAL OF MICROBIOLOGY, EPIDEMIOLOGY AND IMMUNOBIOLOGY. 2022; 99(6)
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-342
ORIGINAL RESEARCHES
ратуре 6 ± 2°С не более 7 дней. Для более длительного хранения сыворотки замораживали при -20°С.
Эвтаназия животных
После забора крови мышей подвергали эвтаназии путём цервикальной дислокации [22].
Метод определения титра специфических антител
Для оценки уровня специфических антител в сыворотках иммунизированных мышей методом иммуноферментного анализа в лунки 96-луноч-ных планшетов («Grainer Bio-One») вносили по 100 мкл/лунку раствора антигена (ОВА или субстанцию ЭВК) с концентрацией 5 мкг/мл в фосфат-но-солевом буфере (ФСБ), рН 7,4. Антигены сорбировали, инкубируя содержимое лунок планшетов в течение 2 ч при 37°С и 16 ч при 4°С. Раствор с несвязавшимся антигеном удаляли, в лунки вносили по 200 мкл блокирующего буфера (1% раствор бычьего сывороточного альбумина в ФСБ, рН 7,4). Планшеты инкубировали 2 ч при 37°С, затем лунки планшета трехкратно промывали ФСБ с 0,05% Твин-20 по 350 мкл/лунку.
В лунки ряда А вносили по 200 мкл ФСБ, а в лунки рядов В-Н — по 100 мкл ФСБ с 0,05% Твин-20 и 0,5% раствором бычьего сывороточного альбумина. В лунки ряда А с 1 по 12 стрип вносили 12 образцов суммарных сывороток иммунизированных животных (сыворотки от 6 животных каждой группы объединяли в один пул для анализа). Далее проводили титрование в вертикальных рядах планшета. Из ряда А в ряд В и далее последовательно переносили по 25 мкл раствора, содержащего анализируемые сыворотки (5-кратное титрование), с 10-кратным перемешиванием (пипетированием) раствора в лунках каждого ряда перед переносом в следующий ряд. Из ряда Н по 25 мкл раствора отбрасывали. Для контроля конъюгата в 2 лунки (Н11 и Н12) без образцов сывороток вносили буферный раствор для разведения (однократный ФСБ, рН 7,4, с 0,05% Твин-20 и 0,5% раствором БСА). Планшеты инкубировали на горизонтальном термошейкере PST-60HL-4 («BioSan») 1,5 ч при перемешивании со скоростью 310 об/мин и температуре 37°С. После инкубации лунки планшета пятикратно промывали, как описано выше.
Раствор конъюгата антител козы против IgG мыши с пероксидазой хрена («Sigma») в разведении 1 : 4000 в буферном растворе для разведения вносили в лунки по 100 мкл, инкубировали 1 ч на термошейкере (310 об/мин, 37°С). После инкубации четырехкратно промывали, как описано выше. Для проявления цветной реакции в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора хромогена — 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (однокомпонентный готовый раствор, «Sigma-Aldrich»), инкубировали
30 мин при комнатной температуре в защищённом от прямых солнечных лучей месте. Остановку реакции проводили, добавляя в каждую лунку по 50 мкл «стоп-реагента» (1 М раствор серной кислоты). Величину оптической плотности растворов регистрировали при длине волны 450 нм с помощью микропланшетного ридера «Varioskan Lux» («Thermoscientific»).
За титр антител анализируемого образца принимали наибольшее разведение исследуемой сыворотки, значение оптической плотности (ОП) которой превышает значение критической (пограничной) оптической плотности (ОПКр), которое рассчитывали по формуле:
ОПКр = ОПСр Кк х 2
где ОПСр КК — среднее значение ОП контроля конъюгата в лунках Н11 и Н12.
Результаты теста считали положительными, если ОП анализируемой сыворотки превышала ОПКр, отрицательными — если ОП сыворотки меньше или равно ОПКр.
Расчёт среднегеометрического титра (СГТ) для каждой группы проводили с помощью программы «Microsoft Excel» по формуле:
СГТ = УХГ^Х2^Х3/3,
где ХГ, Х2, Х3 — титры суммарной сыворотки для каждой группы мышей в 3 повторах.
Результаты
Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что двукратное введение ОВА в диапазоне доз 1-20 мкг/мышь приводило к появлению в крови животных специфических антител в титрах от 100 до 387 298 в зависимости от дозы вводимого ОВА.
Одновременная иммунизация мышей ОВА и дсРНК в дозах 50, 100 или 200 мкг/мышь приводила к усилению иммунного ответа на антиген. Наибольший прирост титров антител наблюдался при введении дсРНК мышам, иммунизированным наименьшей дозой ОВА — 1 мкг/мышь (табл. 1). Эффект стимуляции возрастал при увеличении дозы дсРНК с 50 до 100 мкг/мышь: среднегеометрические титры повышались с 689 731 до 1 678 033. Дальнейшее повышение дозы препарата дсРНК к увеличению показателя не приводило.
Результаты оценки уровня гуморального иммунного ответа у мышей, иммунизированных субстанцией вакцины ЭВК без адъюванта гидроокиси алюминия индивидуально или в сочетании с препаратом дсРНК, представлены в табл. 2. Иммунизация мышей субстанцией ЭВК в интервале от 0,25 до 2 человеческих доз (56,25-450 мкг белка на мышь) вызывала дозозависимую наработку специфических антител со среднегеометрическими титрами от
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 1. Показатели СГТ специфических антител к ОВА в сыворотке крови мышей после двукратной иммунизации ОВА или совместно ОВА и дсРНК
Table 1. Average geometric titers of specific antibodies against OVA in the blood serum of mice after a two-time immunization with OVA, or OVA plus dsRNA
ОВА, мкг/мышь OVA, jg/mouse СГТ после введения ОВА AGT after administration of OVA СГТ после введения ОВА и дсРНК (мкг/мышь) AGT after administration of OVA and dsRNA (|jg/mouse)
50 100 200
СГТ|AGT N СГТ|AGT N СГТ|AGT N
1 100 689 731 6897 1 678 033 16 780 717 879 7179
5 75 000 2 363 331 32 3 881 968 52 2 791 385 37
10 387 298 2 281 771 6 2 727 026 7 3 096 840 8
20 134 164 5 417 841 40 4 454 890 33 3 807 556 28
Примечание. Здесь и в табл. 2: N — кратность нарастания титров антител к ОВА в сыворотке крови мышей, иммунизированных ОВА в сочетании с дсРНК, по сравнению с показателем после введения только ОВА.
Note. Here and in the Table 2: AGT — average geometric titer of specific antibodies against OVA; N — multiplicity of titers of antibodies against OVA in the blood serum of mice immunized with OVA combined with dsRNA compared to administration of OVA alone.
Таблица 2. Показатели СГТ специфических антител к субстанции ЭВК в сыворотке крови мышей после двукратной иммунизации субстанцией ЭВК или совместно субстанцией ЭВК и дсРНК
Table 2. Average geometric titers of specific antibodies against EVC substance in the blood serum of mice after a two-time immunization with EVC substance, or EVC substance plus dsRNA
Доза ЭВК, мкг/мышь Dose of EVC, |jg/mouse
СГТ после введения ЭВК AGT after administration of EVC
СГТ после введения ЭВК и дсРНК (мкг/мышь) AGT after administration of EVC and dsRNA (jig/mouse)
50 100 200
СГТ|AGT N СГТ|AGT N СГТ|AGT N
56,25 112,5 225 450
14 421 73 294 238 110 776 808
7 540 406 4 933 246 3455 211 4 817 368
523 67 15 6
6 192 898 3 142 056 6 052 490 3 236 631
429 43 25 4
6 641 096
6 402 895
7 768 081 7 802 453
461 87 33 10
14 421 до 776 808. Совместное введение субстанции ЭВК и дсРНК приводило к увеличению интенсивности иммунного ответа. Наиболее высоким стимулирующий эффект дсРНК был в наименьшей из исследованных доз (50 мкг/мышь) при введении мышам, иммунизированным наименьшей дозой субстанции ЭВК (0,25 человеческой дозы/мышь).
Обсуждение
Эффективность вакцинного адъюванта в значительной степени зависит от типа вакцины, особенностей специфической иммунной реакции, которая формируется под её воздействием, и механизма действия самого адъюванта [23, 24]. Несмотря на то что любая иммунизация стимулирует развитие как гуморальной, так и клеточной иммунной реакции, существуют вакцины, которые воздействуют преимущественно на тот или иной тип иммунного ответа. И успех в выборе адъюванта в значительной степени определяется тем, способно ли данное вещество модулировать именно это критическое звено иммунитета.
В настоящее время получен значительный пул данных, описывающих особенности иммуномоду-
лирующего действия дсРНК — как синтетических, так и природных [25]. Предпринимались неоднократные и вполне успешные попытки использования синтетической дсРНК Poly(I:C) и её производных для усиления иммуногенности разного типа вакцин [26, 27]. При этом мало что известно относительно адъювантных свойств дсРНК, полученных биотехнологическими методами [25].
Одной из моделей, которые в настоящее время используются для изучения адъювантных свойств препаратов, является модель специфической иммунной реакции, индуцированной введением антигена ОВА. W. Zhang и соавт. использовали эту модель для подтверждения усиления гуморального иммунного ответа под действием фукоидана, полученного из морских водорослей Macrocystis pyrifera [28]. Повышение специфического иммунного ответа животных на ОВА, сопоставимое с эффектом гидроокиси алюминия, при включении в состав иммунных композиций экзополисахари-дов морских бактерий описано Т.А. Кузнецовой и соавт. [29]. Полученные результаты позволили авторам обеих публикаций сделать вывод о том, что исследованные препараты могут быть перспектив-
ными в качестве эффективных вакцинных адъю-вантов [28, 29].
Результаты нашего исследования подтверждают тот факт, что препарат дсРНК способен многократно усиливать гуморальный иммунный ответ на ОВА и, следовательно, может быть использован для снижения прививочной дозы пептидных вакцин, основным механизмом действия которых является стимуляция 1Ъ2-иммунного ответа.
Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» была разработана вакцина на основе пептидных антигенов для профилактики СОУГО-19 «ЭпиВакКорона», в которой использован классический адъювант гидроксид алюминия [19]. Известно, что данный адъювант, несмотря на его широкое распространение, имеет ряд существенных недостатков. К ним можно отнести, в частности, то, что гидроксид алюминия стимулирует преимущественно гуморальное звено иммунитета и оказывает слабое воздействие на клеточный ответ, а также может вызывать развитие местной кожной реакции разной степени выраженности [23].
Для того чтобы выяснить возможность обеспечения высокой иммуногенности вакцины без побочных реакций за счёт использования в качестве адъюванта дсРНК, была использована мышиная модель, где вместо антигена ОВА использовали субстанцию (полупродукт) вакцины «ЭпиВакКо-рона». Исследование показало, что иммуногенные свойства субстанции ЭВК были выше по сравнению с иммуногенными свойствами ОВА, но как в том, так и другом случае наблюдался эффект усиления иммунного ответа под действием дсРНК. Общей закономерностью являлось также то, что в обоих случаях стимулирующий эффект был тем более выраженным, чем ниже была доза антигена. Аналогичные дозовые зависимости наблюдали авторы работ [30, 31], показавшие, что наиболее демонстративно иммуноадъювантное действие препаратов рекомбинантных цитокинов человека на интенсивность иммунного ответа при вакцинации в случае использования малых доз антигена. Меньшие дозы антигена, используемые в сочетании с адъювантами, вызывали иммунный ответ, сопоставимый с ответом на большие дозы антигена, вводимые без иммуноадъювантов. Важно подчеркнуть, что на основании этих данных можно заключить, что введение адъювантов, аналогичных дсРНК, позволит существенным образом снизить эффективную прививочную дозу вакцин.
Полученные данные являются основанием для заключения о том, что включение препарата дсРНК в состав вакцинных композиций либо сочетанное их использование позволит снизить эффективную дозу вакцин на основе белковых и пептидных антигенов, одним из основных механизмов действия которых является стимуляция гуморального звена иммунного ответа.
JOURNAL OF MICROBIOLOGY, EPIDEMIOLOGY AND IMMUNOBIOLOGY. 2022; 99(6)
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-342
ORIGINAL RESEARCHES
Заключение
Результаты проведённого исследования свидетельствуют о наличии у препарата дрожжевой дсРНК адъювантных свойств, что позволяет рассматривать данный препарат в качестве потенциального адъюванта при создании пептидных вакцин.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Rizza P., Capone I., Moretti F., Proietti E., Belardelli F. IFN-a as a vaccine adjuvant: recent insights into the mechanisms and perspectives for its clinical use. Expert. Rev. Vaccines. 2011; 10(4): 487-98. https://doi.org/10.1586/erv.11.9
2. Zhang C., Wang B., Wang M. GM-CSF and IL-2 as adjuvant enhance the immune effect of protein vaccine against foot-and-mouth disease. Virol. J. 2011; 8: 7.
https://doi.org/10.1186/1743-422X-8-7
3. Алпатова Н.А., Авдеева Ж.И., Мовсесянц А.А., Медуни-цын Н.В. Экспериментальное изучение роли цитокинов с целью повышения иммуногенной активности антирабиче-ских вакцин. Иммунология. 2018; 39(2-3): 143-51. https://doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-143-151
4. Алпатова Н.А., Авдеева Ж.И., Никитина Т.Н., Медуни-цын Н.В. Адъювантные свойства цитокинов при вакцинации (Обзор). Химико-фармацевтический журнал. 2019; 53(11): 3-8. https://doi.org/10.30906/0023-1134-2019-53-11-3-8
5. Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Лысикова С.Л., Гайдеро-ва Л.А., Бондарев В.П. Анализ механизмов развития иммунного ответа при инфицировании вирусом гепатита В и способы повышения эффективности вакцинации. Иммунология. 2021; 42(4): 403-14.
https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-403-414
6. Ma H., Lim T.H., Leerapun A., Weltman M., Jia J., Lim Y.S., et al. Therapeutic vaccine BRII-179 restores HBV-specific immune responses in patients with chronic HBV in a phase Ib/ IIa study. JHEP Rep. 2021; 3(6): 100361. https://doi.org/10.1016/jjhepr.2021.100361
7. Fan J., Jin S., Gilmartin L., Toth I., Hussein W.M., Stephenson R.J. Advances in Infectious Disease Vaccine Adjuvants. Vaccines. 2022; 10(7): 1120. https://doi.org/10.3390/vaccines10071120
8. Randall R.E., Goodbourn S. Interferons and viruses: an interplay between induction, signalling, antiviral responses and virus countermeasures. J. Gen. Virol. 2008; 89(Pt. 1): 1-47. https://doi.org/10.1099/vir.0.83391-0
9. Devasthanam A.S. Mechanisms underlying the inhibition of interferon signaling by viruses. Virulence. 2014; 5(2): 270-7. https://doi.org/10.4161/viru.27902
10. Ahmed-Hassan H., Abdul-Cader M.S., Ahmed Sabry M., Hamza E., Sharif S., Nagy E., et al. Double-stranded ribonucleic acid-mediated antiviral response against low pathogenic avian influenza virus infection. Viral. Immunol. 2018; 31(6): 433-46. https://doi.org/10.1089/vim.2017.0142
11. Samuel C.E. Antiviral actions of interferons. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14(4): 778-809. https://doi.org/10.1128/CMR.14.4.778-809.2001
12. Stadler D., Kachele M., Jones A.N., Hess J., Urban C., Schneider J., et al. Interferon-induced degradation of the persistent hepatitis B virus cccDNA form depends on ISG20. EMBO Rep. 2021; 22(6): e49568. https://doi.org/10.15252/embr.201949568
13. Busnadiego I., Fernbach S., Pohl M.O., Karakus U., Huber M., Trkola A., et al. Antiviral activity of type I, II, and III interferons counterbalances ACE2 inducibility and restricts SARS-CoV-2. mBio. 2020; 11(5): e01928-20. https://doi.org/10.1128/mBio.01928-20
14. Bianchi F., Pretto S., Tagliabue E., Balsari A., Sfondrini L. Exploiting poly(I:C) to induce cancer cell apoptosis. Cancer
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Biol. Ther. 2017; 18(10): 747-56. https://doi.org/10.1080/15384047.2017.1373220
15. Scallan C.D., Tingley D.W., Lindbloom J.D., Toomey J.S., Tucker S.N. An adenovirus-based vaccine with a double-stranded RNA adjuvant protects mice and ferrets against H5N1 avian influenza in oral delivery models. Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20(1): 85-94. https://doi.org/10.1128/CVI.00552-12
16. Martins K.A., Steffens J.T., van Tongeren S.A., Wells J.B., Bergeron A.A., Dickson S.P., et al. Toll-like receptor agonist augments virus-like particle-mediated protection from Ebola virus with transient immune activation. PLoS One. 2014; 9(2): e89735. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0089735
17. Uppu D.S.S.M., Turvey M.E., Sharif A.R.M., Bidet K., He Y., Ho V., et al. Temporal release of a three-component protein subunit vaccine from polymer multilayers. J. Control. Release. 2020; 317: 130-41.
https://doi.org/10.1016/jjconrel.2019.11.022
18. Wolferstätter M., Schweneker M., Späth M., Lukassen S., Klingenberg M., Brinkmann K., et al. Recombinant modified vaccinia virus Ankara generating excess early double-stranded RNA transiently activates protein kinase R and triggers enhanced innate immune responses. J. Virol. 2014; 88(24): 14396-411. https://doi.org/10.1128/JVI.02082-14
19. Рыжиков А.Б., Рыжиков Е.А., Богрянцева М.П., Гаврило-ва Е.В., Даниленко Е.Д., Иматдинов И.Р. и др. Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирус-ной инфекции COVID-19 с использованием пептидных им-муногенов. Патент РФ № 2738081 C1; 2020.
20. Рыжиков А.Б., Рыжиков Е.А., Богрянцева М.П., Даниленко Е.Д., Иматдинов И.Р., Нечаева Е.А. и др. Иммуногенные и протективые свойства пептидной вакцины против SARS-CoV-2. Вестник Российской академии медицинских наук. 2021; 76(1): 5-19. https://doi.org/10.15690/vramn1528
21. Дьякон А.В., Хрыкина И.С., Хегай А.А., Дьяченко И.А., Мурашев А.Н., Ивашев М.Н. Метод забора крови у животных. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2013; 11(2): 84-5.
22. Рыбакова А.В., Макарова М.Н. Методы эвтаназии лабораторных животных в соответствии с Европейской Директивой 2010/63. Международный вестник ветеринарии. 2015; (2): 96-107.
23. Алпатова Н.А., Авдеева Ж.И., Лысикова С.Л., Головинская О.В., Гайдерова Л.А. Общая характеристика адъювантов и механизм их действия (часть 1). БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020; 20(4): 245-56. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-4-245-256
24. Firdaus F.Z., Skwarczynski M., Toth I. Developments in vaccine adjuvants. Methods Mol. Biol. 2022; 2412: 145-78. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1892-9_8
25. Даниленко Е.Д., Белкина А.О., Сысоева Г.М. Создание лекарственных препаратов на основе высокополимерных двуспиральных РНК для противовирусной и противоопухолевой терапии. Биомедицинская химия. 2019; 65(4): 277-93. https://doi.org/10.18097/PBMC20196504277
26. Martins K.A., Bavari S., Salazar A.M. Vaccine adjuvant uses of poly-IC and derivatives. Expert. Rev. Vaccines. 2015; 14(3): 447-59. https://doi.org/10.1586/14760584.2015.966085
27. Jeong S.K., Heo Y.K., Jeong J.H., Ham S.J., Yum J.S., Ahn B.C., et al. COVID-19 subunit vaccine with a combination of TLR1/2 and TLR3 agonists induces robust and protective immunity. Vaccines (Basel). 2021; 9(9): 957. https://doi.org/10.3390/vaccines9090957
28. Zhang W., Oda Т., Yu Q., Jin J^. Fucoidan from Macrocystis pyrifera has powerful immune-modulatory effects compared to three other fucoidans. Mar. Drugs. 2015; 13(3): 1084-104. https://doi.org/10.3390/mdl3031084
29. Кузнецова Т.А., Персиянова Е.В., Иванушко Л.А., Смолина Т.П., Гажа А.К., Кокоулин М.С. и др. Иммуноадъю-
вантная активность экзополисахаридов морских бактерий в условиях нормы и иммуносупрессии. Антибиотики и химиотерапия. 2021; 66(5-6): 17-22. https://doi. org/10.24411/0235-2990-2021-66-5-6-17-22
30. Никитина Т.Н., Авдеева Ж.И. Иммуноадъювантное действие цитокинов при иммунизации животных вакциной против гепатита В. Цитокины и воспаление. 2009; 8(1): 28-31.
31. Petrovsky N., Aguilar J.C. Vaccine adjuvants: current state and future trends. Immunol. Cell Biol. 2004; 82(5): 488-96. https:// doi.org/10.1111/j.0818-9641.2004.01272.x
REFERENCES
1. Rizza P., Capone I., Moretti F., Proietti E., Belardelli F. IFN-a as a vaccine adjuvant: recent insights into the mechanisms and perspectives for its clinical use. Expert. Rev. Vaccines. 2011; 10(4): 487-98. https://doi.org/10.1586/erv. 11.9
2. Zhang C., Wang B., Wang M. GM-CSF and IL-2 as adjuvant enhance the immune effect of protein vaccine against foot-and-mouth disease. Virol. J. 2011; 8: 7. https://doi.org/10.1186/1743-422X-8-7
3. Alpatova N.A., Avdeeva Zh.I., Movsesyants A.A., Medunit-syn N.V. Experimental study of the role of cytokines to improve immunogenous activity of antirabic vaccines. Immunologiya. 2018; 39(2-3): 143-51. https://doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-143-15 (in Russian)
4. Alpatova N.A., Avdeeva Zh.I., Nikitina T.N., Medunitsyn N.V. Adjuvant properties of cytokines in vaccination. Khi-miko-farmatsevticheskiy zhurnal. 2019; 53(11): 3-8. https://doi. org/10.30906/0023-1134-2019-53-11-3-8 (in Russian)
5. Avdeeva Zh.I., Alpatova N.A., Lysikova S.L., Gayderova L.A., Bondarev V.P. Analysis of the mechanisms of development of the immune response in hepatitis b virus infection and ways to improve the effectiveness of vaccination. Immunologiya. 2021; 42(4): 403-14. https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-403-414 (in Russian)
6. Ma H., Lim T.H., Leerapun A., Weltman M., Jia J., Lim Y.S., et al. Therapeutic vaccine BRII-179 restores HBV-specific immune responses in patients with chronic HBV in a phase Ib/IIa study. JHEPRep. 2021; 3(6): 100361. https://doi.org/10.1016/j. jhepr.2021.100361
7. Fan J., Jin S., Gilmartin L., Toth I., Hussein W.M., Stephenson R.J. Advances in Infectious Disease Vaccine Adjuvants. Vaccines. 2022; 10(7): 1120. https://doi.org/10.3390/vac-cines10071120
8. Randall R.E., Goodbourn S. Interferons and viruses: an interplay between induction, signalling, antiviral responses and virus countermeasures. J. Gen. Virol. 2008; 89(Pt. 1): 1-47. https://doi.org/10.1099/vir0.83391-0
9. Devasthanam A.S. Mechanisms underlying the inhibition of interferon signaling by viruses. Virulence. 2014; 5(2): 270-7. https://doi.org/10.4161/viru.27902
10. Ahmed-Hassan H., Abdul-Cader M.S., Ahmed Sabry M., Ham-za E., Sharif S., Nagy E., et al. Double-stranded ribonucleic acid-mediated antiviral response against low pathogenic avian influenza virus infection. Viral. Immunol. 2018; 31(6): 433-46. https://doi.org/10.1089/vim.2017.0142
11. Samuel C.E. Antiviral actions of interferons. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14(4): 778-809. https://doi.org/10.1128/CMR.14.4.778-809.2001
12. Stadler D., Kächele M., Jones A.N., Hess J., Urban C., Schneider J., et al. Interferon-induced degradation of the persistent hepatitis B virus cccDNA form depends on ISG20. EMBO Rep. 2021; 22(6): e49568. https://doi.org/10.15252/embr.201949568
13. Busnadiego I., Fernbach S., Pohl M.O., Karakus U., Huber M., Trkola A., et al. Antiviral activity of type I, II, and III interferons
counterbalances ACE2 inducibility and restricts SARS-CoV-2. mBio. 2020; 11(5): e01928-20. https://doi.org/10.1128/mBio.01928-20
14. Bianchi F., Pretto S., Tagliabue E., Balsari A., Sfondrini L. Exploiting poly(I:C) to induce cancer cell apoptosis. Cancer Biol. Ther. 2017; 18(10): 747-56. https://doi.org/10.1080/15384047.2017.1373220
15. Scallan C.D., Tingley D.W., Lindbloom J.D., Toomey J.S., Tucker S.N. An adenovirus-based vaccine with a double-stranded RNA adjuvant protects mice and ferrets against H5N1 avian influenza in oral delivery models. Clin. Vaccine Immunol. 2013; 20(1): 85-94. https://doi.org/10.1128/CVI.00552-12
16. Martins K.A., Steffens J.T., van Tongeren S.A., Wells J.B., Bergeron A.A., Dickson S.P., et al. Toll-like receptor agonist augments virus-like particle-mediated protection from Ebola virus with transient immune activation. PLoS One. 2014; 9(2): e89735. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0089735
17. Uppu D.S.S.M., Turvey M.E., Sharif A.R.M., Bidet K., He Y., Ho V., et al. Temporal release of a three-component protein subunit vaccine from polymer multilayers. J. Control. Release. 2020; 317: 130-41. https://doi.org/10.1016/jjconrel.2019.11.022
18. Wolferstätter M., Schweneker M., Späth M., Lukassen S., Klingenberg M., Brinkmann K., et al. Recombinant modified vaccinia virus Ankara generating excess early double-stranded RNA transiently activates protein kinase R and triggers enhanced innate immune responses. J. Virol. 2014; 88(24): 14396-411. https://doi.org/10.1128/JVI.02082-14
19. Ryzhikov A.B., Ryzhikov E.A., Bogryantseva M.P., Gavrilo-va E.V., Danilenko E.D., Imatdinov I.R. et al. Peptide immunogens and a vaccine composition against coronavirus infection COVID-19 using peptide immunogens. Patent RF № 2738081 C1; 2020. (in Russian)
20. Ryzhikov A.B., Ryzhikov E.A., Bogryantseva M.P., Danilenko E.D., Imatdinov I.R., Nechaeva E.A., et al. Immunogenicity and protectivity of the peptide vaccine against SARS-COV-2. Vestnik Rossiyskoy akademii meditsinskikh nauk. 2021; 76(1): 5-19. https://doi.org/10.15690/vramn1528 (in Russian)
21. Dyakon A.V., Khrykina I.S., Khegai A.A., Dyachenko I.A., Mu-rashev A.N., Ivashev M.N. Blood sampling method from animals. Mezhdunarodnyy zhurnalprikladnykh i fundamental'nykh issledovaniy. 2013; 11(2): 84-5. (in Russian)
Информация об авторах
Каплина Ольга Николаевнам — с.н.с. отдела биологических исследований Института медицинской биотехнологии ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Бердск, Россия, kaplina_on@vector.nsc.ru, https://orcid.org/0000-0001-8624-4767 Гамалей Светлана Георгиевна — зав. отделом биологических исследований Института медицинской биотехнологии ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Бердск, Россия, https://orcid.org/0000-0002-7441-333X
Иванова Ольга Сергеевна — к.б.н., н.с. отдела разработки технологий и пилотного производства биопрепаратов Института медицинской биотехнологии ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Бердск, Россия, https://orcid.org/0000-0002-4242-3600 Даниленко Елена Дмитриевна — к.б.н., директор Института медицинской биотехнологии ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Бердск, Россия, https://orcid.org/0000-0001-5026-1602 Участие авторов. Каплина О.Н. — изучение адъювантной активности дсРНК, получение и анализ экспериментальных данных, написание статьи; Гамалей С.Г. — интерпретация результатов, редактирование статьи; Иванова О.С. — получение и характеристика субстанции дсРНК; Даниленко Е.Д. — постановка задачи, окончательное редактирование статьи. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.
Статья поступила в редакцию 11.10.2022; принята к публикации 08.12.2022; опубликована 30.12.2022
JOURNAL OF MICROBIOLOGY, EPIDEMIOLOGY AND IMMUNOBIOLOGY. 2022; 99(6)
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-342
ORIGINAL RESEARCHES
22. Rybakova A.V., Makarova M.N. Methods of euthanasia of laboratory animals, in accordance with European directive 2010/63. Mezhdunarodnyy vestnik veterinarii. 2015; (2): 96-107. (in Russian)
23. Alpatova N.A., Avdeeva Zh.I., Lysikova S.L., Golovinska-ya O.V., Gayderova L.A. General Characteristics of Adjuvants and Their Mechanism of Action (Part 1). BIOpreparaty. Pro-filaktika, diagnostika, lechenie. 2020; 20(4): 245-56. https:// doi.org/10.30895/2221-996X-2020-20-4-245-256 (in Russian)
24. Firdaus F.Z., Skwarczynski M., Toth I. Developments in vaccine adjuvants. Methods Mol. Biol. 2022; 2412: 145-78. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1892-9_8
25. Danilenko E.D., Belkina A.O., Sysoeva G.M. Development of drugs based on high-polymeric double-stranded rna for antiviral and antitumor therapy. Biomeditsinskaya khimiya. 2019; 65(4): 277-93. (in Russian)
https://doi.org/10.18097/PBMC20196504277
26. Martins K.A., Bavari S., Salazar A.M. Vaccine adjuvant uses of poly-IC and derivatives. Expert. Rev. Vaccines. 2015; 14(3): 447-59. https://doi.org/10.1586/14760584.2015.966085
27. Jeong S.K., Heo Y.K., Jeong J.H., Ham S.J., Yum J.S., Ahn B.C., et al. COVID-19 subunit vaccine with a combination of TLR1/2 and TLR3 agonists induces robust and protective immunity. Vaccines (Basel). 2021; 9(9): 957. https://doi.org/10.3390/vaccines9090957
28. Zhang W., Oda T., Yu Q., Jin J.O. Fucoidan from Macrocystis pyrifera has powerful immune-modulatory effects compared to three other fucoidans. Mar. Drugs. 2015; 13(3): 1084-104. https://doi.org/10.3390/mdl3031084
29. Kuznetsova T.A., Persiyanova E.V., Ivanushko L.A., Smolina T.P., Gazha A.K., Kokoulin M.S., et al. Immunoadjuvant activity of marine bacteria exopolysaccharides in normal and immunosuppressive conditions. Antibiotiki i khimioterapiya. 2021; 66(5-6): 17-22. https://doi.org/10.24411/0235-2990-2021-66-5-6-17-22 (in Russian)
30. Nikitina T.N., Avdeeva Zh.I. Adjuvant effect of cytokines during immunization of animals with hepatitis B vaccine. Tsitokiny i vospalenie. 2009; 8(1): 28-31. (in Russian)
31. Petrovsky N., Aguilar J.C. Vaccine adjuvants: current state and future trends. Immunol. Cell Biol. 2004; 82(5): 488-96. https://doi.org/10.1111/j.0818-9641.2004.01272.x
Information about the authors
Olga N. KaplinaM — senior researcher, Department of biological studies, Institute of Medical Biotechnology of the State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Berdsk, Russia, kaplina_on@vector.nsc.ru, https://orcid.org/0000-0001-8624-4767 Svetlana G. Gamaley — Head, Department of biological studies, Institute of Medical Biotechnology of the State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Berdsk, Russia, https://orcid.org/0000-0002-7441-333X
Olga S. Ivanova — Cand. Sci. (Biol.), researcher, Department of development and pilot production of biologicals, Institute of Medical Biotechnology of the State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Berdsk, Russia, https://orcid.org/0000-0002-4242-3600 Elena D. Danilenko — Cand. Sci. (Biol.), director, Institute of Medical Biotechnology of the State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Berdsk, Russia, https://orcid.org/0000-0001-5026-1602
Author contribution. Kaplina O.N. — experimental study on dsRNA's adjuvant activity, acquisition and analysis of experimental data, article drafting; Gamaley S.G. — interpretation of the results, article revising; Ivanova O.S. — obtaining and characterization of dsRNA substance; Danilenko E.D. — aim setting, article final approval. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.
The article was submitted 11.10.2022; accepted for publication 08.12.2022;
published 30.12.2022
