CC BY
41
Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine»
Таким образом, КПС P. nigrifaciens, можетсти-мулировать немедленный неспецифический ответ NKT-клеток, запуская процесс дегрануляции, и регулировать адаптивный иммунный ответ за счет синтеза цитокинов IL-12, TNF-a, IFN-y.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование выполнено без привлечения спонсорских средств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Godfrey D.I., MacDonald H.R., Kronenberg M.M., Smyth M.J., Van Kaer L.NKT cells: what's in a name? Nat. Rev. Immunol. 2004; 4: 231-237. doi:10.1038/ nri1309.
2. Loza M.J, Metelitsa L.S., Perussia B.NKT and T cells: coordinate regulation ofNK-like phenotype and cytokine production. Eur. J. Immunol. 2002; 32: 3453-3462. doi: 10.1002/1521-4141(200212)32:12<3453::AID-IMMU3453>3.0.C0;2-D.
3. Bowman J.P. Bioactive compound synthetic capacity and ecological significance of marine bacterial genus Pseudoalteromonas. Mar. Drugs. 2007; 5: 220-241. doi:10.3390/md504220.
4. Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н. Изменение уровня экспрессии молекул адгезии клеток врожденного иммунитета человека гликополи-мерами морских бактерий // Антибиотики и химиотерапия. 2015; 60(34): 37-41.
5. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков А.А. и др. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonashaloplanktis KMM156 // Биоорган. химия. 1993; 19 (3): 327-336.
6. Foster B, Prussin C, Liu F, Whitmire J.K, Whit-ton J.L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry Curr. Protoc. Immunol. 2007; 6: Unit 6.24. doi: 10.1002/0471142735.im0624s78.
7. Colucci F., Caligiuri M.A, Di Santo J.P. What does it take to make a natural killer? Nat. Rev. Immunol. 2003; 3(5): 413-425. doi:10.1038/nri1088.
8. Betts M R., Koup R.A. Detection of T-cell degranulation: CD107a and b. Methods Cell Biol. 2004; 75: 497-512. doi: 10.1016/S0091-679X(04)75020-7.
9. Matsuda J.L., Gapin L., Baron J.L., Sidobre S., Stetson D.B, Mohrs M., Locksley R.M, Kronenberg M. Mouse V alpha 14i natural killer T cells are resistant to cytokine polarization in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 8395-8400. doi:10.1073/ pnas.1332805100.
Сведения об авторе
Смолина Татьяна Павловна - к.б.н., в.н.с., НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; e-mail: tsmol@mail.ru.
© Коллектив авторов, 2017 г doi: 10.5281/zenodo.820664
Удк 612.017.1; 615.371; 577.114; 578.891
Е.В. Персиянова1, Т.А. Кузнецова1, А.Л. Шутикова1, С.П. Ермакова2
усиление иммунного ответа к поверхностному антигену гепатита в Под влиянием ФУкоидАнов ИЗ бурой водоросли FUCUS EVANESCENS
1 ФГБНУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», Владивосток
2 Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток
Проведена оценка влияния сульфатированных полисахаридов (фукоидана и его модифицированных образцов) из бурой водоросли Fucus evanescens на специфический иммунный ответ мышей к поверхностному антигену гепатита В (HBs-антигену). Установлено, что все образцы фукоидана, различающиеся по степени очистки и молекулярной массе, усиливают иммуногенность рекомбинантного HBs-антигена при иммунизации мышей линии BALB/c. Адъювантное действие фукоиданов сопоставимо с действием гидроксида алюминия.
Ключевые слова: иммунный ответ, профилактические вакцины, фукоиданы, адъюванты, гепатит В.
E.V. Persiyanova1, T.A. Kuznetsova1, A.L. Shutikova1, S.P. Ermakova2
THE INCREASING oF IMMUNE RESPoNSE TO SURFACE ANTIGEN oF HEPATITIS B
UNDER FUCoidan from FUCUS EVANESCENS influence
1 G.P. Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia
2 G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Vladivostok, Russia
The authors investigated the effect of sulfated polysaccharides, fucoidans, from brown algae Fucus evanescens on the specific immune response of mice to hepatitis B. It was found that fucoidans with different degrees of
HEALTH. MEDICAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 71
• Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»
purification and molecular weight enhanced the immunogenicity of recombinant HBs antigen when co-administered in BALB/c mice. Adjuvant effect of fucoidans is comparable to the action of aluminum hydroxide.
Keywords: immune response, prophylactic vaccines, fucoidans, adjuvant, hepatitis B.
Введение
Вирус гепатита В (НВУ) представляет серьезную глобальную проблему здравоохранения, поскольку является агентом распространенной вирусной инфекции, вызывающей острую и хроническую болезнь печени. Современная лабораторная диагностика, основанная на выявлении поверхностного антигена гепатита В (HBs-АГ) в течение не менее 6 месяцев, свидетельствует о том, что около 250 миллионов человек хронически инфицированы НВУ. Более 500 тыс. человек ежегодно умирают от этого заболевания. В настоящее время специфического лечения гепатита В, направленного на полную элиминацию вируса, не существует, поэтому меры ВОЗ направлены на предотвращение заболевания с помощью безопасной и эффективной вакцинации, улучшения качества вакцин [1].
Конструирование новых вакцинных композиций, содержащих иммуноадъювантное соединение, а, следовательно, и поиск новых видов адъювантов для усиления иммунного ответа на антиген (АГ) является актуальным и перспективным направлением современной иммунобиологии. Согласно последним исследованиям, адъюванты являются незаменимыми для развития В- и Т-клеточного ответа, поскольку стимулируют антиген-презен-тирующие клетки, процессирование и презентацию антигенов, миграцию в лимфатические узлы, секретирование цитокинов [2]. В настоящее время адъювантов, утвержденных в составе вакцин для людей, не много. Большинство вакцин в качестве адъюванта содержат соединения алюминия, механизм действия которых заключается в адсорбции и создании депо АГ, но такие адъюванты имеют недостатки: направленность в сторону гуморального ТЪ2 ответа, относительно кратковременное образование антител (АТ), способность провоцировать побочные эффекты [3].
Природные полисахаридные соединения с адъю-вантными свойствами вызывают большой интерес исследователей [4]. Фукоиданы - сульфатированные полисахариды (ПС) из бурых водорослей, являются нетоксичными, биодеградируемыми, безопасными и биосовместимыми веществами, проявляют широкий спектр биологической активности, в том числе иммуноадъювантное действие [4, 5].
Целью исследования явилось установление влияния фукоиданов из бурой водоросли Е evanescens на активность синтеза специфических антител у мышей при совместном введении с поверхностным антигеном вируса гепатита В.
Материалы и методы
Исследования проводили на 10 недельных мышах-самцах линии BALB/c массой 16-18 г из питомника «Пущино». Животные содержались в контролируемых температурных, световых условиях, со стандартным питанием. Работа выполнена с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 1986).
Иммунизацию животных проводили двукратно с интервалом в 2 недели путем подкожной инъекции 0,5 мл вакцинной композиции. Вакцинные композиции содержали HBs-АГ - рекомбинантный поверхностный белок вируса гепатита В (Abcam Limited, Великобритания) и адъювант. В качестве адъюван-тов использовали фукоиданы, выделенные из бурой водоросли F. evanescens: ПС 1 - нативный фукоидан в комплексе с полифенолами, молекулярной массой (м.м.) 130-430 кДа [6]; ПС 2 - фукоидан, освобожденный от полифенолов, м.м. 130-400 кДа [7]; ПС 3 - продукт ферментативного гидролиза фукоида-на, м.м. около 9 кДа [8]. Гель гидроксида алюминия (Brenntag Biosector, Дания) использовали как адъю-вант сравнения. Фукоиданы и АГ в отдельности растворяли в фосфатно-солевом буфере (20mM PBS). Иммунизирующая доза каждой вакцинной композиции содержала: 1 мкг HBs-АГ и 0,2 мг фукоидана/ либо 100 мкг геля гидроксида алюминия.
Было сформировано пять групп животных по 12 мышей в каждой, согласно составу вакцинной композиции: 1 - ПС 1 и АГ; 2 - ПС 2 и АГ; 3 - ПС 3 и АГ; 4 - гель гидроксида алюминия и АГ; 5 - АГ (контроль).
Забор крови осуществляли у мышей всех групп через 14 и 28 дней после последней иммунизации. В сыворотках крови от каждого животного определяли суммарные IgG антитела к поверхностному АГ вируса гепатита В (HBs-АТ) методом количественного твердофазного сэндвич-ИФА с использованием коммерческой тест-системы (Blue Gene Biotech, Китай). Учет результатов проводили с помощью микропланшетного ридера Labsystems Multiskan RS (Финляндия), оптическую плотность измеряли при 450 нм. Концентрацию HBs-АТ в каждом образце интерполировали согласно калибровочной кривой и выражали в нг/мл.
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программы «Statistica-7». Критическое значение уровня значимости принималось равным 5% (р < 0,05).
Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine» •
Результаты и обсуждение
Как представлено на рис., все вакцинные композиции к 14 суткам после двукратной иммунизации индуцировали выработку специфических IgG к HBs-АГ. Среди исследуемых полисахаридов фуко-идан без полифенолов статистически значимо уси-
ливал антителообразование у мышей в группе 2 по сравнению с контрольной группой. Концентрация HBs-АТ у животных 2 группы на 30,6% превышала таковую в контроле (р<0,05). Аналогичное действие показала композиция в группе 4, где в качестве адъ-юванта выступал гель гидроксида алюминия.
Рис. Уровень специфических антител к HBs-антигену у мышей, иммунизированных различными адъювированными композициями. Мышей вакцинировали дважды с интервалом в 2 недели композициями, содержащими 1 мкг HBs-АГ и адъювант: 1 - нативный фукоидан с полифенолами; 2 - фукоидан, освобожденный от полифенолов; 3 - низкомолекулярный фукоидан (9 кДа); 4 - гель гидроксида
алюминия; 5 - без адъюванта (контрольная группа). Для определения количества антител у мышей (п=6) каждой группы отбирали сыворотки через 14 сут и 28 сут после повторной иммунизации. Показатели представлены в виде средних значений М±т. Значимость различий концентраций антител в сравнении с контрольной группой: **- р < 0,01; * р < 0,05
К 28 суткам иммунный ответ в 1-4 группах был более выраженным, чем к 14 суткам. Композиции с опытными образцами 1-3 ПС и с гидроксидом алюминия индуцировали статистически значимое повышение концентрации HBs-АТ по сравнению с контролем (неадъювированный АГ) (рис.). Отметим, что к этому сроку эффект фукоиданов с разной степенью очистки, структурой и молекулярной массой на уровень специфических антител у мышей значимо не отличался в группах 1-3 и в сравнении с гидроксидом алюминия (группа 4).
Большинство современных профилактических НВУ вакцин сконструировано на основе вирусного оболочечного белка - HBs-АГ, который обладает слабой иммуногенностью. Кроме того, эти вакцины могут иметь ряд ограничений, связанных с низкой частотой завершения вакцинации, слабым реагированием или отсутствием реакции у пациентов с сопутствующими заболеваниями [9]. Для усиления им-муногенности в вакцины включены адъюванты, как правило, гидроксид алюминия. Тем не менее, вакцины, адъювированные соединениями алюминия, могут вызывать нейродегенеративные расстройства, их действие слабо эффективно у пожилых людей и лиц, имеющих сопутствующие хронические заболевания печени, диабет II типа [9]. Таким образом, существует постоянная потребность в разработке новых адъю-вантов для повышения иммуногенности НВУ вакцин.
В настоящем исследовании мы рассмотрели потенциал фукоиданов из водоросли Е. evanescens в качестве адъювантов природного происхождения. Нами
показано, что подкожная иммунизация 1 мкг неадъ-ювированного HBs-АГ индуцировала обнаруживаемые уровни HBs-АТ, которые были значимо ниже, чем при иммунизации адъювированными композициями с ПС, содержащими аналогичное количество АГ. Мы установили, что при сравнении иммуноген-ного действия исследуемых фукоиданов с действием гидроксида алюминия, три образца ПС различной структуры вызывают аналогичные уровни продукции суммарных АТ к Hbs-АГ. Наши данные согласуются с результатами ряда исследователей, которые показали, что фукоиданы разных водорослей вызывают продукцию специфических антител к овальбумину, к АГ вакцинного штамма Mycoplasma hyopneumoniae, к вирусу гриппа in vivo [10, 11].
Таким образом, гуморальный иммунный ответ у мышей к экспериментальным вакцинам на основе HBs-АГ и фукоиданов в качестве адъювантов, при двукратной иммунизации аналогичен ответу, стимулированному HBs-АГ с гелем гидроксида алюминия. Иммунный ответ на опытные композиции был значимо выше, чем на HBs-АГ без адъюванта. Полученные результаты указывают на перспективность использования фукоиданов в качестве адъювантов в составе вакцинных препаратов.
Выводы
Исследованные образцы фукоиданов из F. evanescens независимо от степени химической модификации и молекулярной массы усиливают иммуногенность ре-комбинантного HBs-антигена при совместном введении, о чем свидетельствует увеличение продукции
HEALTH. MEDiCAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 73
Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»
специфических суммарных IgG антител у мышей линии BALB/c. Адъювантное действие фукоиданов сопоставимо с таковым гидроксида алюминия.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование выполнено без привлечения спонсорских средств.
ЛИТЕРАТУРА
1. World Health Organization. Hepatitis B. Fact sheet. April, 2017. Available from: http://www.who.int/ mediacentre/factsheets/fs204/en/
2. Lee S., Nguyen M.T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Netw. 2015; 15(2): 51-57, https://doi.org/10.4110/in.2015.15.2.51.
3. Vera-Lastra O., Medina G., Cruz-Dominguez M. del P., Jara L.J., Shoenfeld Y. Autoimmune/inflammatory syndrome induced by adjuvants (Shoenfeld's syndrome): clinical and immunological spectrum. Expert Rev. Clin. Immunol. 2013; 9(4): 361-73, https://doi. org/10.1586/eci.13.2.
4. Petrovsky N., Cooper P. D. Carbohydrate-based immune adjuvants. Expert Rev. Vaccines. 2011; 10(4): 523-537. https://doi.org/10.1586/erv.11.30.
5. Pomin V.H. Marine non-glycosaminoglycan sulfat-ed glycans as potential pharmaceuticals. Pharmaceuticals. 2015; 8(4): 848-864. https://doi.org/10.3390/ph8040848.
6. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Dmitrenok P.S., Zvyagintseva T.N. Structural similarities of fu-
coidans from brown algae Silvetia babingtonii and Fucus evanescens, determined by tandem MALDI-TOF mass spectrometry. Carbohydr. Res. 2012; 358: 78-81. https://doi.Org/10.1016/j.carres.2012.06.015.
7. Imbs T.I., Skriptsova A.V., Zvyagintseva T.N. Antioxidant activity of fucoise-containing sulfated poly-saccharides obtained from Fucus evanescens by different extraction methods. Journal of Applied Phycology. 2015; 27(1): 545-553.
8. Silchenko A.S., Kusaykin M.I., Kurilenko V.V., Zakharenko A.M., Isakov V.V., Zaporozhets T.S., Gazha A.K., Zvyagintseva T.N. Hydrolysis of fucoidan by fu-coidanase isolated from the marine bacterium, Formosa algae. Mar. Drugs. 2013; 11(7): 2413-2430. https://doi. org/10.3390/md11072413.
9. Koenig A., Stepanova M., Felix S., Kalwaney S., Clement S., Younossi Z.M. Vaccination against hepatitis A and B in patients with chronic liver disease and type 2 diabetes: has anything changed? Liver Int. 2016; 36(8): 1096-1100, https://doi.org/10.1111/liv.13164.
10. Kim S.Y., Joo H.G. Evaluation of adjuvant effects of fucoidan for improving vaccine efficacy. J. Vet. Sci. 2015; 16(2): 145-150. https://doi.org/10.4142/ jvs.2015.16.2.145.
11. Song L., Chen X., Liu X., Zhang F., Hu L., Yue Y., Li K., Li P. Characterization and comparison of the structural features, immunemodulatory and anti-Avian influenza virus activities conferred by three algal sulfated polysaccharides. Mar. Drugs. 2016; 14(1): 17 p. https://doi.org/10.3390/md14010004.
Сведения об авторах
Персиянова Елена Викторовна, к.б.н., с.н.с. лаборатории иммунологии, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», г. Владивосток, ул. Сельская, 1, тел.: 8(423) 244-24-46; е-тай: helen-pers@yandex.ru (автор-корреспондент)
Кузнецова Татьяна Алексеевна, д.м.н., зав. лабораторией иммунологии, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», г. Владивосток, ул. Сельская, 1, тел.: 8(423) 244-24-46; е-тай: takuznets@mail.ru
Шутикова Анна Леонидовна, к.б.н., н.с. лаборатории иммунологии, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», г. Владивосток, ул. Сельская, 1, тел.: 8(423) 244-24-46; е-тай: shutikova79@mail.ru
Ермакова Светлана Павловна, д.х.н., профессор, зав. лабораторией химии ферментов, ТИБОХ ДВО РАН, 690022, г. Владивосток, ул. Проспект 100 лет Владивостоку, 159, тел.: 8(423) 231-07-05; е-maй: swetlana_e@mail.ru
© Коллектив авторов, 2017 г. doi: 10.5281/zenodo.817831
Удк 616.248-053.2-076.5
Е.В. Просекова1, А.И. Турянская1, Т.С. Ситдикова2, М.С. Долгополов1, Н.Р Забелина1, В.А. Сабыныч1
цитокиновый профиль сыворотки крови при бронхиальной астме у детей
1 ФГБОУ ВО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Владивосток
2 КГБУЗ «Владивостокский клинико-диагностический центр», Владивосток
Проведена комплексная оценка цитокинового профиля сыворотки крови (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-13, ИЛ-17А) и индуцированной выработки ИЛ-4, и ИНФY клетками периферической крови у 98 детей с
