CC BY
17
УДК 57.023
Характеристика человеческого моноклонального антитела C6D7-RBD, специфичного к рецепторсвязывающему домену S белка вируса SARS-^V-2
Я. О. Романенко*, М. В. Силкина, А. С. Карцева, М. А. Марьин, М. А. Шкуратова, М. А. Макарова, А. К. Рябко, Д. А. Конышкова, Н. А. Зенинская, А. Е. Хлынцева, И. Г. Шемякин, В. В. Фирстова
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии
Роспотребнадзора, Оболенск, Московская обл., 142279 Россия
*E-mail: muntian.jana@yandex.ru
Поступила в редакцию 01.11.2022
Принята к печати 20.02.2023
DOI: 10.32607/actanaturae.11849
РЕФЕРАТ Новая коронавирусная инфекция COVID-19 — это острое вирусное заболевание, поражающее преимущественно верхние дыхательные пути. Этиологическим агентом COVID-19 является РНК-содержащий вирус SARS-^V-2 (сем. Coronaviridae, род Betacoronavirus, подрод. Sarbecovirus). Нами получено высокоаффинное человеческое моноклональное антитело с авторским названием C6D7-RBD, специфичное к рецепторсвязывающему домену (RBD) S белка вируса SARS-^V-2 вариант Wuhan-Hu-1, обладающее вируснейтрализующей активностью в тесте с рекомбинантными антигенами: ангио-тензинпревращающим ферментом 2 (АСЕ2) и RBD.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА COVID-19, SARS-CoV-2, рецепторсвязывающий домен, человеческое моноклональное антитело, вируснейтрализующая активность.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ COVID-19 - (COronaVIrus Disease 2019); SARS-CoV-2- коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (Severe acute respiratory syndrome-related Coronavirus 2); ВОЗ -Всемирная организация здравоохранения; FDA - Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (U.S. Food and Drug Administration); чМКА - человеческое моноклональное антитело; МКА - моноклональное антитело; ACE-2 - ангиотензинпревращающий фермент 2; TMPRSS2 - трансмембранная сериновая протеаза 2; RBD - рецепторсвязывающий домен; ФСБ -фосфатно-солевой буфер; ФБС - фетальная сыворотка крупного рогатого скота; ИФА - иммунофер-ментный анализ; TMB - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин; ФСБ-Тв - фосфатно-солевой буфер с добавлением Tween-20; ПААГ - полиакриламидный гель.
ВВЕДЕНИЕ
Новая коронавирусная инфекция COVID-19 (COronaVIrus Disease 2019), вызываемая вирусом SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2), впервые была зарегистрирована в конце 2019 года в городе Ухань - столице китайской провинции Хубэй. Несмотря на все попытки сдержать заболевание в Китае, вирус распространился по всему миру и вскоре Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила COVID-19 пандемией [1]. На сегодняшний день продолжающаяся пандемия этой инфекции не перестает уносить жизни людей. За небольшой промежуток времени в мире создано немало эффективных вакцин. Однако есть необходимость в создании средств пассивной иммунотерапии
людей в умеренно тяжелых и тяжелых случаях заболевания, к которым относятся препараты на основе человеческих моноклональных антител (чМКА).
Геном вируса SARS-CoV-2 кодирует четыре структурных белка: поверхностный шиповидный глико-протеин S, мембранный М, белок нуклеокапсида N и оболочечный белок Е. Белок S обуславливает возможность прикрепления, слияния и проникновения вируса в клетку хозяина. Под действием трансмембранной сериновой протеазы 2 (TMPRSS2) белок Я расщепляется на две субъединицы - и [2, 3]. Непосредственно рецепторное взаимодействие вируса с клеткой хозяина осуществляется через RBD, который расположен в субъединице Б1, а затем с помощью субъединицы происходит соединение
мембраны вируса и клетки хозяина [4]. Поэтому RBD является основной мишенью для получения чМКА, потенциально способных нейтрализовать вирус [5].
Исследователи всего мира в условиях быстро нарастающей заболеваемости и высокой смертности в ускоренные сроки разрабатывают инновационные лекарственные препараты, которые, в свою очередь, должны обладать большой клинической эффективностью и безопасностью.
В октябре 2020 года Министерство здравоохранения РФ утвердило применение плазмы от доноров-реконвалесцентов (лиц с подтвержденным случаем COVID-19 в стадии выздоровления) для лечения пациентов с тяжелым течением новой коронави-русной инфекции в связи с отсутствием препаратов для специфического лечения. В методических рекомендациях говорится, что возрастной диапазон донора должен быть от 18 до 55 лет, иметь массу тела более 55 кг, а забор плазмы крови должен проводиться не ранее чем через 14 дней после исчезновения клинических симптомов и двукратном отрицательном результате на РНК SARS-CoV-2 в орофаринге-альном мазке, взятом с интервалом не менее 24 ч. Плазма крови должна обладать вируснейтрализую-щей активностью в разведении 1 : 160, концентрация общего белка в крови не менее 65 г/л [6].
На территории РФ нет опыта использования препаратов на основе моноклональных антител у тяжело больных пациентов, но есть одно запатентованное чМКА, обладающее нейтрализующей активностью, селективно взаимодействующее с RBD-фрагментом в составе S-белка вируса SARS-CoV-2 [7].
Получение чМКА, специфичных к RBD-домену белка S SARS-^V-2, является перспективным направлением. В данном исследовании охарактеризовано полученное нами чМКА, которое может быть использовано для лечения COVID-19.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для выполнения данной работы нами был выбран донор крови, переболевший новой коронавирусной инфекцией COVID-19 и через 6 месяцев после выздоровления иммунизированный вакциной «Спутник Лайт» (пр-во ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Россия). От донора получено письменное информированное согласие на участие в работе. На 7 сутки после вакцинации был проведен забор периферической крови с последующим выделением из нее фракции В-лимфоцитов с помощью коммерческого набора RossetteSep™ Human B Cell Enrichment Cocktail (Stemcell technologies, Канада) в соответствии с инструкцией производителя. Выделенные В-лимфоциты подвергали электрослиянию с миелом-ной клеточной линией K6H6/B5 (ATCC® CRL1823™)
на приборе ECM 2001 (BTX Harvard Apparatus, США) согласно раннее опубликованной методике [8].
Культивирование полученных гибридом проводили при температуре 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2. Замену культуральной среды проводили 1 раз в трое суток. По достижении монослоя гибридной культуры проводили иммуноферментный анализ (ИФА) с целью выявления гибридом, синтезирующих специфические МКА к RBD-домену S-белка SARS-CoV-2.
Иммуноферментный анализ
Культуральную жидкость из лунок, в которых наблюдался рост гибридных клеток, тестировали с помощью ИФА в отношении специфического взаимодействия с рекомбинантным RBD вируса SARS-CoV-2 вариант Wuhan-Hu-1 (his-sars2-rbd, Invivogen). Для этого в лунки 96-луночного полистиролового планшета вносили по 100 мкл раствора рекомбинантного белка RBD (his-sars2-rbd, Invivogen) в концентрации 1 мкг/мл на лунку в ФСБ и инкубировали при температуре 37°С в течение 2 ч на планшетном орбитальном шейкере (Elmi, Латвия) при скорости вращения платформы 370 об/мин. Затем каждую лунку планшета трехкратно отмывали, внося по 200 мкл ФСБ с добавлением 0.05% Tween-20 (ФСБ-Тв). Затем свободные валентности пластика блокировали молоком с массовой долей жира не более 0.5%, внося по 200 мкл в лунку, и инкубировали при температуре 37°C в течение 1 ч при тех же условиях. После инкубации лунки планшета трехкратно отмывали ФСБ-Тв. Далее в планшет вносили по 100 мкл культуральной жидкости, инкубацию и отмывку планшета проводили при тех же условиях. В качестве отрицательного контроля использовали лунки с чистым ФСБ, в качестве положительного контроля - ранее проверенную сыворотку крови донора с высоким титром антител к RBD-белку в разведении 1 : 25. После инкубации лунки планшета трижды отмывали ФСБ-Тв. Далее в лунки добавляли антитела кролика против цельной молекулы IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США), в разведении 1 : 20000. Планшет инкубировали при тех же условиях в течение 40 мин. По окончании инкубации планшет отмывали 6 раз, затем в лунки планшета вносили по 100 мкл проявочного раствора на основе 3,3',5,5'-тетраметилбен-зидина (TMB). Реакцию оценивали по появлению синего окрашивания. Интенсивность окрашивания измеряли на планшетном спектрофотометре (Bio-Rad xMark) при длине волны 655 нм.
Колонии гибридных клеток, показавшие высокую (трехкратно превышающую значение отрицательного контроля) оптическую плотность в ИФА,
клонировали и масштабировали в культуральных флаконах Corning® T-25 и T-75. Далее для наработки чМКА гибридную культуру культивировали в колбах 1.6 л Optimum Growth™ Flasks (Thomson Instrument Company, США).
Аффинная хроматография
Для получения чМКА C6D7-RBD культураль-ную жидкость, в которой культивировались одноименные гибридомы, очищали методом аффинной хроматографии на колонке с Protein G-сефарозой (HiTrapTM Protein G, Швеция) с использованием системы AKTA Start (GE Healthcare, США). Выделенные IgG переводили в ФСБ и доочищали методом гель-фильтрации на сорбенте Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare, США). Чистоту полученной иммуноглобулиновой фракции проверяли методом SDS-электрофореза по Лэммли в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в редуцирующих и не редуцирующих условиях. Гель окрашивали Кумасси бриллиантовым синим R-250.
Иммуноблот-анализ
Оценку иммунологической специфичности очищенного чМКА C6D7-RBD проводили методом иммуноблотинга. Для этого рекомбинантный RBD (1 мкг на дорожку) разделяли с помощью ПААГ-электрофореза в редуцирующих условиях, после чего проводили горизонтальный перенос белка из геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra (GE Healthcare) стандартным методом. По окончании переноса мембрану погружали в обезжиренное (не более 0.5% жирности) молоко для блокировки свободных валентностей нитроцеллюлозы и инкубировали в течение 1 ч при покачивании и температуре 37°С. По окончании инкубации мембрану трижды отмывали ФСБ-Тв и погружали в раствор с чМКА C6D7-RBD с концентрацией 10 мкг/мл в ФСБ. Инкубацию и отмывку мембраны проводили при тех же условиях. чМКА детектировали на мембране козьими антителами против IgG человека, конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma), в разведении 1 : 10 000 в ФСБ. Мембрану инкубировали в течение 40 мин при тех же условиях. После инкубации мембрану отмывали 6 раз ФСБ-Тв и проявляли 1% раствором диаминобензи-дина в ФСБ с добавлением хлоридов никеля и кобальта, а также 33% пероксида водорода в количестве 1 мкл на 1 мл проявочного раствора.
Определение классовой принадлежности чМКА C6D7-RBD
Для определения подкласса и изотипа очищенного чМКА C6D7-RBD использовали иммунохроматогра-
фический экспресс-тест (Iso-Gold™ Rapid Human Antibody Isotyping Kit, Канада). Перед проведением экспресс-теста все реагенты доводили до комнатной температуры. Опытный образец чМКА C6D7-RBD разводили в 200 мкл буфера для разведения образца (Part Number SDB-004) в соотношении 1 : 100. Затем в пробирку с опытным образцом погружали тест-полоску. Результат анализировали через 5-10 мин.
Определение параметров равновесной константы диссоциации чМКА C6D7-RBD с белком-мишенью RBD
Параметры равновесной константы диссоциации чМКА C6D7-RBD с белком-мишенью RBD определяли с помощью метода поверхностного плазмон-ного резонанса (SPR) на приборе BIAcore X-100 (Biacore, Швеция). Эксперимент проводили на сенсорном чипе CM5 в буфере HBS-EP (10 мМ Hepes, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0.005% поверхностно-активного вещества P20, pH 7.4). Антитела к гистидину конъюгировали с сенсорным чипом с использованием наборов His Capture Kit type 2 и Amine Coupling Kit (Cytiva, Швеция) в соответствии с инструкцией производителя. Рекомбинантный RBD (10 мкг/мл) наносили на подготовленный чип со скоростью 30 мкл/мин в течение 3 мин. После 10-минутной стабилизации антитело (концентрация от 6.25 до 100 нМ) вводили в течение 3 мин при постоянной скорости потока 40 мкл/мин. Диссоциацию контролировали в течение 90 мин, после чего чип регенерировали 10 мМ глицином pH 1.7 в течение 30 с при скорости потока 50 мкл/мин. Сенсорограммы нормализовали путем вычитания базовых значений RU из эталонной проточной кюветы (без захвата чМКА) и анализировали путем подгонки данных к модели связывания Ленгмюра 1 : 1 с помощью программного обеспечения Biacore T200 Evaluation Software.
Определение способности чМКА C6D7-RBD ингибировать взаимодействие белка АСЕ-2 с RBD
Определение вируснейтрализующей активности чМКА C6D7-RBD проверяли в конкурентном ИФА. С этой целью в лунки 96-луночного полистиролового планшета иммобилизовали рекомбинантный вариант белка RBD в концентрации 1 мкг/мл по описанной выше методике. Затем в лунки вносили чМКА C6D7-RBD в концентрации от 10 до 0.078125 мкг/мл с двухкратным серийным шагом разведения. Планшет инкубировали при температуре 37°C в течение 1 ч. После инкубации лунки планшета трижды отмывали ФСБ-Тв. Следующим этапом в лунки планшета вносили рекомбинантный белок человеческого ACE-2 (fc-hace2, Invivogen), конъюгированный с пероксидазой хрена, с использованием набора LYNX Rapid
HRP Antibody Conjugation Kit (Bio-Rad). Инкубацию и отмывку планшета проводили при тех же условиях. Затем в лунки планшета вносили по 100 мкл проявочного раствора TMB. Реакцию оценивали по появлению синего окрашивания раствора. Интенсивность окрашивания измеряли на планшетном спектрофотометре (Bio-Rad xMark) при длине волны 655 нм. За 100% нейтрализующую активность принимали среднее значение оптической плотности фона (контрольные лунки без иммобилизации RBD, что равносильно случаю, когда он полностью заблокирован антителами), а за отсутствие нейтрализующей активности (0%) принимали среднее значение оптической плотности контрольных лунок, где ACE-2-HRP взаимодействует с RBD без внесения антитела. По контрольным значениям получали линейную функцию, с помощью которой значения оптической плотности в опытных лунках с различным количеством антитела переводили в процентное значение нейтрализующей активности.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате электрослияния плазмобластов с клетками-партнерами K6H6/B5 получено 5 гибридом, из которых по итогам скрининга на специфичность синтезируемых ими антител к RBD была выбрана одна гибридома, названная C6D7-RBD. Последующее масштабирование объема культивирования гибридом позволило получить большой объем супернатанта, в котором содержались антитела. Для получения чистой фракции иммуноглобулинов использовали методы хроматографической очистки.
Результаты хроматографической очистки чМКА C6D7-RBD
Чистоту иммуноглобулиновой фракции, полученной методом аффинной хроматографии с последующей доочисткой методом гель-фильтрации, проверяли с помощью SDS-электрофореза по Лэммли в 10% ПААГ в редуцирующих и не редуцирующих условиях (рис. 1). Положение очищенного чМКА C6D7-RBD на электрофореграмме соответствует его молекулярной массе. Степень чистоты очищенного чМКА C6D7-RBD составила, по данным денситометрии (GE Typhoon FLA 9500, Швеция), не менее 95%.
Иммунологическая специфичность чМКА C6D7-RBD к рецепторсвязывающему домену S-белка вируса SARS-CoV-2
Специфичность чМКА C6D7-RBD в отношении ре-комбинантного белка RBD доказали методом им-муноблотинга. Показано, что чМКА C6D7-RBD характеризуется специфической активностью в отношении рекомбинантного белка RBD (рис. 2).
Результаты иммунохроматографического теста
Согласно данным иммунохроматографического теста исследуемое чМКА C6D7-RBD относится к изотипу G1 иммуноглобулинов класса G и содержит к-цепь (рис. 3).
Определение равновесной константы диссоциации чМКА C6D7-RBD с белком-мишенью RBD (Ухань)
Параметры аффинного взаимодействия чМКА C6D7-RBD с рекомбинантным белком RBD определяли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Величина равновесной константы диссоциации (KD) для чМКА C6D7-RBD составила: KD = 5.525 х 10-D М (рис. 4).
Определение RBD-ACE2-нейтрализующей активности чМКА C6D7-RBD
Из представленных на рис. 5 данных видно дозо-зависимое повышение нейтрализующей активности чМКА C6D7-RBD. При максимальной концентрации 10 мкг/мл чМКА C6D7-RBD наблюдалось практически полное (97%) ингибирование взаимодействия АСЕ-2 и RBD (Ухань). Добавление чМКА C6D7-RBD в концентрации 0.625 мкг/мл ингибиро-вало АСЕ-2 - RBD (Ухань) взаимодействие на 36%, а при минимальной концентрации чМКА C6D7-RBD (0.078125 мкг/мл) нейтрализующая активность практически отсутствовала (2%).
ОБСУЖДЕНИЕ
Получение чМКА с физиологически спаренными тяжелой и легкой цепями, специфичного в отношении выбранной мишени и к тому же обладающего ви-руснейтрализующей активностью - довольно сложная задача. Нами использованы современные методы цитометрического сортинга с целью получения пула плазмобластов. Мы выбрали стратегию сортинга всей популяции плазмобластов (независимо от их специфичности), но забор крови проводили на 7-e сутки после вакцинации донора вакциной «Спутник Лайт». В ряде работ показано, что количество специфических плазмобластов увеличивается в крови на 7-8 сутки после вакцинации или заболевания [9-11]. Далее для увеличения количества получаемых нами гибридом мы применили метод электрослияния, эффективность которого на порядок выше, чем слияние с ПЭГ [8]. Использование клеточной линии K6H6/B5 в качестве клеток-партнеров позволило снизить вероятность последующей сегрегации хромосом человека из гибридомы [12]. В результате проведенной нами работы получено 12 гибридом, но только пять оказались специфичными в отношении RBD и только одна гибридома (C6D7-RBD) сохранила способность стабильно синтезировать антитело.
кДа
250 130 95 72
55
36
28
Рис. 1. Электрофореграмма чМКА C6D7-RBD. 1 - маркеры молекулярных масс PageRuler™ SM1811 (Fermentas, США). 2 - образец чМКА C6D7-RBD в редуцирующих условиях. 3 - образец чМКА C6D7-RBD в не редуцирующих условиях
180
170
3
OL 160
m
ет ей 150
от
z 140
ц
и
н и 130
ш
120
110
кДа 250 130
100 70 55
35
25
15
Рис. 2. Определение специфичности чМКА C6D7-RBD в отношении рекомбинантного белка RBD. 1 - маркеры молекулярных масс PageRuler™ SM1811 (Fermentas, США). 2 - реком-бинантный RBD, детектированный чМКА C6D7-RBD
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
SR Ш
juu: G2G
Цепь к
и
ИГ II
IgG 1
1
2
Рис. 3. Классовая принадлежность чМКА C6D7-RBD. 1 - тест-полоска для определения типа легкой цепи и классовой принадлежности иммуноглобулина. 2 - тест-полоска для определения подкласса иммуноглобулина G
2 x 10-8 4x10-8 6x10-8 Концентрация, М
8x 10-8
1 x 10-7
0.01 0.1 1 10
Концентрация антител, мкг/мл
100
Рис. 4. Результаты определения KD чМКА C6D7-RBD в отношении белка-мишени RBD
Рис. 5. Определение RBD-ACE2-нейтрaлизующей активности чМКА C6D7-RBD
Дальнейший анализ показал, что C6D7-RBD относится к подклассу и содержит легкую
цепь типа к. чМКА C6D7-RBD специфично к RBD SARS-CоV-2 с Кв = 5.525 х 10-9 М.
Традиционные методы выявления способности МКА нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 основаны на оценке способности антител ингибировать бляш-кообразование или цитопатогенное действие вируса на чувствительной культуре клеток. Работа с виру-
сом дикого типа SARS-CoV-2 подразумевает необходимость биоизоляции и проведения исследований в лабораториях, отвечающих требованиям безопасности работ с патогенными биологическими объектами II группы патогенности. Для облегчения скрининга нейтрализующей активности моноклональных антител или сывороток переболевших/вакцинированных доноров можно использовать «суррогатные» методы. К таким методам относится конкурентный ИФА,
2
З
2
0
с использованием которого анализируется влияние антител на способность взаимодействия рекомби-нантных белков RBD и ACE-2 друг с другом. Этот метод отражает способность антител подавлять проникновение вируса внутрь клетки. В ряде работ показано, что большая часть вируснейтрализующих антител имеет специфичность к RBD поверхностного гликопротеина S SARS-CoV-2, и механизм их действия обусловлен ингибированием способности вируса связываться с вирусным рецептором ACE-2 на поверхности клетки-мишени. С использованием этого метода показано, что чМКА C6D7-RBD в концентрации 10 мкг/мл способно практически полностью блокировать взаимодействие RBD-ACE-2.
В мировой практике уже есть опыт использования препаратов, основой которых являются чМКА. В настоящее время FDA утвердило только три таких препарата для экстренного лечения COVID-19. В 2021 году британская фармацевтическая компания GSK (GlaxoSmithKline) и ее американский партнер Vir Biotechnology выпустили препарат Sotrovimab (VIR-7831) [13]. Препарат состоит из одного чМКА, специфичного к RBD S-белка вируса SARS-^V-2 [14]. В том же 2021 году компанией AbCellera совместно с Исследовательским центром вакцин США в Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) разработан препарат LY-CoV555/бамланивимаб и LY-CoV016/ этесевимаб [15]. Этот препарат состоит из коктейля чМКА, специфичных к RBD S-белка, а также специфичных к ACE-2 [16]. Третий утвержденный
препарат Казиривимаб и Имдевимаб (REGN10933 и REGN10987), разработанный американской биотехнологической компанией Regeneron Pharmaceuticals, состоит из двух чМКА, специфичных к RBD S-белка вируса SARS-^V-2 [17, 18]. Клинические испытания показывают, что для большей эффективности нейтрализации вируса SARS-CoV-2 необходимо использовать коктейль моноклональных антител, специфичных к RBD S-белка вируса SARS-^V-2.
Таким образом, полученное нами чМКА C6D7-RBD перспективно для дальнейшего изучения эффективности его применения в качестве отдельного чМКА или в составе коктейля МКА для нейтрализации вируса SARS-^V-2.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С использованием методов цитометрического сортинга и гибридомной технологии нами получена гибридома, синтезирующая чМКА C6D7-RBD. чМКА C6D7-RBD относится к подклассу 1 IgG, легкая цепь представлена изотипом к. чМКА C6D7-RBD специфично к RBD SARS-^V-2 с KD = 5.525 х 10-9 М и проявляет способность ингибировать взаимодействие между АСЕ-2 и RBD-белками, что позволяет рассматривать возможную способность данного чМКА нейтрализовать проникновение вируса SARS-^V-2 в клетку.
Работа выполнена в рамках государственного задания НИОКР 3.1.3.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Yan Y., Chang L., Wang L. // Rev. Med. Virol. 2020. V. 30. № 3. P. e2106.
2. Huang Y., Yang C., Xu X.F., Xu W., Liu S.W. // Acta Pharmacologica Sinica. 2020. V. 41. № 9. P. 1141-1149.
3. Kumar S., Chandele A., Sharma A. // PLoS Pathogens. 2022. V. 17. № 9. P. e1009885.
4. Raybould M.I., Kovaltsuk A., Marks C., Deane C.M. // Bioinformatics. 2021. V. 37. № 5. P. 734-735.
5. Xia S., Yan L., Xu W., Agrawal A.S., Algaissi A., Tseng C.T.K., Wang Q., Du L., Tan W., Wilson I.A., et al. // Sci. Adv. 2019. V. 5. № 4. P. eaav4580.
6. Камкин Е.Г. Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19). Временные методические рекомендации. М.: Министерство здравоохранения РФ, 2020.
7. Шахпаронов М.И., Павлюков М.С., Антипова Н.В. Моноклональное антитело к RBD-фрагменту в составе S-белка вируса SARS-CoV-2. Патент РФ на изобретение № 2744274. 2021.
8. Силкина М.В., Карцева А.С., Рябко А.К., Марьин М.А., Ро-маненко Я.О., Калмантаева О.В., Хлынцева А.Е., Шемякин И.Г., Дятлов И.А., Фирстова В.В. // Биотехнология. 2021.
Т. 37. № 2. С. 77-87.
9. Scholzen A., Nahrendorf W., Langhorne J., Sauerwein R.W. // PLoS One. 2014. V. 9. № 7. P. e102885.
10. Traggiai E., Becker S., Subbarao K., Kolesnikova L., Uematsu Y., Gismondo M.R., Murphy B.R., Rappuoli R., Lanzavecchia A. // Nat. Medicine. 2004. V. 10. № 8. P. 871-875.
11. Usaj M., Trontelj K., Miklavcic D., Kanduser M. // J. Membrane Biol. 2010. V. 236. № 1. P. 107-116.
12. Yu X., McGraw P.A., House F.S., Crowe J.E., Jr. // J. Immunol. Meth. 2008. V. 336. № 2. P. 142-151.
13. Tuccori M., Ferraro S., Convertino I., Cappello E., Valdiserra G., Blandizzi C., Maggi F., Focosi D. // MAbs. 2020. V. 12. № 1. P. 1854149.
14. Cathcart A.L., Havenar-Daughton C., Lempp F.A., Ma D., Schmid M.A., Agostini M.L., Guarino B., Di Julio J., Rosen L.E., Tucker H., et al. // bioRxiv. 2021. P. 2021.03.09.434607.
15. Jones B.E., Brown-Augsburger P.L., Corbett K.S., Westendorf K., Davies J., Cujec T.P., Wiethoff C.M., Blackbourne J.L., Heinz B.A., Foster D., et al. // Sci. Translat. Med. 2021. V. 13. № 593. P. eabf1906.
16. Chen P., Nirula A., Heller B., Gottlieb R.L., Boscia J., Morris J., Huhn G., Cardona J., Mocherla B., Stosor V., et al. // New Engl. J. Med. 2021. V. 384. № 3. P. 229-237.
17. Hansen J., Baum A., Pascal K.E., Russo V., Giordano S., Wloga E., Fulton BO Yan Y., Koon K., Patel K., et al. // Science. 2020. V. 369. № 6506. P. 1010-1014.
18. VanBlargan L.A., Errico J.M., Halfmann P., Zost S.J., Crowe J.E., Purcell L.A., Kawaoka Y., Corti D., Fremont D.H., Diamond M.S. // Nat. Medicine. 2022. V. 28. № 3. P. 490-495.
