СВОЙСТВА АНТИТЕЛ К RBD У ПЕРЕБОЛЕВШИХ COVID-19 И ВАКЦИНИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОМ «СПУТНИК V»

Л.В. Генералова; И.В. Григорьев; Д.В. Васина; А.П. Ткачук; И.С. Кружкова; Л.В. Колобухина; О.А. Бургасова; В.А. Гущин

Л. В. Генералова1, И. В. Григорьев2, Д. В. Васина2, А. П. Ткачук2, И. С. Кружкова2, Л. В. Колобухина2, О. А. Бургасова1,2, В. А. Гущин2 н

1 Российский университет дружбы народов, Москва, Россия

2 Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи, Москва, Россия

Исследование свойств антител, участвующих в нейтрализации вируса, после перенесенного заболевания COVID-19 и применения профилактических препаратов, остается актуальной задачей, от которой зависит выработка стратегий первичной и повторной иммунизации. Измерение уровня антител к антигенам SARS-CoV-2 — один из основных способов оценки иммунитета, однако не дает достаточной информации о количественных и качественных показателях иммунного ответа. Целью работы было исследовать свойства антител IgG к RBD у переболевших COVID-19 и вакцинированных препаратом «Спутник V». На когортах пациентов (18-80 лет; соотношение мужчин и женщин — 47 : 53), переболевших COVID-19, и вакцинированных добровольцев изучена динамика созревания аффинности и изменения нейтрализующей активности IgG к RBD. Нейтрализующая активность сывороток крови у добровольцев через 4-6 месяцев после вакцинации снизилась по сравнению с образцами переболевших пациентов (медианы — 57,4 и 86,4% соответственно). Индекс авидности у вакцинированных добровольцев, напротив, был значительно выше, чем у перенесших COVID-19 (76,7 и 61,4% соответственно). В острую фазу заболевания (14-16 дней от появления симптомов) ранее вакцинированные пациенты имели более высокий индекс авидности, чем первичные пациенты (43,5 и 20,4% соответственно). В долгосрочной перспективе степень созревания аффинности вирусспецифичных IgG после вакцинации может быть выше, чем после естественно перенесенной инфекции. Показано, что вакцинация «Спутником V» приводит к формированию высокоавидных IgG, сохраняющихся по крайней мере 6 месяцев. Продемонстрировано наличие уровней антител, коррелирующих с протективным иммунитетом, на протяжении 4-6 месяцев после вакцинации или перенесенной инфекции.

Ключевые слова: авидность антител, вирус-нейтрализация, SARS-CoV-2, иммунная память, вакцинация, «Спутник V»

Финансирование: исследование проведено при поддержке гранта Министерства здравоохранения РФ, № АААА - А20-120113090054-6, профессору О. А. Бургасовой было выделено финансирование по программе стратегического академического лидерства РУДН.

Вклад авторов: Л. В. Генералова и И. В. Григорьев — планирование исследования, подготовка и проведение экспериментов, интерпретация данных и написание статьи; И. С. Кружкова и Л. В. Колобухина — интерпетация данных, написание статьи; Д. В. Васина, А. П. Ткачук, О. А. Бургасова, В. А. Гущин — планирование исследования и написание статьи.

Соблюдение этических стандартов: исследование одобрено этическим комитетом Первой московской инфекционной больницы (протокол № 11/А от 16 ноября 2020 г.); всеми участниками исследования было подписано информированное согласие.

|>3 Для корреспонденции: Владимир Алексеевич Гущин

ул. Гамалеи, 18, стр. 9, г. Москва, Россия; [email protected]

Статья получена: 23.01.2022 Статья принята к печати: 08.02.2022 Опубликована онлайн: 16.02.2022 DOI: 10.24075/vrgmu.2022.005

PROPERTIES OF RBD SPECIFIC IGG FROM COVID-19 PATIENTS AND SPUTNIK V VACCINATED INDIVIDUALS

Generalova LV1, Grigoriev IV2, Vasina DV2, Tkachuk AP2, Kruzhkova IS2, Kolobukhina LV2, Burgasova OA1,2, Guschin VA2E3

1 Рeoples' Friendship University of Russia (RUDN University), Moscow, Russia

2 Gamaleya National Research Center for Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

SARS-CoV-2 specific antibody response is a generally accepted measure of postinfection and vaccination-induced immunity assessment. The dynamics of avidity maturation and neutralizing activity of virus-specific immunoglobulins G during the SARS-CoV-2-associated coronavirus infection was studied in cohorts of vaccinated volunteers and COVID-19 patients. 4-6 months after vaccination, neutralization activity was low compared to hospitalized patients (medians 57.4% vs 86.4%). On the opposite, the avidity indices in vaccinated volunteers were significantly higher (median 76.7%) than among hospitalized patients (median 61.4%). During the acute phase of the disease (14-16 days PI), post-vaccination patients have also higher avidity indices than primary patients (medians 43.5% vs 20.4%). Our results suggest that in long-term perspective antibody affinity maturation rate is higher after vaccination than after a natural infection. We demonstrated that Sputnik V vaccination leads to formation of high-avidity IgG, which persists for at least 6 months of observation. These results also indicate the presence of protective efficacy markers for at least 4-6 months after the vaccination or a previous illness and gives grounds for the half-year time period chosen for booster immunization with Sputnik V in Russia.

Keywords: antibody avidity, virus neutralization, SARS-CoV-2, immune memory, vaccination, Sputnik-V

Funding: this research was funded by the Ministry of Health of the Russian Federation, Government assignments number № АААА - А20-120113090054-6, Prof. Olga A. Burgasova was also supported by the RUDN University Strategic Academic Leadership Program.

Author contribution: LV Generalova, IV Grigoriev — research planning, experiments preparation and execution, data interpretation and paper draft preparation; IS Kruzhkova, LV Kolobukhina — data interpretation and paper draft preparation; DV Vasina, AP Tkachuk, OA Burgasova, VA Gushchin — research planning, data interpretation and paper draft preparation.

Compliance with ethical standards: the study was approved by the ethics committee of the First Moscow Infectious Diseases Hospital (protocol № 11/А dated November 16, 2020); informed consent was obtained from all study participants.

[X] Correspondence should be addressed: Vladimir A. Gushchin Gamaleya, 18, str. 9, Moscow, Russia; [email protected]

Received: 23.01.2022 Accepted: 08.02.2022 Published online: 16.02.2022

DOI: 10.24075/brsmu.2022.005

Измерение специфичных к SARS-CoV-2 антител является общепризнанным способом оценки иммунитета после вакцинации или перенесенного заболевания. Эффективность антител и их способность предотвращать повторное инфицирование зависят не только от их количества (титра), но и от качественных характеристик антител, включающих нейтрализующую активность и авидность. Эти свойства антител, вырабатываемых после вакцинации «Спутником V» или перенесения COVID-19, в настоящее время охарактеризованы недостаточно. Показано, что авидность (% высокоаффинных антител в крови) к SARS-CoV-2 коррелировала с временем от момента заболевания и с ростом титра вирус-нейтрализации [1]. Благоприятные клинические исходы у пациентов с COVID-19 были ассоциированы с высокой авидностью антител, но не с их количеством [2]. В настоящее время отсутствуют научные публикации о динамике созревания аффинности антител после вакцинации «Спутником V» и перенесенного COVID-19, а также об изменении функциональной активности антител в течение длительного периода наблюдения. Целью исследования было изучить долгосрочную динамику выработки антител у пациентов, перенесших COVID-19 и у вакцинированных «Спутником V» добровольцев, часть из которых после вакцинации перенесла инфекцию, и охарактеризовать особенности формирования продолжительной иммунологической памяти.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Участники исследования

В исследовании приняли участие 41 человек, которые были разделены на три группы (табл. 1). Возраст участников исследования находился в диапазоне 18-80 лет. Группа госпитализированных в стационар была набрана с ноября по декабрь 2020 г. из числа пациентов Первой московской инфекционной больницы (Москва); вакцинированные пациенты, потребовавшие госпитализации (медианное время с момента прохождения полного курса вакцинации до госпитализации составило 56 дней), были набраны там же в период с марта по апрель 2021 г. Здоровые добровольцы, вакцинированные «Спутником V», были отобраны в период с сентября по декабрь 2020 г. У 23 пациентов, госпитализированных в стационар г. Москвы с различной степенью тяжести заболевания, сыворотку крови брали дважды: при поступлении в больницу (острая фаза) и через 4-6 месяцев после выписки; забор крови у девяти вакцинированных пациентов был произведен во время госпитализации, а у девяти здоровых вакцинированных добровольцев — в различные сроки после полной вакцинации. Медиана времени от наступления симптомов до первого забора крови составила 14 дней у невакцинированных пациентов и 10 дней у ранее вакцинированных. У вакцинированных добровольцев отсутствие COVID-19 было подтверждено отсутствием специфичных антител к белку нуклеокапсида (Nc) SARS-CoV-2.

Критерии включения для всех пациентов: диагноз COVID-19 был подтвержден методом ОТ-ПЦР на РНК вируса в назофарингеальных мазках либо по результатам КТ легких; тяжесть заболевания госпитализированных пациентов определяли в соответствии со шкалой NEWS [3]. Критерии включения вакцинированных пациентов: госпитализация в стационар участников с подтвержденным диагнозом COVID-19, получивших

вторую дозу вакцины не менее чем за две недели до появления симптомов заболевания. Критерии включения здоровых добровольцев: наличие вакцинации двумя дозами «Спутника V» и отсутствие симптомов COVID-19 в течение двух недель перед взятием образцов. Критерии исключения: отказ от участия в исследовании.

Сбор и хранение образцов крови

Венозную кровь собирали в вакутейнеры с активатором свертывания и разделительным гелем и доставляли в лабораторию при +4 °С. Сыворотку отделяли центрифугированием в течение 10 мин со скоростью 3000 об./мин, аликвотировали и хранили при -30 °С до дальнейшего использования.

Определение IgG к нуклеокапсидному белку (Nc) и рецептор-связывающему домену шиповидного белка (S1 RBD) SARS-CoV-2

Измерение IgG к Nc и RBD проводили с помощью лабораторных тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА), результат выражали в виде индекса позитивности (ИП) в signal/cut-off (S/CO). Для проведения ИФА использовали рекомбинантный фрагмент рецептор-связывающего домена (RBD) S1 шиповидного белка SARS-CoV-2 (RBD № 8COV1, Хайтест; Россия), экспрессированный в эукариотических клетках, и рекомбинантный белок нуклеокапсида (Nc), экспрессированный в Escherichia coli и очищенный в нашей лаборатории. Для сорбции в 96-луночные ИФА-планшеты (Costar 2592, Corning; США) вносили по 100 мкл раствора 1 мкг/мл рекомбинантного белка в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и инкубировали ночь при 4 °С. На следующий день планшеты блокировали 2 ч при комнатной температуре буфером с 0,5% казеина S002X (ХЕМА; Россия). Образцы исследуемых сывороток разводили в соотношении 1:100 в ИФА-дилюэнте S011 (ХЕМА; Россия). В качестве положительного контроля использовали сыворотки реконвалесцентов с диагнозом COVID-19, подтвержденным ОТ-ПЦР, а в качестве отрицательного — архивные образцы сывороток, собранные до 2020 г. ИФА-планшеты инкубировали 1 ч при 37 °С и трижды отмывали фосфатным буфером с 0,1% Твин-20. После отмывки в лунки вносили по 100 мкл раствора поликлональных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена (ПХ) (Novex A18823; США) и инкубировали 1 час при 37 °С. Затем планшеты отмывали 6 раз и добавляли в лунки по 100 мкл раствора субстрата 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) (R055, ХЕМА; Россия). Через 10 мин останавливали реакцию, внося в лунки по 100 мкл 10% HCl. Оптическую плотность (ОП) измеряли при длине волны 450 нм с помощью Multiscan FC (Thermo Scientific; США).

ИФА-нейтрализация (конкурентный ИФА)

Выявление IgG, нейтрализующих связывание RBD вируса c рецептором ACE2, проводили с помощью коммерческой тест-системы «SARS-CoV-2-ИФА-анти-RBD» (МТ-И-С1-04.192, МедипалТех; Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Для этого образцы исследуемых сывороток смешивали с биотинилированным рекомбинантным человеческим рецептором ACE-2 и вносили смесь в лунки ИФА-планшет, сорбированных рекомбинантным RBD. После инкубации и отмывки в лунки

Таблица 1. Исследуемые когорты. Представлены медианные значения, в скобках указан диапазон

Характеристика Пациенты (n = 23) Вакцинированные пациенты (n = 9) Вакцинированные добровольцы (n= 9)

Медианный возраст, лет (межквартильный диапазон) 59 (54-65) 72 (69-79) 34 (33-39)

Пол, % 52% мужчин, 48% женщин 33% мужчин, 67% женщин 56% мужчин, 44% женщин

Время от начала симптомов до первой точки, дни. Медианное значение (мин-макс) 14 (9-17) 10 (5-19) NA

Время от начала симптомов до второй точки, дни. Медианное значение (мин-макс) 135 (116-159) 16 (11-24) NA

Время от первой вакцинации до первой точки исследования, дни. Медианное значение (мин-макс) NA 62 (30-88) 147 (100-263)

Время от первой вакцинации до второй точки исследования, дни. Медианное значение (мин-макс) NA 68 (35-95) 261 (161-349)

добавляли ПХ, конъюгированную со стрептавидином. Для визуализации реакции использовали субстратный раствор ТМБ. Оптическая плотность в лунках была обратно пропорциональна концентрации в образце антител, способных блокировать связывание ACE-2 с RBD. Коэффициент ингибирования (КИ) вычисляли по формуле КИ = (1 - ОПобр/ОПотр) х 100%, где ОПобр — ОП исследуемого образца, а ОПотр — ОП отрицательного контроля, не содержащего антител. Нейтрализующую способность антител считали высокой, если образец сыворотки ингибировал связывание RBD с АСЕ-2 более чем на 30%; промежуточной, если КИ составлял 20-30% и низкой для образцов с КИ менее 20%.

Измерение авидности антител

Авидность IgG, специфичных к RBD SARS-CoV-2, измеряли с помощью набора «SARS-CoV-2-ИФА-IgG плюс» (МТ-И-С1 -03.192, МедипалТех; Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Для этого образцы положительных сывороток в дубликатах вносили в лунки планшет, сорбированных RBD. После инкубации и отмывки в лунки вносили либо ФСБ (нативные условия), либо раствор мочевины (денатурирующие условия). Далее проводили реакцию как обычный непрямой ИФА. Индекс авидности (ИА), пропорциональный устойчивости антител к денатурации, рассчитывали как соотношение ОП при 450 нм в лунках с денатурирующим агентом (4М мочевина) и в контрольных лунках, содержащих ФСБ. Антитела в образцах с ИА >50% считали высокоавидными, с ИА между 40 и 50% — с переходной авидностью, с ИА <40% — низкоавидными.

Статистический анализ данных

Результаты измерений представлены в виде медианных значений с указанием диапазона минимум-максимум. Сравнение групп проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, сравнение результатов, полученных для различных временных точек, проводили с помощью рангового критерия Уилкоксона. Статистически значимыми считали значения при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе работы нами были охарактеризованы антитела у трех исследуемых групп. Во всех образцах сывороток определяли наличие IgG к RBD и Nc SARS-CoV-2, а также

уровень авидности и нейтрализующей способности IgG к RBD. Образцы 23 госпитализированных пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19 продемонстрировали сходную динамику изменения уровня антител. Спустя две недели после появления симптомов все образцы были IgG-положительными как для RBD (медианный S/CO — 10,5; мин-макс — 1,1-13,3), так и для Nc (медианный 9,4; мин-макс 3,2-11,7) (рис. 1; табл. 2). Из 23 образцов 22 (95,6%) продемонстрировали высокую нейтрализующую активность в тесте на ингибирование связывания ACE2 с RBD и низкую авидность с медианой 20% (7,5; 37,3%) антител IgG против RBD. Только один образец в этой когорте имел уровень авидности 64,7%, вероятно, из-за предыдущего незарегистрированного контакта с вирусом. Как и ожидалось, эти результаты свидетельствуют о наличии не прошедших процесс созревания аффинитета вирусспецифичных IgG [4]. Для анализа длительности персистенции антител к SARS-CoV-2 у пациентов, перенесших COVID-19, образцы крови были повторно собраны через 4-6 месяцев после выздоровления. Все образцы оставались положительными на анти-RBD- и анти-Nc-IgG (рис. 2; табл. 2). Медианные значения ИП для анти-RBD-IgG снизились с 10,5 до 6,8 S/CO, а для анти-Nc IgG — с 9,4 до 7,4 S/CO. Образцы с низкими уровнями IgG к RBD (S/CO <5) в первой точке были собраны на 10-12-й дни болезни. Таким образом, пик концентрации антител не был достигнут, что может быть связано с вариабельностью инкубационного периода SARS-CoV-2 и индивидуальной динамикой выработки антител. Тем не менее четыре месяца спустя все пациенты, кроме одного, имели схожие уровни анти-RBD IgG (медиана ИП — 6,8, межквартильный диапазон — 6,3-8,9).

Несмотря на выявленное в данной группе 1,5-кратное снижение уровня IgG к RBD, нейтрализующая активность антител при этом оставалась высокой без значимых различий между первой и второй точками. Это позволяет предположить, что количество антител не является единственным фактором, определяющим нейтрализующую активность. С одной стороны, сохранение высокого уровня нейтрализации при снижении концентрации антител может быть обусловлено качественными изменениями антител, в том числе возрастанием их специфичности и аффинности за этот период, с другой стороны — особенностями тест-системы, используемой в исследовании, поскольку полученные значения близки к верхнему пределу количественного измерения данной тест-системы, что не позволяет надежно оценить изменения нейтрализующей активности. В течение того же периода авидность анти-

А

Время взятия образца

О

о S3

Анти-Nc-lgG

Пациенты (л = 23)

Анти-RBD-lgG

О О оо

Нейтрализация

ns 120

100-! 80-

40-. 20 0

Авидность

Me = 14 Me = 135

Б

Вакцинированные добровольцы (л = 9)

ац

Время взятия образца Анти-Nc-lgG

15-1 ns

О О

С

Me = 147 Me = 261

o-l-t=

Me = 147 Me = 261

Анти-RBD-lgG

Нейтрализация

Me = 147 Me = 261

Авидность

Me = 147 Me = 261

В

Вакцинированные пациенты (n = 9)

Время взятия образца

Анти-Nc-lgG

Анти-RBD-lgG

Нейтрализация

ни S

ци

80-

40-=

О О

120100-

Me = 62 Me = 68

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Me = 62 Me = 68

120100-

Авидность

Me = 62 Me = 68

Рис. 1. Иммунный ответ к БАЯв-СоУ^ в исследуемых группах. (А) Когорта госпитализированных пациентов. (Б) Когорта вакцинированных пациентов. (В) Когорта здоровых добровольцев. Звездочкой отмечены достоверные различия (Т — критерий Уилкоксона). Ме — медианное время забора образцов в группах от начала симптомов или от первой вакцинации указано в подписях к осям графиков

ЯВО-!дО значительно возросла, достигнув высокого уровня (ИА > 50%) у 78% пациентов. Медианное значение авидности во второй точке составило 61,4% (мин-макс — 18,2-86,9%). Оставшиеся шесть пациентов (22%) имели среднюю (40-50%, «зона созревания») или низкую (< 40%) авидность анти-ЯВО-!дО. Важно отметить, что у пяти пациентов с низкой и средней степенью авидности заболевание проходило со средней степенью тяжести или носило тяжелый характер (рис. 3). У одного пациента (рис. 1А; оранжевые точки) низкие уровни анти-ЯВО-!дО и нейтрализующей активности сохранялись во всех точках исследования, однако авидность его анти-ЯВО-!дО увеличилась с 20,4 до 42,7%. К концу периода

госпитализации большинство пациентов обладали высоким уровнем IgG к антигенам SARS-CoV-2, которые были эффективны в предотвращении связывания RBD происходило с человеческим ACE-2. В течение следующих месяцев созревание аффинности анти-RBD IgG и, хотя общая концентрация анти-RBD- и анти-Nc-IgG снижалась, нейтрализующая активность антител оставалась на высоком уровне.

В группе здоровых добровольцев, вакцинированных «Спутником V» (рис. 1 Б), восемь из девяти образцов были положительными по анти-RBD-IgG в первой точке исследования (медиана составила 147 дней после первой вакцинации) с ИП, равным 4,9 S/CO (мин-макс —

Таблица 2. Уровни антител и их характеристика у когорт пациентов с различной степенью тяжести заболевания

Пациенты

Всего (n = 23) Лёгкие (n = 10) Средней тяжести (n = 6) Тяжелые (n = 7)

Острая фаза, медиана (межквартильный диапазон)

1 Анти-RBD-IgG, S/CO 10.5 (7.8-11.8) 10.4 (7.6-11.9) 8.9 (1.5-11.5) 11.3 (10.2-12.8)

Отрицательные, n (%) 1 (4.3) 0 (0) 1 (20) 0 (0)

Положительные, n (%) 22 (95.6) 10 (100) 5 (80) 7 (100)

2 Анти-Nc-IgG, S/CO 9.4 (7.9-10.7) 9.9 (8.8-11.3) 7.45 (3.7-8.55) 10.4 (8.8-10.7)

Отрицательные, n (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

Положительные, n (%) 23 (100) 10 (100) 6 (100) 7 (100)

3 Нейтрализация,% 87.7 (83.3-88.7) 87.5 (78.4-88.9) 87.1 (58.1-88.5) 87.8 (87.3-89.0)

Низкая, n (%) 1 (4.3) 0 (0) 1 (20) 0 (0)

Высокая, n (%) 22 (95.6) 10 (100) 5 (80) 7 (100)

4 Авидность, % 20.4 (14.6-26.3) 19.5 (15.28-25.7) 22.2 (17.4-25.95) 22.4 (8.7-31.6)

Низкая, n (%) 22 (95.6) 9 (90) 6 (100) 7 (100)

Высокая, n (%) 1 (4.3) 1 (10) 0 (0) 0 (0)

4-6 месяцев после выздоровления, медиана (межквартильный диапазон)

1 Анти-RBD-IgG, S/CO 6.8 (6.1-9.0) 6.5 (6.1-8.7) 6.6 (4.7-9.2) 7.3 (6.8-9.8)

Отрицательные, n (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

Положительные, n (%) 23 (100) 10 (100) 6 (100) 7 (100)

2 Анти-Nc-IgG, S/CO 7.4 (4.7-9.2) 7.3 (3.5-9.3) 6.7 (5.5-9.1) 7.4 (3.8-9.4)

Отрицательные, n (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

Положительные, n (%) 23 (100) 10 (100) 6 (100) 7 (100)

3 Нейтрализация,% 86.4 (84.3-89.5) 86.2 (80.9-88.8) 87.1 (69.7-90.1) 85.8 (85.3-89.5)

Низкая, n (%) 1 (4.3) 0 (0) 1 (20) 0 (0)

Высокая, n (%) 22 (95.6) 10 (100) 5 (80) 7 (100)

4 Авидность, % 61.4 (50.0-66.2) 64.7 (52.3-70.0) 55.7 (42.4-62.6) 59.0 (42.2-75.0)

Низкая, n (%) 6 (26.1) 1 (10) 3 (50) 2 (28.6)

Высокая, n (%) 17 (73.9) 9 (90) 3 (50) 5 (71.4)

1-7,9). Четыре месяца спустя (медиана — 261 день после первоначальной вакцинации) анти-ЯВО-!дО-ИП значительно снизился до медианного уровня 1,7 Б/СО, хотя у семи из девяти добровольцев оставались положительными по анти-ЯВО-!дО. У всех вакцинированных добровольцев !дЭ к Ыс у 8АЯ8-Соу-2 отсутствовали, что исключает заражение 8АЯ8-Со^2 в данной группе. Нейтрализующая активность антител коррелировала с динамикой изменения общего количества !дЭ и достоверно снизилась во всех образцах с медианного значения КИ 57,4% в первой точке исследования до медианы 30,6% во второй точке. Авидность антител при этом оставалась высокой, из чего можно заключить, что уже в первой точке исследования (147 дней после вакцинации) созревание аффинитета завершилось у всех вакцинированных. Стоит отметить, что для трех образцов (33%) во второй точке исследования было невозможно оценить авидность из-за низкого уровня анти-ЯВО-!дО (рис. 1Б; показаны синим).

В группе вакцинированных «Спутником V» пациентов с подтвержденным диагнозом СОМО-19 (рис. 1В, табл. 1) медиана времени с момента получения первой дозы вакцины составила 62 дня (30-88), а среднее время забора проб с момента появления симптомов составило 10 дней (5-19). В это время шесть из девяти образцов были положительными на анти-ЯВО-!дО с медианой 4,3 Б/СО

и только два были положительными на анти-1\1с-!дО. Все анти-ЯВО-положительные образцы и один отрицательный образец были положительными в ИФА нейтрализации (медиана — 71,6%, мин-макс — 7,4-98,6%). Большая часть образцов (66,7%) имела антитела с низкой авидностью: медианное значение ИА — 27,6% (мин-макс — 0-71,1%). Повторный забор сыворотки в этой группе осуществляли приблизительно на 16-й день после появления симптомов. Через неделю после первого анализа медиана 8/СО анти-ЯВО-!дО в целом существенно не изменилась (медиана — 7 Б/СО, мин-макс — 0,8-11,2), однако семь из девяти пациентов были серопозитивными после инфекции и/или вакцинации. Нейтрализующая активность также существенно не изменилась (медиана — 92,9%, мин-макс — 23,2-99,2%), то же самое наблюдалось и для авидности антител. В двух образцах с низкими уровнями анти-ЯВО-!дО нейтрализующая активность значительно возросла до 85 и 89%, вероятно, из-за выработки анти-ЯВО-!дМ (рис. 1, желтые точки).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

У переболевших COVID-19 титры вируснейтрализующих антител коррелируют с тяжестью заболевания [5, 6], и такие антитела могут вырабатываться даже при низком уровне

А

Сероконверсия в группах Пациенты

Б

Пациенты, Me = 14

Пациенты, Me = 135

Авидность в группах

Пациенты, Me = 14

Пациенты

Пациенты, Me = 135

си Низкая □ Высокая

Вакцинированные добровольцы

Вакцинированные добровольцы, Вакцинированные добровольцы, Me = 147 Me = 261

ZD IgG положительные zz IgG отрицательные

Вакцинированные пациенты

Вакцинированные пациенты, Вакцинированные пациенты, Me = 10 Me = 16

Вакцинированные добровольцы

Вакцинированные добровольцы, Вакцинированные добровольцы,

Me = 147

Me = 261

Низкая Высокая

□ Низкая 1=3 Высокая

I IgG положительные I IgG отрицательные

IgG положительные IgG отрицательные

Вакцинированные пациенты

Вакцинированные пациенты, Вакцинированные пациенты, Me= 10 Me=16

СИ Низкая

□ Низкая

сз Высокая

п=9 л=9

П = 9 П = 9

Рис. 2. Конверсия ИП анти-ЯВОЧдЭ (А) авидности анти-ЯВОЧдЭ (Б) в исследованных группах. Ме — медианное время от начала симптомов или от первой вакцинации (дни)

соматической гипермутации [7, 8]. Рецепторсвязывающий домен (RBD) является иммунодоминантным и служит мишенью приблизительно для 90% нейтрализующих антител, обнаруживаемых в крови после перенесенной инфекции. Было показано, что титры анти-RBD-IgG снижаются после выздоровления с периодом полувыведения 49 дней. В то же время авидность антител со временем возрастала за счет проходящего процесса «созревания аффинитета» (соматической гипермутации с последующей селекцией на связывание с антигеном). Количество IgG к S-белку и RBD было выше в сыворотках госпитализированных в стационар пациентов в сравнении с больными, перенесшими COVID-19 в легкой или бессимптомной форме [9]. Известно, что авидность антител возрастает в ходе инфекции и сохраняется высокой после выздоровления [1]. В донорских плазмах реконвалесцентов корреляция высокой нейтрализующей активности с авидностью анти-RBD-IgG была выше, чем с авидностью анти-Nc. Это позволяет предположить, что антитела к RBD являются основными вируснейтрализующими антителами после COVID-19.

В проведенном нами исследовании сравнение образцов от госпитализированных пациентов и вакцинированных добровольцев спустя 4-6 месяцев после заболевания или вакцинации показало, что у вакцинированных добровольцев наблюдается достоверно более низкий уровень анти-RBD-IgG и нейтрализующей активности, но при этом достоверно более высокая авидность анти-RBD-IgG (рис. 4А, В). Все госпитализированные пациенты оставались положительными по анти-RBD-IgG, в то время

как у одного из госпитализированных добровольцев уровень антител опустился ниже порога обнаружения (рис. 4В).

Сравнение образцов, полученных от невакцинированных и полностью вакцинированных «Спутником V» пациентов в острой фазе заболевания, показало, что у вакцинированных пациентов уровни антител к ЯВО и Ыс были достоверно ниже, чем у невакцинированных (рис. 4Б). Тем не менее авидность анти-ЯВО-!дО в группе вакцинированных пациентов была достоверно выше, из чего можно заключить, что, несмотря на низкие уровни антител, вакцинация «Спутником V» приводила к развитию первичного иммунного ответа и формированию В-клеток памяти, а выработка антител в ходе инфицирования демонстрирует свойства вторичного иммунного ответа. В долгосрочном периоде степень созревания аффинности антител после вакцинации оказывается выше, чем после перенесенной инфекции. Хотя предполагается, что созревание антител повышает их нейтрализующую активность [10], в нашей работе корреляция между этими параметрами не выявлена.

Стоит отметить, что исследование имеет ряд ограничений, которые необходимо учитывать. Во-первых, выборка образцов, используемая для анализа, достаточно небольшая. Во-вторых, включенные группы пациентов имели ограниченный спектр клинических проявлений COVID-19. В частности, в исследовании не участвовали бессимптомные пациенты и пациенты с легким течением, доля которых наибольшая по сравнению с остальными клиническими формами. Кроме того, исследование

1614 12

О Ю

р

Легкие

п = 10 р = 0 2754

Анти-RBD-lgG

Средне-тяжелые

16 14 12 о ю

С.)

Ж 8

«•V

16 14 12

О 10

о

Тяжелые

О 10

о

Легкие

л = 10 р = 0.0234

<о

16 14 12

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

0 10

О

Анти-Nc-lgG

Средне-тяжелые

п = 6 р = 0.844

Л

16 14 12

О 10

О

Тяжелые

«•V

Л

120-д 100т 80 п ^ 6040-1 20 0

Легкие

п= 10 р> 0.9999

Нейтрализация

Средне-тяжелые

// У

120-д 10080 ^ 604020- 0

п = 6 р = 0.3438

120-д 10080 ^ 604020 0

Тяжелые

п = 7 р = 0.3750

/у /У

Рис. 3. Сравнение антительного ответа у пациентов с различной тяжестью заболевания А Невакцинированные пациенты и вакцинированные добровольцы

Легкие

Авидность

Средне-тяжелые

Тяжелые

п = 7 р = 0.0156

№ о^

Время отбора образцов Анти-№-^

Анти-RBD-lgG

Нейтрализация

Авидность

2 200-= он

Ее Я

ми ии сц

Оч^/А ч,

//

Б

о?

Невакцинированные пациенты и вакцинированные пациенты

Время отбора образцов Анти-Nc-lgG

1

О О

Ю 5-

Анти-RBD-lgG

-I1

о

8 А

Нейтрализация

Авидность

120-. 120-;

100-1 1': О О 8 100-|

^ 60* 40-. ? 60-1 * 40-

20-. 20-1

Л^уу

Л? Л*

•сРс«

В

ч,

Динамика анти-RBD-lgG в группах

Пациенты, Me= 135

Вакцинированные добровольцы, Me = 147

|дв поло»

Пациенты, Me = 14

Вакцинированные пациенты, Me = 16

Динамика авидности в группах

Пациенты, Me=135

Вакцинированные добровольцы, Me= 147

1 Низкая

Пациенты, Me = 14

Вакцинированные пациенты, Me = 16

Рис. 4. Сравнение иммунного ответа в различных группах. (А) Сравнение невакцинированных пациентов и здоровых вакцинированных добровольцев через 4-6 месяцев после инфицирования/вакцинации. (Б) Сравнение вакцинированных и невакцинированных пациентов в острой фазе инфекционного процесса (2-3 недели от начала симптомов). (В) Сравнение сероконверсии по анти-ЯВО-1дО в исследованных группах. (Г) Сравнение динамики изменения авидности анти-ЯВО-1дО в исследованных группах. Звездочкой отмечены достоверные различия (У-критерий Манна-Уитни)

Г

лимитировано лишь двумя временными точками, в которых были проведены наблюдения, что не позволяет оценить, когда именно наступает пик ответа по исследуемым нами параметрам.

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование позволяет оценить основные характеристики антительного ответа. Так, у переболевших мы наблюдали ожидаемую картину, где после острой фазы заболевания, достигнутый уровень антител к ЯВО неизбежно снижается, но по меньшей мере в течение полугода вируснейтрализующая активность сохраняется, что, вероятно, достигается повышением качества антител и ростом авидности. Нами показано, что вакцинация «Спутником V» также приводит к формированию высокоавидных антител, которые сохраняются на протяжении по меньшей мере 6 месяцев наблюдения. Это свидетельствуют о наличии

маркеров защитной эффективности по крайней мере в течение 4-6 месяцев после вакцинации или ранее перенесенного заболевания и адекватности срока, выбранного для повторной иммунизации «Спутником V» на территории России. Наше исследование не позволяет оценить, для каких групп защитная эффективность может составлять меньший срок, чем 6 месяцев, однако исследование группы вакцинированных заболевших показывает наличие низкой авидности у вакцинированных заболевших и это резко контрастирует с группой здоровых вакцинированных, которые на заболели в течение полугода наблюдения. Мы предполагаем, что низкая авидность анти-RBD-IgG, спустя два месяца после вакцинации, может служить не только прогностическим фактором тяжести заболевания, но и одним из потенциальных маркеров для ранней ревакцинации. Дальнейшие исследования на больших группах позволят подтвердить или опровергнуть данную гипотезу.

Литература

1. Benner SE, Patel EU, Laeyendecker O, et al. SARS-CoV-2 antibody avidity responses in COVID-19 patients and convalescent plasma donors. J Infect Dis. 2020; 222: 1974-84.

2. Tang J, Grubbs G, Lee Y, et al. Impact of convalescent plasma therapy on SARS-CoV-2 antibody profile in COVID-19 patients. Clin Infect Dis. 2021; ciab317.

3. Baker KF, Hanrath AT, Schim van der Loeff I, et al. National Early Warning Score 2 (NEWS2) to identify inpatient COVID-19 deterioration: a retrospective analysis. Clin Med (Lond). 2021; 21 (2): 84-89.

4. Paul KS Chan, Pak-Leong Lim, Esther YM Liu, et al. Antibody Avidity Maturation during Severe Acute Respiratory Syndrome-Associated Coronavirus Infection. J Infect Dis. 2005; 192 (1): 166-9.

5. Wang C, Li W, Drabek D, et al. A human monoclonal antibody

blocking SARS-CoV-2 infection. Nat Commun. 2020; 11 (1): 2251.

6. Long Q, Liu B, Deng H, et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nat Med. 2020; 26 (6): 845-8.

7. Kreer C, Zehner M, Weber T, et al. Longitudinal isolation of potent near-germline SARS-CoV-2-neutralizing antibodies from COVID-19 patients. Cell. 2020; 182 (4): 843-54.

8. Chi X, Yan R, Zhang J, et al. A neutralizing human antibody binds to the N-terminal domain of the spike protein of SARS-CoV-2. Science. 2020; 369 (6504): 650-5.

9. Piccoli L, Park Y, Tortorici M, et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike Receptor-Binding Domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 2020; 183 (4): 1024-42.

10. Gaebler C, Wang Z, Lorenzi JCC, et al. Evolution of antibody immunity to SARS-CoV-2. Nature. 2021; 591, 639-44.

References