CC BY
21
© Коллектив авторов, 2022
Ушакова Е.И., Федорова А.А., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И.
Иммуногенность мультиантигенной вакцины, приготовленной из лизата злокачественных клеток опухоли или из ткани первичной солидной опухоли
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Персонализированная вакцинация антигенами опухоли - это одно из самых актуальных направлений в иммунотерапии онкологических больных. Для создания терапевтической вакцины используют различные технологические платформы. Наиболее прогрессивными считают вакцины на основе синтетических пептидов, копирующих мутантные неоантигены, а также вакцины, представляющие собой РНК- или ДНК-векторы, кодирующие неоантигены опухоли. Упомянутые технологические подходы весьма сложны и дороги, требуют значительного времени для их реализации. Мы разрабатываем предельно простой, малозатратный способ приготовления персонализированной противоопухолевой вакцины для его широкого применения в комплексном лечении онкологических больных. Наш подход состоит в использовании ткани опухоли в качестве источника опухолевых антигенов для персонализированной вакцины. Вакцины, приготовленные из ткани опухоли или из злокачественных клеток опухоли, мы называем «персонализированные мультиантигенные противоопухолевые вакцины».
Цель - изучить иммуногенность 2 вариантов мультиантигенной противоопухолевой вакцины, приготовленной из лизата ткани первичной солидной карциномы 4T1 или из чистой культуры злокачественных клеток карциномы 4T1.
Материал и методы. Исследованные в работе мультиантигенные вакцины были приготовлены из ткани солидной 4Т1-карциномы молочной железы мышей BALB/c или из чистой популяции злокачественных клеток 4T1-карциномы, выращенных в условиях культуры клеток in vitro. Гомогенат (лизат) ткани опухоли или 4Т1-клеток дополняли молекулярными иммуноадъювантами из класса PRR-агонистов. Полученные композиции использовали для иммунизации мышей BALB/c. Иммуногены вводили внутри-брюшинно, 4-кратно, с интервалами 2 нед между инъекциями. Системные иммунные реакции против антигенов 4Т1-карциномы, использованных в исследуемых иммуноге-нах, определяли по противоопухолевым Т-клеткам в селезенке и антителам в сыворотке крови мышей. Антиген-реактивные СБ4-Т-клетки и СБ8-Т-клетки памяти, а также Т-клетки-эффекторы, секретирующие интерферон-у, анализировали методом ELISPOT. Антитела к антигенам поверхности клеток карциномы 4T1 анализировали методом проточной цитометрии, антитела к внутриклеточным антигенам карциномы 4T1 - методом иммуноферментного анализа.
Результаты. Мультиантигенные противоопухолевые вакцины на основе гомогената ткани опухоли 4T1 (Multivac-1), а также на основе лизата злокачественных клеток 4T1 (Multivac-4) продемонстрировали высокую иммуногенность. После нескольких инъекций указанных препаратов у мышей BALB/c развивались интенсивные Т-клеточные и антительные реакции против антигенов карциномы 4T1. Суммарный ответ по СБ4-Т-клеткам (клетки-эффекторы + клетки памяти) в селезенке составил около 3000 T-клеток (в расчете на 1 млн Т-клеток) после иммунизации вакциной Multivac-1 и около 8000 Т-клеток при иммунизации вакциной Multivac-4. Суммарный ответ СБ8-Т-клеток (клетки-эффекторы + клетки памяти) при иммунизации Multivac-1 около 3000 и Multivac-4 составил ~ 5000 Т-клеток. Оба вакцинных препарата индуцировали продукцию противоопухолевых антител. В ответ на вакцину Multivac-4 вырабатывалось существенно больше противоопухолевых антител, чем в ответ на вакцину Multivac-1.
Заключение. Использование ткани солидной опухоли или злокачественных клеток опухоли в качестве источника антигенов представляется перспективным технологичес-
Для корреспонденции
Атауллаханов Равшан Иноятович -доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии, заведующий лабораторией активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
ким направлением для приготовления персонализированной терапевтической противоопухолевой вакцины. Иммуногены, приготовленные из лизата ткани первичной солидной карциномы 4Т1 или из чистой культуры злокачественных клеток карциномы 4Т1, усиленные молекулярными адъювантами из класса РКЯ-агонистов, индуцируют сильные противоопухолевые адаптивные иммунные реакции в виде генерации СБ4- и СБ8-Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти, а также продукции специфических антител к антигенам карциномы 4Т1.
Ключевые слова: противоопухолевая терапевтическая вакцина; Т-клеточные реакции; антитела к антигенам опухоли
Статья получена 21.06.2022. Принята в печать 29.07.2022.
Для цитирования: Ушакова Е.И., Федорова А.А., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Иммуно-генность мультиантигенной вакцины, приготовленной из лизата злокачественных клеток опухоли. Иммунология. 2022; 43 (4): 389-400. Б01: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-389-400
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 20-15-00391.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Постановка экспериментов, статистическая обработка, редактирование статьи - Ушакова Е.И.; постановка экспериментов, редактирование статьи - Федорова А. А.; дизайн вакцины, анализ данных, редактирование статьи - Лебедева Е.С.; планирование и постановка экспериментов, анализ данных - Пичугин А.В.; концепция, дизайн экспериментов, анализ данных, написание статьи - Атауллаханов Р.И.
Ushakova E.I., Fedorova A.A., Lebedeva E.S., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I.
Immunogenicity of a multi-antigen vaccine made from a lysate of tumor malignant cells or from primary
solid tumor tissue
National Research Center - Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Personalized vaccination with tumor antigens is one of the most promising trends in immunotherapy for cancer patients. Various technological platforms are used to create a therapeutic vaccine. The most progressive are vaccines based on synthetic peptides that copy mutant neoantigens, as well as vaccines that are RNA- or DNA-vectors encoding tumor neoantigens. The mentioned technological approaches are very complex and expensive, and require considerable time for their implementation. We are developing an extremely simple, low-cost method for preparing a personalized antitumor vaccine for its wide use in the complex treatment of cancer patients. Our approach is to use tumor tissue as a source of tumor antigens for a personalized vaccine. Vaccines prepared from tumor tissue or cancer malignant cells we define as personalized multi-antigen cancer vaccines.
Aim - to study the immunogenicity of two variants of a multiantigen antitumor vaccine prepared from a tissue lysate of primary solid 4T1 carcinoma or from a pure culture of malignant 4T1 carcinoma cells.
Material and methods. The multi-antigenic vaccines studied in this work were prepared from solid 4T1 mammary carcinoma tissue of BALB/c mice or from a pure population of malignant 4T1 carcinoma cells grown under in vitro cell culture conditions. The homogenate (lysate) of tumor tissue or 4T1 cells was supplemented with molecular immunoadjuvants from the class of PRR-agonists. The resulting compositions were used to immunize BALB/c mice. Immunogens were administered intraperitoneally, four times, with intervals of 2 weeks between injections. Systemic immune responses against 4T1 carcinoma antigens used in the studied immunogens were determined according to the numbers of antitumor T cells in the spleen and the levels of tumor-specific antibodies in the blood serum of mice. Antigen-reactive CD4 and CD8 T memory cells, and T effector cells secreting interferon-y were analyzed by ELISPOT. Antibodies to 4T1 carcinoma cell surface antigens were analyzed by flow cytometry. Antibodies to intracellular antigens of 4T1 carcinoma were studied by enzyme immunoassay.
For correspondence
Ravshan I. Ataullakhanov -MD, PhD, Professor, Head of the Immune Biotechnology Dept., Head of the Immunity Activation Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Results. Multi-antigenic antitumor vaccines based on 4T1 tumor tissue homogenate (Mul-tivac-1) or on 4T1 malignant cell lysate (Multivac-4) demonstrated high immunogenicity. After several injections of these immunogens, BALB/c mice developed intense T cell and antibody responses against 4T1 carcinoma antigens. The total response of CD4 T cells (effector cells + memory cells) in the spleen was about 3000 T cells (per 1 million T cells) after immunization with the Multivac-1 and about 8000 T cells after immunization with the Multivac-4. The total response of CD8 T cells (effector cells + memory cells) was about 3000 T cells after immunization with multivac-1 and about 5000 T cells after immunization with Multivac-4. Both vaccine preparations induced the production of antitumor antibodies. Significantly more antitumor antibodies were produced in response to the multivac-4 vaccine than in response to the Multivac-1 vaccine.
Conclusion. The use of solid tumor tissue or tumor malignant cells as a source of antigens seems to be a promising technological approach for the preparation of a personalized therapeutic antitumor vaccine. Immunogens prepared from tissue lysate of 4T1 primary solid carcinoma or from a pure culture of malignant 4T1 carcinoma cells, enhanced with molecular adjuvants from the class of PRR-agonists, induce strong antitumor adaptive immune responses such as the generation of CD4 and CD8 effector T cells and memory T cells, and also production of specific antibodies to 4T1 carcinoma antigens.
Keywords: therapeutic cancer vaccine; T cell responses; antibodies against tumor antigens Received 21.06.2022. Accepted 29.07.2022.
For citation: Ushakova E.I., Fedorova A.A., Lebedeva E.S., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Immunogenicity of a multi-antigen vaccine made from a lysate of tumor malignant cells. Immunologiya. 2022; 43 (4): 389-400. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-389-400 (in Russian)
Funding. The study was supported by a grant from the Russian Science Foundation No. 20-15-00391. Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Conducting experiments, statistical processing, editing the article - Ushakova E.I.; conducting experiments, editing the article - Fedorova A.A.; vaccine design, data analysis, article editing - Lebedeva E.S.; planning and conductiong experiments, data analysis - Pichugin A.V.; concept, design of experiments, data analysis, article writing - Ataullakhanov R.I.
Введение
Персонализированная вакцинация антигенами опухоли - одно из самых актуальных направлений в иммунотерапии онкологических больных. Идея проста и привлекательна. Она состоит в использовании уникальных антигенов опухоли для индукции иммунных реакций против этой опухоли [1].
Для создания терапевтической вакцины используют различные технологические платформы. Наиболее прогрессивными считают вакцины на основе синтетических пептидов, копирующих мутантные неоантигены, а также вакцины, представляющие собой РНК- или ДНК-векторы, кодирующие неоантигены опухоли. Упомянутые технологические подходы весьма сложны и дороги, требуют значительного времени для их реализации. Так, стоимость персонализированной пептидной неоантигенной вакцины в США составляет 90-100 тыс. долларов, а ее изготовление на вЫР-производстве занимает 3-6 мес. При этом нужно помнить, что неоантигенные пептиды для каждого больного уникальны, т. е. подобное производство невыгодно для фармпроиз-водителей. К тому же структура уникальных пептидов предсказывается сложными биоинформатическими методами на основе данных секвенирования ДНК опухоли и ДНК нормальной ткани больного. Секвенирование
и биоинформатический анализ еще более усложняют и удорожают конструирование персонализированной неоантигенной противоопухолевой вакцины. Важно и то, что в среднем лишь треть из предсказанных био-информатиками иммуногенных пептидов в реальности индуцирует иммунные реакции у пациента, т. е. методы предсказания неоантигенов на данном этапе развития технологии неоантигенных персонализированных вакцин пока далеки от желаемой эффективности [2-7].
Описанные выше сложности характерны для технологии конструирования любых неоантигенных вакцин, не только пептидных, но и вакцин на платформе ДНК-или РНК-векторов, кодирующих неоантигены опухоли данного больного. Необходимость поиска уникальных мутаций путем секвенирования ДНК, ИЬЛ -типирование пациента, поскольку неоантигены с разной аффинностью взаимодействуют с различными аллельными вариантами ИЬЛ-молекул, предсказание неоантигенов с помощью несовершенных биоинформатических алгоритмов, дороговизна и значительные затраты времени, необходимые для дизайна, конструирования и производства персонализированной вакцины - все эти непростые условия пока не позволили этому многообещающему направлению занять заметное место в практической онкологии. Несмотря на вполне успешные результаты клинических испытаний, неоантигенные
вакцины еще не получили широкого применения [2-7]. Их перспективы в практической иммунотерапии пока неясны. Несомненно, необходима разработка других методов персонализированной вакцинации, более доступных для практического применения у миллионов больных.
В качестве практически доступной альтернативы, позволяющей дешево и быстро создать персонализированную противоопухолевую вакцину, мы разрабатываем технологию мультиантигенной вакцины из ткани опухоли. Опухоль содержит все антигены, отличающие эту новую ткань от здоровых тканей пациента. Антигены опухоли включают не только неоантигены, являющиеся продуктами соматических мутаций в злокачественных клетках опухоли, но и другие ассоциированные с опухолью антигены, в частности онкоэмбриональные, ра-ково-тестикулярные, а также антигены с повышенным уровнем экспрессии и аберрантные гликоконъюгаты [1].
В работе мы сравниваем иммуногенность мульти-антигенной вакцины, приготовленной из выращенных in vitro злокачественных клеток опухоли (Multivac-4), с аналогичной вакциной, приготовленной из ткани первичной опухоли, полученной путем хирургической резекции (Multivac-1). Обе вакцины индуцируют Т-клеточные и антительные реакции против злокачественных клеток опухоли. Особенности этих реакций анализируются в данной статье.
Материал и методы
Экспериментальные животные. Мыши линии BALB/c 8-10-недельного возраста были получены из питомника «Столбовая», содержались на стандартной диете в стандартных условиях вивария ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными местным комитетом по этике (Резолюция 4/17 от 13.07.2017).
Культуры клеток in vitro. Линия клеток 4T1 карциномы молочной железы (ATCC, США, Cat. No. CRL-2539) была получена от профессора М.Г. Агаджаняна (Institute for Molecular Medicine, Huntington Beach, CA). Суспензии клеток селезенки и костного мозга мыши получали в асептических условиях стандартными методами, описанными ниже. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM (Thermo Fisher Scientific, США) с 25 мМ HEPES, дополненной смесью заменимых аминокислот, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Cytiva, GE Healthcare Life Sciences HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ ß-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы «ПанЭко», Россия), при 37 оС, в увлажненной атмосфере с содержанием 5 % СО2.
Мышей забивали дислокацией шейных позвонков. В асептических условиях выделяли селезенку. Клеточ-
ную суспензию готовили в фосфатном буфере с 0,5 % бычьего альбумина (ФБ-БСА). Фракцию мононуклеар-ных клеток получали методом центрифугирования в градиенте фиколла («ПанЭко», Россия). Клетки отмывали ФБ-БСА. Для сортировки CD4- и CD8-Т-клеток суспензию окрашивали антителами CD4-PE и CD8-APC. Лейкоциты подсчитывали с окрашиванием CD45-BV510. Жизнеспособность суспензий определяли при окрашивании DAPI. Сортировку клеток проводили с помощью проточного цитометра-сортировщика BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США). Чистота полученных популяций CD4- и CD8-Т-клеток составляла 98 %.
Приготовление антиген-презентирующих дендритных клеток in vitro. Дифференцировку дендритных клеток и макрофагов костного мозга мышей осуществляли in vitro в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) (Sigma, США). В асептических условиях выделяли бедренные и большие берцовые кости мышей. Костный мозг вымывали шприцом (игла 25G) в чашку Петри с раствором ФБ-БСА и тщательно суспендировали. Клетки отмывали ФБ-БСА. Эритроциты удаляли осмотическим лизисом. Ядро содержащие клетки культивировали в ПС с добавлением 10 нг/мл ГМ-КСФ и 50 мкМ ß-ME при 37 оС и 5 % CO2. Через 3-4 дня в культуры вносили равный объем ПС с теми же добавками. На 7-й день дендритные клетки активировали LPS из E. coli в конечной концентрации 0,1 мкг/мл и нагружали антигеном. В качестве антигена использовали лизат клеток 4T1 в конечной концентрации 10 мкг/мл (по белку). Концентрацию белка в лизате определяли методом Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, США). Для презентации антигенов в комплексе с MHC-II активированные дендритные клетки нагружали лизатом опухолевых клеток 4T1. Для презентации антигенов в комплексе с MHC-I активированные дендритные клетки культивировали совместно с клетками карциномы 4T1.
Иммунизация мультиантигенной вакциной против карциномы 4T1. Вакцинные антигены получали из ткани опухоли 4T1 или линии злокачественных клеток 4T1, выращенных в культуре in vitro. Для создания солидной опухоли мышам BALB/c подкожно вводили клетки карциномы 4T1 в количестве 15 тыс. клеток на мышь. При достижении размеров опухолей 5-7 мм мышей выводили из эксперимента дислокацией шейных позвонков. Ткань опухоли получали в асептических условиях, измельчали и лизировали с помощью замораживания-оттаивания. Лизат замораживали до использования. Линию клеток 4T1 карциномы поддерживали регулярными пересевами в ПС. Клетки карциномы 4T1 получали из культуры in vitro, лизировали с помощью замораживания-оттаивания. Лизат замораживали до использования. В лизат гомогената опухолевой ткани или лизат клеток 4T1 добавляли молекулярные адъю-ванты, агонисты PRR, действие которых детально исследовано и описано нами ранее [8, 9, 14-18]. Одна доза вакцины для иммунизации мышей BALB/c весом
20-25 г содержала лизат из 50 мг ткани опухоли 4T1 или лизат из 5 млн клеток 4T1, дополненные 10 мкг кислого пептидогликана из растений (агонист TLR4), 4 мкг сополимера полиинозиновой и полицитидиловой кислот (агонист TLR3) и 1,6 мкг неметилированного CpG-олигонуклеотида (агонист TLR9).
Вакцина Multivac-1 была приготовлена на основе лизата ткани опухоли 4T1, а вакцина Multivac-4 - на основе лизата клеток 4T1. Иммунизацию мышей BALB/c вакцинами серии Multivac проводили внутрибрюшинно, 4-кратно, с интервалом 2 нед между иммунизациями. Через 2 нед после последней иммунизации у мышей брали кровь для анализа антител и забивали дислокацией шейных позвонков, выделяли селезенки, в которых методом ELISPOT исследовали количество CD4-и CDS-Т-клеток, секретирующих интерферон(ИФН)-у.
Анализ Т-клеточных реакций, специфичных к антигенам карциномы 4T1. Антиген-специфический ответ Т-клеток оценивали по секреции ИФН-у. Специфический Т-клеточный ответ индуцировали в совместной культуре Т-клеток с антиген-презентиру-ющими дендритными клетками, предварительно нагруженными лизатом клеток 4Т1, как описано выше, или совместно с клетками карциномы 4T1. В лунки планшета для ELISPOT (BD TM ELISPOT Mouse IFN-y, кат. 5510S3, BD Bioscience, США) помещали 30 тыс. CD4-или CDS-Т-клеток, очищенных с помощью проточного сортировщика FACS Aria II, культивировали совместно с 50 тыс. дендритных клеток. Для активации CD8-T-клеток в совместную культуру Т-клеток и дендритных клеток вносили 10 тыс. клеток карциномы 4Т1. Совместные культуры инкубировали в течение 36 ч при 37 °C и 5 % CO2, после чего выявляли клетки, секрети-рующие ИФН-у, в соответствии с инструкцией производителя. Фотографии каждой лунки делали с помощью микроскопа Levenhuk DTX 700 LCD (США), количество спотов считали с помощью компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Количество ИФН-у-секретирующих антиген-реактивных Т-клеток представляли в расчете на 1 млн CD4- или CDS-Т-клеток.
Анализ антител, специфично связывающихся с антигенами карциномы 4T1. Сывороточные антитела, связывающиеся с внутриклеточными антигенами клеток карциномы 4T1, исследовали методом иммуно-ферментного анализа (ИФА). Использовали планшеты MaxiSorp (NUNC). В лунках планшета адсорбировали лизат клеточной линии 4T1. Для этого в каждую лунку вносили 100 мкл лизата с концентрацией 50 мкг/мл, инкубировали в течение 12 ч при 4 °С. После блокирования 4 % БСА в лунки планшета вносили разведения исследуемых сывороток, инкубировали в течение 2 ч. Отмывали фосфатным буфером с 0,05 % Tween-20, затем инкубировали с козьими антителами к тяжелым и легким цепям IgG мыши, конъюгированными с биоти-ном ^at. No. 103008, Bio-Rad, США). Опять отмывали фосфатным буфером с 0,05 % Tween-20 и инкубировали со стрептавидином, конъюгированным с пероксида-зой хрена ^at. No. 710005, Bio-Rad, США). Добавляли
субстрат пероксидазы хрена - ТМБ. Реакцию останавливали раствором серной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм.
Сывороточные антитела, связывающиеся с поверхностью клеток карциномы 4T1, анализировали методом проточной цитометрии. Клетки линии 4T1 инкубировали с различными разведениями сыворотки иммунных или контрольных мышей в течение 30 мин при 4 °С. Потом трижды отмывали буфером, после чего инкубировали в течение 30 мин при 4 °С с козьими антителами против мышиных IgG, конъюгированными с флу-орохромом Alexa fluor-488 (Cat. No. A32723, Invitrogen, США). Флуоресценцию клеток 4T1 измеряли на проточном цитометре FACS Aria II.
Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения Graph-Pad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., США). Статистическую значимость между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием критерия Брауна-Форсайта или с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием критерия Шидака (значения p < 0,05 считались значимыми). На графиках представлены средние значения и стандартное отклонение.
Результаты
Генерация Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти в результате иммунизации мультиантигенной вакциной против 4Т1-карциномы
Мышей иммунизировали вакциной Multivac 4-кратно, с интервалом 2 нед между иммунизациями. Через 2 нед после последней иммунизации у мышей брали кровь для анализа антител в сыворотке и выделяли селезенку. Приготовление суспензии клеток селезенки проводили общепринятыми методами в асептических условиях. C помощью сортировки на FACS-Aria II из суспензии клеток селезенки получали очищенные популяции CD4- и СБ8-Т-клеток (чистота - 98 %).
На рис. 1 представлены результаты исследования Т-клеточных реакций в ответ на иммунизацию вакциной Multivac-4, приготовленной из лизата злокачественных клеток 4T1. Системный Т-клеточный ответ на иммунизацию анализировали по количеству Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти.
Т-клетки-эффекторы возникают в процессе иммунной реакции на антигены раньше клеток памяти. Клетки-эффекторы получают антигенную стимуляцию в организме вакцинированной мыши и потому не нуждаются в дополнительной стимуляции вне организма. Напротив, Т-клетки памяти уже прекратили пролиферацию и секрецию цитокинов, превратились в молчащие клетки памяти. Чтобы их выявить, Т-клетки памяти необходимо реактивировать ex vivo с помощью анти-ген-презентирующих клеток. В качестве антиген-пре-зентирующих для CD4-Т-клеток мы использовали дендритные клетки, представляющие антигены опухоли 4T1 в комплексе с молекулами MHC-II. Для реактива-
Multivac-4
Т-клетки-эффекторы
Антиген-реактивные Т-клетки памяти
3000 п
p < 0,001
p < 0,001
н
Ё 'я
В 2
2 s
(D Д
О Д
^ и
И §
© Б
к s
2000-
1000 -
ён Ц
8000-, Р < 0,001
6000-
2 s
4000 -
S ¥ Ь
И 2000
S S и о " Ы S
Сортированные Сортированные Несортированные
С04-Т-клетки из селезенки
С08-Т-клетки из селезенки
клетки селезенки
селезенки
p < 0,001
Клетки Клетки
селезенки
Сортированные Сортированные
С04+-Т-клетки С08+-Т-клетки (реактивация (реактивация (реактивация (реактивация
ДК + лизат 4Т1) ДК + клетки 4Т1) ДК + лизат 4Т1) ДК + клетки 4Т1)
Контроль
Multivac-4
Рис. 1. Т-клеточные реакции, специфичные к антигенам карциномы 4Т1, после иммунизации мышей БЛЬБ/с мультиантигенной вакциной МиШуас-4, приготовленной из лизата чистой культуры злокачественных клеток 4Т1 с добавлением молекулярных им-муноадъювантов
Группа реципиентов вакцины МиШуас-4 (вакцинированные) - 15 мышей; контрольная группа (невакцинированные) - 10 мышей.
0
0
ции СБ8-Т-клеток мы использовали антиген-презенти-рующие дендритные клетки, представляющие антигены 4Т1 в комплексе с МНС-1.
Через 2 нед после последней иммунизации мышей БЛЬБ/с мультиантигенной вакциной МиШуас-4 в селезенке мышей мы обнаружили большое количество Т-клеток, специфически реагирующих на антигены карциномы 4Т1, т. е. иммунизация оказалась высокоэффективной. Т-клетки в селезенке демонстрировали мощный системный иммунный ответ против антигенов опухоли 4Т1 (рис. 1). Количество СБ4- и СБ8-Т-клеток-эффекторов, секретирующих ИФН-у, превышало 2000 (в расчете на 1 млн соответствующих Т-клеток). Количество антиген-реактивных Т-клеток памяти, способных распознавать антигены карциномы 4Т1 и в ответ на это распознавание секретировать ИФН-у, составило ~ 5500 (на 1 млн) для СБ4-Т-клеток и ~ 3500 для СБ8-Т-клеток.
Иммунизация другой мультиантигенной вакциной МиШуас-1, изготовленной из гомогената ткани карциномы 4Т1, тоже оказалась эффективной в индукции системного Т-клеточного ответа против антигенов опухоли 4Т1 (рис. 2). СБ4-Т-клеток-эффекторов в селезенке было ~ 2000 (на 1 млн), и антиген-реактивных СБ8-Т-клеток памяти — 3000 (на 1 млн). Это довольно сильные Т-клеточные реакции и хорошая Т-клеточная память. Однако число СБ8-Т-клеток-эффекторов и СБ4-Т-клеток памяти оказалось небольшим. Причины невысокого количества этих клеток мы не анализировали в данной работе. Это могло быть связано с тем, что через 2 нед после иммунизации реакция СБ4-Т-клеток была все еще в продуктивной фазе, в стадии клеток-эффекторов, еще не превратившихся в клетки памяти,
а реакция CDS-Т-клеток, напротив, уже успела завершить эффекторную фазу и большинство антиген-специфических CDS-Т-клеток уже достигли стадии клеток памяти.
Сравнение иммуногенности двух мультиантигенных вакцин Multivac-4 и Multivac-1
Прямое сравнение параметров иммунных реакций в ответ на два варианта мультиантигенной вакцины: Mul-tivac-1 и Multivac-4 - представлено на рис. 3. Чтобы сопоставить уровень иммунной реакции на вакцинацию с уровнем естественной иммунной реакции на растущую опухоль 4T1, на тех же рисунках мы представили иммунные ответы мышей BALB/c на антигены прогрессивно растущей солидной карциномы 4T1, достигшей больших размеров (~ 1 см). Сравнение уровней Т-клеточных иммунных реакций показывает, что обе вакцины высокоэффективны. Суммарный ответ по CD4-Т-клеткам (клетки-эффекторы + клетки памяти) составил ~ 3000 T-клеток после иммунизации вакциной Multivac-1 и ~ S000 Т-клеток при иммунизации вакциной Multivac-4. Суммарный ответ CDS-Т-клеток (клетки-эффекторы + клетки памяти) составил при иммунизации Multivac-1 ~ 3000, при иммунизации Multivac-4 — 5000 Т-клеток.
Таким образом, обе вакцины вызывали интенсивные Т-клеточные реакции, направленные против антигенов 4Т1-карциномы. Амплитуда реакций после введения Multivac-4 была выше, чем после введения Multivac-1. Реакция CD4-Т-клеток была выше приблизительно в 3 раза, а CDS - приблизительно в 2 раза. При этом попу-ляционная структура реагирующих Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти значительно различалась, возможно, это связано с различной динамикой ответов на Multi-vac-1 и Multivac-4. Так, через 2 нед после последней им-
Multivac-1
Т-клетки-эффекторы
Антиген-реактивные Т-клетки памяти
3000 -,
н
Ü!
(D Д
О Д
^ и
К й
© Б
S Й
° т
p < 0,001
2000-
1000 -
4000 -,
С04-Т-клетки из селезенки
С08-Т-клетки из селезенки
клетки селезенки
Контроль
к К
л
о W
и s
Сортированные Сортированные Несортированные
p < 0,001
£ н |
8 Й § -рин
М Й ^
¡3 S S
3000-
2000 -
5 ? 6
& 1000 -
p < 0,05
Сортированные Сортированные Клетки Клетки
С04+-Т-клетки С08+-Т-клетки селезенки селезенки
(реактивация (реактивация (реактивация (реактивация
ДК + лизат 4Т1) ДК + клетки 4Т1) ДК + лизат 4Т1) ДК + клетки 4Т1)
Multivac-1
Рис. 2. Т-клеточные реакции, специфичные к антигенам карциномы 4Т1, после иммунизации мышей БЛЬБ/с мультиантигенной вакциной МиШуас-1, приготовленной из гомогената ткани карциномы 4Т1 с добавлением молекулярных иммуноадъювантов Группа реципиентов вакцины МиШуас-1 (вакцинированные) - 15 мышей; контрольная группа (невакцинированные) - 10 мышей.
0
0
мунизации отношение числа СБ4-Т-клеток-эффекторов к числу СБ4-Т-клеток памяти составило ~ 4 у мышей, вакцинированных МиШуас-1, и ~ 1 у мышей, вакцинированных МиШуас-4. Отношение числа СБ8-Т-клеток-эффекторов к числу СБ8-Т-клеток памяти составило ~ 0,25 и 1 у мышей, иммунизированных МиШуас-1 и Ми1-йуас-4 соответственно. Это означает, что после вакцинации МиШуас-1 превращение СБ8-Т-клеток-эффекторов в СБ8-Т-клетки памяти происходило быстрее, чем после вакцинации МиШуас-4 (см. рис. 3).
Т-клеточная иммунная реакция в ответ на вакцины МиШуас-1 и МиШуас-4 оказалась значительно более интенсивной, чем Т-клеточная реакция на прогрессивно растущую опухоль 4Т1. Особенно сильно отличалась реакция СБ8-Т-клеток. Так, в селезенке мышей с прогрессивно растущей большой опухолью 4Т1 мы обнаружили ~ 1500 СБ4-Т-клеток-эффекторов и ~ 1000 СБ4-Т-клеток памяти, и всего лишь ~ 500 СБ8-Т-клеток-эффекторов и ~ 600 СБ8-Т-клеток памяти. Суммарное количество противоопухолевых СБ8-
С04-Т-клетки-эффекторы
ns
3000 и
2000-
1000 -
ns ns
8000
СБ4-Т-клетки памяти
p < 0,05 ns p < 0,05
СБ8-Т-клетки-эффекторы p < 0,001
СБ8-Т-клетки памяти p < 0,001
3000-
p < 0,001 5000 p < 0,05
Рис. 3. Сравнение интенсивности Т-клеточных реакций в ответ на иммунизацию вакцинами МиШуас-1 и МиШуас-4 «Мыши-опухоленосители» - Т-клетки из селезенки мышей БЛЬБ/с на 30-й день после инокуляции 15 тыс. клеток карциномы 4Т1 (размер солидной опухоли ~ 1 см); группы реципиентов вакцин МиШуас-1 или МиШуас-4 (вакцинированные) - по 15 мышей; контрольная группа (невакцинированные) - 10 мышей; группа мышей-опухоленосителей - 10 животных.
ns
ns
0
4-1
3-
2-
е
о
1-
-А- Ми11хуас-4 • Контроль
* р < 0,05 ** р < 0,01 ****р < 0,0001
100 1000 10 000 100 000 Разведения сывороток
1 000 000
2,0
1,5
1,0
С
о
0,5
0,0
■ Ми11™ас-1 Контроль
100 1000 10 000 100 000
Разведения сывороток
1 000 000
Рис. 4. Анализ сывороточных антител, связывающихся с лизатом клеток карциномы 4Т1 в иммуноферментном анализе МиШуас-1 и МиШуас-4 - группы мышей, иммунизированных соответствующей вакциной (п = 4); контроль - интактные мыши (п = 4).
0
Т-клеток в организме мышей с большой опухолью 4Т1 составило ~ 1000 против ~ 3000 и 5000 у мышей, вакцинированных МиШуас-1 и МиШуас-4, соответственно.
Антительная реакция на иммунизацию мультиантигенной вакциной
Наряду с Т-клеточными реакциями против антигенов 4Т1-карциномы иммунизация мультиантигенными вакцинами МиШуас-1 и МиШуас-4 вызывала продукцию антител, специфично связывающихся с антигенами карциномы 4Т1. На данном этапе исследования мы не работали с точно идентифицированными антигенами клеток 4Т1, а лишь проверяли, индуцируют ли вновь созданные вакцинные препараты продукцию антител, способных связываться с какими-то поверхностными и внутриклеточными антигенами злокачественных клеток карциномы 4Т1. Наличие в сыворотках иммунизированных мышей антител, способных связываться с антигенами на поверхности клеток 4Т1, мы анализировали методом проточной цитометрии. Антитела, способные связываться с антигенами лизата клеток 4Т1, исследовали с помощью ИФА.
Анализ взаимодействия сывороточных антител с антигенами лизата злокачественных клеток 4Т1 показал, что иммунизация МиШуас-4 вызывала накопление большого количества антител к внутриклеточным антигенам злокачественных клеток 4Т1. Напротив, вакцина МиШуас-1 индуцировала очень слабую реакцию анти-телообразования (рис. 4). При исследовании методом проточной цитометрии антител, связывающихся с антигенами на поверхности клеток 4Т1, также оказалось, что иммунизация МиШуас-4 индуцировала интенсивную продукцию антител, а после иммунизации МиШуас-1 таких антител практически не обнаруживалось (рис. 5).
Обсуждение
Представленные в данной работе результаты нашего исследования имеют много полезных и интересных следствий. Идея использовать ткань опухоли для соз-
дания противоопухолевой вакцины оказалась продуктивной. Эта идея не нова, имеются вполне успешные примеры [10-13]. Вместе с тем наши предшественники не предложили метода получения противоопухолевой вакцины, пригодного для широкого внедрения в практическую онкологию. Для масштабного практического применения необходима новая технология, не требующая дорогостоящих измерений, вычислений, синтезов и промышленных производств, поскольку все это нереально для создания уникальной вакцины для каждого пациента. Наша работа, описанная в этой статье, как раз и посвящена разработке такой простой технологии приготовления вакцины, вполне пригодной для тиражирования при лечении многих тысяч онкологических пациентов.
Для изготовления персонализированной вакцины мы использовали антигенный материал, содержащийся в самих злокачественных клетках опухоли. Нам оставалось лишь получить мультиантигенный лизат, что позволяет обезвредить опухолевые клетки и одновременно вскрыть содержащиеся в них антигены. Наличия антигенов недостаточно для эффективной индукции иммунных реакций против этих антигенов. По этой причине мы дополнили мультиантигенный лизат молекулярными адъювантами, исследования которых опубликованы в наших прежних сообщениях [14-18].
Иммунизация лабораторных мышей двумя вариантами мультиантигенной вакцины показала, что этот подход эффективен. В организме мышей удалось индуцировать сильные адаптивные иммунные реакции против опухоли. При этом важно, что происходила системная генерация Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти, а также продукция противоопухолевых антител.
Мы не случайно сосредоточили свое внимание на генерации СБ4- и СБ8-Т-клеток, секретирующих ИФН-у. Хорошо известно, что такая поляризация Т-клеточных реакций особенно эффективно защищает от злокачественной опухоли, поскольку она отражает поляризацию в направлении дифференцировки Т-хелперов 1-го типа (ТЫ) и цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ). В свою
100-,
80-
s 3 2
а s
3
£
60-
40-
20-
-А- Multivac-4 • Контроль
* p < 0,05 **p < 0,01 ****p < 0,001
10 100 1000 10 000 Разведения сывороток
Н
4 к
л
н
S
8000-,
6000-
4000-
2000-
- Multivac-4 Контроль
* p < 0,05
100 000
10 100 1000 10 000 100 000
Разведения сывороток
*
и
3 2
£
50 и
40-
30-
20-
10-
Multivac-1 Контроль
10 100 1000 10 000 Разведения сывороток
100 000
ор
л
н
s
800 п
600-
400-
200-
Multivac-1 Контроль
10 100 1000 10 000 Разведения сывороток
100 000
Рис. 5. Исследование методом проточной цитометрии сывороточных антител, связывающихся с поверхностью клеток карциномы 4Т1
МиШуас-1 (п = 4) и МиШуас-4 (п = 4) - группы мышей, иммунизированных соответствующей вакциной; контроль (п = 4) - ин-тактные мыши.
очередь ТЫ -поляризация гарантирует продукцию высокоаффинных антител, относящихся к изотипам, необходимым для опосредованной антителами противоопухолевой атаки НК-клеток и фагоцитов. Представленные в данной работе результаты иммунизации препаратами МиШуас-1 и МиШуас-4 показывают высокую иммуно-генность этих вакцинных композиций в плане индукции ТЫ- и СБ8-Т-клеточных ответов против опухоли, антигены которой были использованы в составе этих вакцин.
По ряду признаков, иммунные реакции в ответ на МиШуас-1 несколько уступают реакциям на МиШуас-4 (см. рис. 1-3). Это вполне ожидаемый результат. Для приготовления МиШуас-4 использован лизат клеток опухолевой линии 4Т1, т. е. материал, на 100 % состоявший из злокачественных клеток. А вакцинный препарат МиШуас-1 приготовлен из гомогената ткани опухоли, полученной после хирургической резекции. В ткани опухоли доминируют злокачественные клетки, но они не способны сформировать растущую ткань без помощи нормальных клеток - фибробластов, макрофагов,
дендритных и эндотелиальных клеток, перицитов сосудов. Кроме того, в ткани опухоли имеются клетки-мигранты, пришедшие из кровотока, клетки инфильтрата. Все упомянутые типы клеток - необходимые участники опухолевого микроокружения. Без них опухоль не может существовать и прогрессивно расти.
Понятно, что для приготовления вакцины лучше использовать 100 % суспензию злокачественных клеток, а не ткань опухоли. Нужные для иммунизации опухолевые антигены содержатся именно в злокачественных клетках. Дополнительный материал в виде незлокачественных клеток и компонентов стромы - это ненужный балласт при изготовлении противоопухолевой вакцины. Однако именно материал хирургически резецированной опухоли - самый доступный в практической онкологии материал, который можно было бы использовать для приготовления персонализированной противоопухолевой вакцины. Результаты нашей работы доказывают, что ткань опухоли, полученная путем хирургической резекции, вполне пригодна для создания персонализированной вакцины типа МиШуас.
*
0
0
0
0
Мы показали, что мультиантигенные вакцины Multi-vac-1 и Multivac-4 эффективно индуцируют генерацию Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти. Эти типы клеток являются стадиями единого процесса Т-клеточной адаптивной реакции в ответ на иммунизацию. Получив все необходимые сигналы активации, наивные Т-клетки размножаются и дифференцируются в Т-клетки-эффекторы. Именно последние защищают от опухоли, поскольку с их функциональной активностью связана продукция противоопухолевых цитокинов, цитотокси-ческих клеток и высокоаффинных антител. Следовательно, эффективная продукция Т-клеток-эффекторов в ответ на иммунизацию Multivac-1 или Multivac-4 может обеспечить терапевтическое действие при лечении онкологического больного.
Т-клетки памяти возникают из Т-клеток-эффекторов на более поздних стадиях адаптивной иммунной реакции. Т-клетки памяти тоже очень важны для результата лечения. Формирование значительного пула Т-клеток памяти, способных распознать антигены опухоли и реактивироваться, превращаясь в новые Т-клетки-эффекторы, представляет собой очень важный фактор защиты от рецидива опухоли. Оставаясь в организме на годы, Т-клетки памяти обеспечат надежную защиту от возможного повторного роста опухоли. Они осуществят надежный иммунный контроль злокачественных клеток, способных оставаться в латентном состоянии в течение нескольких лет, а затем реактивироваться и давать новые очаги злокачественного роста.
Сравнение иммунных реакций мышей в ответ на иммунизацию Multivac-1 и Multivac-4 с иммунными реакциями на те же опухолевые антигены у мышей с прогрессивно растущей, большой опухолью показало (см. рис. 3), что вакцинные препараты индуцируют значительно более интенсивные иммунные реакции против опухоли. Следовательно, терапевтическая иммунизация противоопухолевыми вакцинами типа Multivac имеет значительный потенциал для формирования более сильных и более эффективных иммунных реакций, чем те реакции, которые развиваются в процессе роста опухоли.
Опухоль потому и растет, что выработала механизмы ухода от иммунного контроля. А терапевтическая вакцинация должна разорвать порочный круг иммуносупрес-сии, созданный и поддерживаемый опухолью. Вакцина должна индуцировать мощные противоопухолевые иммунные реакции вопреки сложившейся в организме неблагоприятной, иммуносупрессивной ситуации, переломить ход иммунной баталии в пользу больного.
В данной работе удалось индуцировать высокий уровень противоопухолевых иммунных реакций у ин-
■ Литература
1. Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М. Вакцины для лечения злокачественных новообразований. Иммунология. 2019; 40 (4): 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-140
2. Sahin U., Derhovanessian E., Miller M., Kloke B.P., et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immuni-
тактных, здоровых мышей БЛЬБ/с. В реальной онкологической практике придется лечить больного, иммунная система которого сильно супрессирована, ослаблена, разрушена. С самого начала онкологического процесса опухоль возникает при функциональной несостоятельности иммунного контроля за возникающими мутант-ными клетками, способными к злокачественному росту. По мере прогрессивного размножения злокачественные клетки и рекрутированные ими клетки микроокружения (ассоциированные с опухолью макрофаги, дендритные клетки, миелоидные супрессоры, регуляторные Т-клетки) дополнительно супрессируют иммунную систему. Следовательно, у реального больного в онкологической практике нужно проводить иммунотерапию на фоне выраженной системной иммуносупрессии, а также в условиях дефицита каких-то важных звеньев иммунитета. Нам предстоит изучить эффективность иммунизации вакцинными препаратами типа МиШуас в организме с дефектной иммунной системой на фоне иммуносупрессии, вызванной опухолью.
Обозначенная проблема иммуносупрессии - не единственная из тех, что придется решить применительно к иммунотерапии мультиантигенными вакцинами типа МиШуас. Представленная работа - лишь первый шаг в данном направлении. В будущем предстоит оптимизировать состав вакцины, методику ее приготовления, дозу и способ введения, кратность, интервалы между введениями. Необходимо исследовать эффективность вакцины в организме с растущей опухолью, а также после ее резекции и при наличии множественных метастазов. Целесообразно изучить, как сочетается новый метод персонализированной вакцинации с другими методами лечения онкологической патологии: химиотерапией, таргетной терапией, хирургической резекцией, блокадой рецепторов, ингибирующих контрольные точки иммунитета, и другими современными методами иммунотерапии злокачественных новообразований.
Выводы
1. Из гомогената (лизата) злокачественных клеток, а также из ткани солидной опухоли можно приготовить эффективные иммуногены, индуцирующие интенсивные противоопухолевые реакции СБ4- и СБ8-Т-клеток и антителообразование.
2. Индуцированные иммунные реакции по своей интенсивности во много раз превышают спонтанно развивающиеся иммунные реакции на растущую опухоль.
3. Работу над мультиантигенными вакцинами типа МиШуас целесообразно продолжить с целью их оптимизации и эффективного встраивания в текущие протоколы лечения пациентов с онкологической патологией.
ty against cancer. Nature. 2017; 547: 222-6. DOI: https://doi.org/10.1038/ nature2300
3. Sahin U., Oehm P., Derhovanessian E., et al. An RNA vaccine drives immunity in checkpoint-inhibitor-treated melanoma. Nature. 2020; 585 (7823): 107-12. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2537-9
4. Blass E., Ott P.A. Advances in the development of personalized neoantigen-based therapeutic cancer vaccines. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18 (4): 215-29. DOI: https://doi.org/10.1038/s41571-020-00460-2
5. Ott P.A., Hu Z., Keskin D.B., et al. An immunogenic personal neo-antigen vaccine for patients with melanoma [published correction appears in Nature. 2018 Mar 14; 555 (7696): 402]. Nature. 2017; 547 (7662): 21721. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22991
6. Keskin D.B., Anandappa A.J., Sun J., et al. Neoantigen vaccine generates intratumoral T cell responses in phase Ib glioblastoma trial. Nature. 2019; 565 (7738): 234-9. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-018-0792-9
7. Lang F., Schrors B., Lower M., Tûreci О., Sahin U. Identification of neoantigens for individualized therapeutic cancer vaccines. Nat Rev Drug Discov. 2022; 21 (4): 261-82. DOI: https://doi.org/10.1038/s41573-021-00387-y
8. Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Багаев А.В., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Комбинированная иммунотерапия метастатической карциномы у лабораторных мышей путем резекции первичного опухолевого узла и последующего перепрограммирования макрофагов и дендритных клеток с помощью агониста TLR4. Иммунология. 2021; 42 (5): 490-501. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-490-501
9. Багаев А.В., Рыбинец А.С., Федорова А.А., Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Синергизм агонистов TLR3 и TLR4 при перепрограммировании макрофагов в противоопухолевое состояние. Иммунология. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630
10. Shah N.J., Najibi A.J., Shih T.Y., et al. A biomaterial-based vaccine eliciting durable tumour-specific responses against acute myeloid leukaemia. Nat Biomed Eng. 2020; 4 (1): 40-51. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41551-019-0503-3
11. Shih T. Y., Blacklow S.O., Li A.W., et al. Injectable, Tough Alginate Cryogels as Cancer Vaccines. Adv Healthc Mater. 2018; 7 (10): e1701469. DOI: https://doi.org/10.1002/adhm.201701469
12. Wang H., Najibi A.J., Sobral M.C., et al. Biomaterial-based scaffold for in situ chemo-immunotherapy to treat poorly immunogenic
tumors. Nat Commun. 2020; 11 (1): 5696. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41467-020-19540-z
13. Langellotto F., Dellacherie M.O., Yeager C., et al. A Modular Biomaterial Scaffold-Based Vaccine Elicits Durable Adaptive Immunity to Subunit SARS-CoV-2 Antigens. Adv Healthc Mater. 2021; 10 (22): e2101370. DOI: https://doi.org/10.1002/adhm.202101370
14. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Гараева А.Я., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Кооперативное взаимодействие сигнальных путей рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 в макрофагах мыши. Иммунология. 2018; 39 (1): 4-11. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-4-11
15. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М.М., Атауллаханов Р. И. Комбинированное применение трех агонистов рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 синергически увеличивает выработку белков-цитокинов макрофагами мыши. Иммунология. 2018; 39 (4): 172-7. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-172-177
16. Чулкина М.М., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Гараева А.Я., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Синергическая активация транскрипции генов INOS, IFN-ß, IL12p40, IL6, TNF-a при одновременном воздействии на макрофаги агонистами рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2. Иммунология. 2018; 39 (4): 178-85. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2018- 39-4-178-185
17. Лебедева Е.С., Джаруллаева А.Ш., Багаев А.В., Ерохо-ва А.С., Чулкина М.М., Тухватулин А.И., Пичугин А.В., Логунов Д.Ю., Атауллаханов Р.И. Сочетанная стимуляция рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 синергически повышает защиту лабораторных мышей в модели летальной инфекции Salmonella enterica. Иммунология. 2018; 39 (5-6): 252-7. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-252-257
18. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Ataullakha-nov R., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunology. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x
■ References
1. Lebedeva E.S., Ataullakhanov R.I., Khaitov R.M. Vaccines for the treatment of malignant neoplasms. Immunologiya. 2019; 40 (4): 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-14008 (in Russia)
2. Sahin U., Derhovanessian E., Miller M., Kloke B.P., et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature. 2017; 547: 222-6. DOI: https://doi.org/10.1038/ nature2300
3. Sahin U., Oehm P., Derhovanessian E., et al. An RNA vaccine drives immunity in checkpoint-inhibitor-treated melanoma. Nature. 2020; 585 (7823): 107-12. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2537-9
4. Blass E., Ott P.A. Advances in the development of personalized neoantigen-based therapeutic cancer vaccines. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18 (4): 215-29. DOI: https://doi.org/10.1038/s41571-020-00460-2
5. Ott P.A., Hu Z., Keskin D.B., et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma [published correction appears in Nature. 2018 Mar 14;555(7696):402]. Nature. 2017; 547 (7662): 217-21. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22991
6. Keskin D.B., Anandappa A.J., Sun J., et al. Neoantigen vaccine generates intratumoral T cell responses in phase Ib glioblastoma trial. Nature. 2019; 565 (7738): 234-9. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-018-0792-9
7. Lang F., Schrors B., Lower M., Tureci O., Sahin U. Identification of neoantigens for individualized therapeutic cancer vaccines. Nat Rev Drug Discov. 2022; 21 (4): 261-82. DOI: https://doi.org/10.1038/s41573-021-00387-y
8. Ushakova E.I., Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Combined immunotherapy of metastatic carcinoma by resection of the primary tumor and subsequent reprogramming of macrophages and dendritic cells using a TLR4 agonist in laboratory mice. Immunologi-ya. 2021; 42 (5): 490-501. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-490-501 (in Russian)
9. Bagaev A.V., Rybinets A.S., Fedorova A.A., Ushakova E.I., Lebedeva E.S., Pichugin A. V., Ataullakhanov R.I. Synergism of TLR3 and TLR4 agonists during reprogramming of macrophages to antitumor state.
Immunologiya. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630 (in Russian)
10. Shah N.J., Najibi A.J., Shih T.Y., et al. A biomaterial-based vaccine eliciting durable tumour-specific responses against acute myeloid leukaemia. Nat Biomed Eng. 2020; 4 (1): 40-51. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41551-019-0503-3
11. Shih T.Y., Blacklow S.O., Li A.W., et al. Injectable, Tough Alginate Cryogels as Cancer Vaccines. Adv Healthc Mater. 2018; 7 (10): e1701469. DOI: https://doi.org/10.1002/adhm.201701469
12. Wang H., Najibi A.J., Sobral M.C., et al. Biomaterial-based scaffold for in situ chemo-immunotherapy to treat poorly immunogenic tumors. Nat Commun. 2020; 11 (1): 5696. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41467-020-19540-z
13. Langellotto F., Dellacherie M.O., Yeager C., et al. A Modular Biomaterial Scaffold-Based Vaccine Elicits Durable Adaptive Immunity to Subunit SARS-CoV-2 Antigens. Adv Healthc Mater. 2021; 10 (22): e2101370. DOI: https://doi.org/10.1002/adhm.202101370
14. Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Garaeva A.Y., Chulkina M.M., Pi-chugin A.V., Ataullakhanov R.I. The cooperative interaction of TLR4-, TLR9- and NOD2-signaling pathways in mouse macrophages. Immu-nologiya. 2018; 39 (1): 4-11. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-4-11 (in Russian)
15. Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M.M., Ataullakhanov R.I. Combined activation with agonists of TLR4, TLR9 AND NOD2 receptors synergistically increases production of cytokine-proteins in mouse macrophages. Immunologiya. 2018; 39 (4): 172-7. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-172-177 (in Russian)
16. Chulkina M.M., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Garaeva A.Ya., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Synergistic activation of inos, ifn-ß, il12p40, il6, tnf-a genes transcription in macrophages under simultaneous influence with agonists of TLR4, TLR9 and NOD2 receptors. Immunologiya. 2018; 39 (4): 178-85. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-178-185 (in Russian)
17. Lebedeva E.S., Dzharullaeva A.Sh., Bagaev A.V., Erokhova A.S., Chulkina M.M., Tukhvatulin A.I., Pichugin A.V., Logunov D.Yu., Ataul-lakhanov R.I. Combined stimulation of receptors of TLR4, TLR9 and NOD2 synergistically increases protection of laboratory mice in lethal Salmonella enterica infection model. Immunologiya. 2018; 39 (5-6): 252-7. DOI: http:// dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-252-257 (in Russian)
Сведения об авторах
Ушакова Екатерина Игоревна - мл. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отдела иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ekaterina.ushakova95@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2143-1021
Федорова Анастасия Алексеевна - лаборант лаб. активации иммунитета отдела иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: anastasyafedorovafedorova@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-2687-9319
Лебедева Екатерина Семеновна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отдела иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ekaterinalebedeva2612@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0384-9299
Пичугин Алексей Васильевич - канд. физ.-мат. наук, вед. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отдела иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: pichalvas@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5356-3331
Атауллаханов Равшан Иноятович - д-р мед. наук, проф., рук. отдела иммунной биотехнологии, зав. лаб. активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
18. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Ataullakha-nov R., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunology. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x
Authors' information
Ekaterina I. Ushakova - Junior Researcher, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ekaterina.ushakova95@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2143-1021
Anastasiya A. Fedorova - Research Assistant, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: anastasyafedorovafedorova@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-2687-9319
Ekaterina S. Lebedeva - PhD, Senior Researcher, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ekaterinalebedeva2612@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0384-9299
Alexey V. Pichugin - PhD, Leader Researcher, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: pichalvas@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5356-3331
Ravshan I. Ataullakhanov - MD, PhD, Prof., Head of Immune Biotechnology Dept., Head of Immunity Activation Lab., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
