CC BY
13
ИММУНИЗАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКОМ PRAME ЗАМЕДЛЯЕТ РОСТ PRAME-ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ
ОПУХОЛИ У МЫШЕЙ
Ю.П. Финашутина1, H.A. Лыжко1, H.H. Касаткина1, Л.А. Кесаева1, В.В. Тихонова1, В.А. Мисюрин1, М.А. Барышникова1, A.B. Мисюрин1, 2
1ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское ш., 24; 2ООО «ГеноТехнология»; Россия, 117485 Москва, ул. Профсоюзная, 104
Введение. Белок PRAME, экспрессирующийся во многих опухолях и практически отсутствующий в нормальных тканях, может быть подходящей мишенью для иммунотерапии рака, так как способен вызывать иммунный ответ. Цель исследования — изучение противоопухолевого эффекта профилактической иммунизации рекомбинантным человеческим белком PRAME на иммунокомпетентных мышах.
Материалы и методы. В работе были использованы культура клеток меланомы мыши B16F10, мыши линии С57BL/6, клонирование, трансфекция, полимеразная цепная реакция в реальном времени, анализ вестерн-блот, проточная цитофлуори-метрия и иммуноферментный анализ.
Результаты. Были получены клетки меланомы мыши, трансфицированные плазмидой с вставкой гена PRAME человека и экспрессирующие соответствующий белок на высоком уровне. После нескольких предварительных иммунизаций композицией, содержащей рекомбинантный белок PRAME и адъювант, у мышей значительно замедлялся рост меланомы B16F10, экспрессирующей человеческий антиген PRAME (торможение роста опухоли — 98,41 %), и у животных данной группы детектировался высокий титр (6,14 х 105) специфических антител в сыворотке.
Заключение. Полученные данные позволяют предположить, что рекомбинантный белок PRAME можно рассматривать как перспективный антиген для противоопухолевой иммунотерапии.
Ключевые слова: рекомбинантный антиген, РВЛМЕ, иммунизация, трансфекция, меланома мыши B16F10
RECOMBINANT HUMAN PRAME IMMUNIZATION REDUCES PRAME-EXPRESSING TUMOR GROWTH IN MICE
Yu.P. Finashuüna1, N.A. Lyzhko1, N.N. Kasatkina1, L.A. Kesaeva1, V. V. Tikhonova1, V.A. Misyurin1, M.A. Baryshnikova1, A. V. Misyurin1,2
'N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia;
2GeneTechnology LLC; 104Profsoyuznaya St., Moscow 117485, Russia
Introduction. Human antigen PRAME is preferentially expressed in a number of different tumor types and may be a potent target for anti-tumor immunotherapy.
Purpose. To study anti-tumor action of immunogenic mix recombinant PRAME protein and adjuvant in mice with innate immunity. Materials and methods. C57BL/6 female mice were used for immunization with purified human recombinant protein PRAME. Human PRAME gene coding sequence was cloned in mammalian expressing vector pCEP4 and resulting plasmid was introduced in mouse melanoma B16F10 cells by transfection followed by RQ-PCR, Western blot andflow-cytometry analysis. Then stably PRAME-transfected melanoma cells were injected in mice.
Results. The mouse melanoma B16F10 cells stably expressing human PRAME protein were obtained. We demonstrate the 10-fold decreased tumor volume in mice with melanoma B16F10 expressing human PRAME after preventive immunization series with recombinant PRAME protein. The tumor volume reducing was correlated with high titer (6.14 x 105) of anti-PRAME antibodies in mice sera. Conclusion. These data indicate that recombinant protein PRAME is immunogenic and may be a potent antigen for immunotherapuet-ics studies.
Key words: recombinant antigen, PRAME, immunization, mouse B16F10 melanoma
Контакты: Юлия Павловна Финашутина [email protected]
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-3-36-42
Оригинальные статьи 37
Введение
В настоящее время традиционные методы лечения рака увеличивают выживаемость пациентов, но они часто ассоциированы с побочными эффектами и далеко не всегда позволяют достичь полной ремиссии. Кроме того, часть пациентов с опухолями оказываются резистентными к стандартной противоопухолевой терапии. Проблема ранних рецидивов также остается значимой. Ряд опухолей, такие как меланома и гепатоцеллюлярная карцинома, обладают незначительной чувствительностью к противоопухолевой терапии. Таким образом, существует необходимость в разработке новых методов лечения рака, более специфичных и менее токсичных.
Исследования последних десятилетий в области иммунологии, а также понимание клеточных и молекулярных путей при канцерогенезе привели к разработке различных иммунотерапевтических подходов для лечения опухолей [1].
В связи с открытием различных опухолевых антигенов, способных вызывать специфический иммунный ответ, иммунотерапевтические методы лечения включают также противоопухолевую вакцинацию [2]. Потенциальными преимуществами иммунотерапии являются специфичность против опухолевых клеток, сниженный риск повреждения нормальных тканей и вероятный пролонгированный эффект. Ограничением такого вида терапии может быть слабый иммунный ответ против антигенов опухоли. Соответственно, для усиления противоопухолевого иммунного ответа необходимо применять также иммуностимулирующие вещества и тщательно подойти к выбору мишени для иммунотерапии.
Антиген PRAME может быть перспективной мишенью для иммунотерапии, так как экспрессируется в различных опухолях, например, при меланоме, немелкоклеточном раке легкого и гемобластозах [3, 4] и практически не экспрессируется в нормальных тканях. Белки с такими характеристиками относят к группе раково-тестикулярных антигенов [5]. Ряд исследований подтверждает его иммуногенность и способность индуцировать цитотоксический Т-клеточ-ный иммунный ответ [6—8].
Таким образом, разработка новых подходов для оценки иммунотерапевтического потенциала белка PRAME является перспективной. Исследование противоопухолевых вакцин на животных моделях опухолей, экспрессирующих человеческие опухолевые антигены, часто используется в рамках предварительных доклинических исследований [9, 10]. Кроме того, используются модели опухолей с иммунизацией собственными мышиными опухолевыми антигенами [11].
В данной работе оценивается эффект иммунизации рекомбинантным белком PRAME на модели PRAME-экспрессирующей опухоли у мышей.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и клеточные линии
Использовались штаммы E. coli DH-5a, линия эритромиелоидного лейкоза K562, линия меланомы мыши B16F10.
Получениерекомбинантного белка PRAME
Рекомбинантный человеческий белок PRAME очищали хроматографически из клеток штамма-продуцента E. coli [12] и стерилизовали фильтрацией. Концентрацию белка измеряли методом Брэдфорд. Очищенный белок сорбировали на суспензии гидроокиси алюминия (Brenntag Biosector) в течение 24 ч перед инъекцией.
Получение экспрессионного вектора
Кодирующую последовательность гена PRAME получали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами prmF и prmR (табл. 1) с комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), выделенной из линии клеток К562. ПЦР-фрагмент был клонирован в промежуточную плазмиду pGEM-T Easy, а затем переклонирован в плазмиду pCEP4 (Invitrogen) по сайтам рестрикции NotI. Плазмидную ДНК для последующей трансфек-ции выделяли набором Wizard® MagneSil (Promega).
Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных в данной работе
Название 5'-3'- последовательность
prmF ATGGAACGAAGGCGTTTGTGG
prmR GCACCCAGCTAGTTAGGCATGAAA
mactF (ß-актин) AAGTGTGACGTTGACATCCGTAA
mactR (ß-актин) TGCCTGGGTACATGGTGGTA
prmFb GACTCTTTATTTTTTCCTTAGA
prmRb CGAAAGCCGGCAGTTAGTTATT
Трансфекция клеток меланомы Клетки меланомы мыши B16F10 выращивали в среде RPMI-1640, содержащей 2 мМ глутамина, 10 мМ HEPES, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки при 5 % С02. Трансфекцию проводили с помощью набора TransFast (Promega) по инструкции производителя; для 5 х 104 клеток брали 500 нг очищенной от эндотоксинов плазмидной ДНК pCEP4-PRAME. Методом лимитирующих разведений на селективной среде при концентрации гигромицина 50 мкг/мл отбирались клетки с максимальной и стабильной экспрессией гена PRAME.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени Экспрессию гена PRAME определяли методом ПЦР в реальном времени. Комплементарную ДНК
38 Оригинальные статьи
гена PRAME и референсного гена (бета-актин) ам- ви оценивался методом твердофазного иммунофер-плифицировали при помощи специфических прай- ментного анализа перед введением животным клеток меров prmFb и prmRb (см. табл. 1) в присутствии опухоли, а также на 14-й и 21-й день после транскрасителя SYBR Green. Реакция проводилась на обо- плантации опухолевых клеток. рудовании Roche LightCycler® 96 System. Для оценки уровня экспрессии вычисляли соотношение относи- Измерение опухолей тельных количеств копий комплементарной ДНК Клетки опухоли B16F10-PRAME были подкожно гена и референсного гена, данные значения опреде- трансплантированы в дозе 2 х 105 клеток на мышь ляли при помощи построения стандартных кривых. через 14 дней после последней иммунизации. Разме-Иммуноблоттинг ры опухолей измерялись на 14, 18 и 21-й дни после Экспрессию белка определяли в лизатах клеток введения клеток. Пальпируемые узлы измеряли B16F10, трансфицированных плазмидой с геном PRAME. и рассчитывали объем по формуле V= 0,5 х длина х Лизаты приготовляли при помощи RIPA-буфера ширина2, торможение роста опухоли (ТРО) — по форс ингибиторами протеаз (Thermo Scientific Pierce, США). муле ТРО = (F — F) / V х 100 % [14], где V — средний Электрофорез в 10 % полиакриламидном геле про- объем опухоли у животных контрольной группы, поводили по стандартной методике Laemmli [13], на 1 лучавших инъекции адъюванта; V — средний объем дорожку наносили 50 мкг тотального белка. После опухоли у животных контрольной группы, получав-электрофореза перенос белков из геля на Amersham ших инъекции рекомбинантного белка с адъювантом Hybond-P PVDF мембрану (GE Healthcare, Велико- либо без адъюванта. При статистической обработке британия) осуществляли методом полусухого элек- применяли метод Манна—Уитни. троблоттинга. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к белку PRAME, Иммуноферментный анализ полученные нами ранее [12]; вторичных — антитела В лунку планшета наносили рекомбинантный козы против антител мыши, конъюгированных с пе- белок PRAME в концентрации 2 мкг/мл. Затем после роксидазой хрена (Dako Research, США). Для визу- отмывания вносили образцы сывороток крови мы-ализации белка, связавшегося с антителами, исполь- шей в двукратных разведениях. В качестве вторичных зовали двухкомпонентную систему Clarity Western антител использовали конъюгат антител козы с пе-ECL (Bio-Rad). роксидазой хрена против IgG мыши (Dako Research, США). Проявляли реакцию раствором тетраметил-Проточная цитометрия бензидина и после остановки реакции измеряли Эффективность трансфекции клеток B16F10 оптическую плотность (ОП) при 450 нм. Титром оценивали на проточном цитометре ACEA NovoCyte сыворотки считали ее разведение, при котором зна-(ACEA Biosciences, США). Перед окрашиванием чения ОП вдвое превышали контрольные значения. белка PRAME проводилась пермеабилизация клеток реактивами Fixation Buffer и Intracellular Staining Результаты и обсуждение Permeabilization Wash Buffer (SONY biotechnology, Получение клеток мышиной меланомы, Япония) согласно протоколу, предложенному произ- экспрессирующих белок PRAME человека водителем. Для окрашивания клеток использовались Полноразмерный ген PRAME (NM_006115.4) был моноклональные антитела к белку PRAME [12] заклонирован в вектор pCEP4 для экспрессии в эука-и вторичные FITC-меченные антимышиные антите- риотических клетках под контролем CMV-промотора. ла (Becton Dickinson, США). В качестве контроля Методом прямого секвенирования подтверждено, использовались B16F10, трансфицированные пустым что все составные части плазмиды и последователь-вектором. ность, кодирующая белок PRAME, полностью соответствуют оригинальной схеме конструирования. Иммунизация животных После трансфекции плазмидой pCEP4-PRAME линии рекомбинантным белком мышиной меланомы B16F10 были получены клетки, Для трансплантации опухолевых клеток исполь- стабильно экспрессирующие человеческий белок зовали иммунокомпетентных мышей-самок линии PRAME, и определена прививочная доза 2 х 105 кле-C57BL/6J массой тела не менее 18 г из питомника ток на мышь, обеспечивающая 100 % прививаемость ООО «Столбовая, питомник лабораторных живот- для этих клеток. В полученной трансфицированной ных». Группы по 5 мышей были четырежды иммуни- линии клеток мышиной меланомы B16F10 по дан-зированы внутрибрюшинно с двухнедельными ин- ным ПЦР в реальном времени уровень экспрессии тервалами рекомбинантным белком PRAME в дозе человеческого гена PRAME составлял 27,4 ± 1,6 % 50 мкг на мышь с 300 мкг гидроксида алюминия относительно референс-гена (ß-актин) по результа-в качестве адъюванта. Титр антител в сыворотке кро- там 3 измерений в течение 1 мес культивирования.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 3'2018 том 17 | vol. 17
1 2 3 4
Рис. 1. Анализ экспрессии белка PRAME в культуре клеток методом иммуноблоттинга: 1 — К562клетки хронического миелолейкоза (человек); 2 — меланома мыши B16F10; 3 — клетки B16F10, трансфи-цированные контрольной плазмидой; 4 — клетки B16F10, трансфи-цированные плазмидой с геном PRAME
Экспрессия человеческого белка PRAME в данной трансфицированной линии подтверждена методом иммуноблоттинга (рис. 1) и методом проточной цитометрии (рис. 2).
Развитие гуморального ответа
На момент трансплантации клеток опухоли, экс-прессирующих белок PRAME, мыши были проим-мунизированы 4 раза с двухнедельными интервалами рекомбинантным человеческим белком PRAME в растворе 0,9 % NaCl либо тем же белком в смеси с адъювантом. Схема эксперимента представлена на рис. 3. Мыши контрольной группы получали в том же режиме инъекции адъюванта или раствора 0,9 % NaCl. Таким образом, через 42 дня после первой иммунизации и перед прививанием опухоли в сыворотке мышей обнаруживался высокий титр специфических антител: 1,76 х 105 у мышей, иммунизированных белком, и 2,89 х 105 у мышей, иммунизированных смесью белка с адъювантом (рис. 4). У животных контрольных групп детектировался очень низкий уровень антител, сравнимый с фоновым сигналом, так как
они не получили инъекций антигена. По мере роста опухоли титр антител повысился до 6,14 х 105 у животных, иммунизированных рекомбинантным белком с адъювантом, и 3,07 х 105 у животных, иммунизированных только рекомбинантным белком; разница между этими величинами была статистически незначимой (р = 0,108). При этом у неиммунизированных животных контрольных групп детектировалось лишь небольшое увеличение титра антител, до 840, что значительно ниже, чем в опытных группах (р = 0,025). Появление антител к белку в сыворотке неиммуни-зированных животных на момент завершения эксперимента объясняется слабым эффектом иммунизации белком, присутствующим в привитой опухоли.
Рост PRAME-экспрессирующей меланомы
B16F10 после профилактической иммунизации
рекомбинантным белком PRAME
Мышам, иммунизированным антигеном PRAME с адъювантом или изотоническим раствором NaCl, подкожно были трансплантированы клетки PRAME-экспрессирующей меланомы B16F10. На рис. 5 и табл. 2 показано, что опухоль растет быстрее у животных контрольных групп, иммунизированных адъювантом или раствором 0,9 % NaCl.
По окончании эксперимента (на 21-й день) в контрольных группах средний размер опухоли достигал 700 мм3. Как следует из данных, представленных на рис. 6, на 21-й день размеры опухолей были значительно меньше у мышей, иммунизированных рекомбинантным белком PRAME (p = 0,1113) или рекомбинантным белком PRAME с адъювантом (p = 0,0864) по сравнению с группой, получившей только адъювант. При этом присутствие адъюванта при иммунизации
1,5
1
0,5 -
1,9
103 105 107 PRAME FITC-H
1,2
0,6
PRAME-6,89 %
. . . Г . .
101
PRAME+ 93,1 %
103 105 107 PRAME FITC-H
1089
Рис. 2. Определение уровня экспрессии белка PRAME методом проточной цитометрии: а — клетки B16F10, трансфицированные контрольной плазмидой, б — клетки B16F10, трансфицированные плазмидой с геном PRAME
б
а
0
0
м
0
14
18 21
Время, нед
рис. 3. Схема профилактической иммунизации рекомбинантным белком PRAME. Р — иммунизация антигеном либо контрольным раствором; М — введение PRAME-экспрессирующей меланомы B16F10. Треугольники обозначают временные точки получения результатов измерений
0
х
Адъювант ♦ Физиологический раствор
• рекРВАМБ ▲ рекРВАМБ + адъювант
4 9 14 19
Дни после трансплантации опухоли
24
800 700 600 500
3
м
и, 400 л о х
^ 300 о м
2 200
100
▲ Адъювант Физиологический раствор
+ рекРВАМБ ■ рекРВАМБ + адъювант
1
I
Л
-¿Л .
рис. 4. Титр специфических антител к рекомбинантному белку PRAME в сыворотке мышей с меланомой B16F10-PRAME
рекомбинантным белком PRAME не влияло на размер опухолей в опытных группах (р = 1). Также заметно не различались контрольные группы, получившие адъювант и раствор 0,9 % №С1 (р = 0,8852). Торможение роста опухоли рассчитывалось на момент окончания эксперимента относительно контрольной группы, получавшей только адъювант, и состав-
0 5 10 15 20 25
Дни после трансплантации клеток меланомы
рис. 5. Влияние профилактической иммунизации рекомбинантным белком PRAME на рост PRAME-экспрессирующей меланомы B16F10
ляло 98,41 и 98,64 % для групп, иммунизированных белком с адъювантом и чистым белком соответственно.
Таким образом, предварительная иммунизация мышей рекомбинантным человеческим белком PRAME значительно замедляет развитие меланомы B16F10, экспрессирующей человеческий антиген PRAME.
Поскольку уровень антител у предварительно иммунизированных белком мышей относительно значимо повысился за 21 день роста PRAME-экспрессирующей опухоли (р = 0,745), вероятно, контакт иммунной системы с опухолью, несущей антиген, усиливает специфический гуморальный ответ. Известно, что клетки мышиной меланомы В16 способны вызывать преимущественно гуморальный и антителозависи-мый клеточный иммунный ответ [15], так как на их поверхности снижена экспрессия молекул главного комплекса гистосовместимости [16]. Гуморальный ответ на антиген PRAME является важным показателем, отражающим общую активацию иммунной системы, притом что в данном исследовании наибольшие титры антител наблюдались в группе животных с самой низкой скоростью развития опухоли, несущей специфический антиген. Определяет ли такой
таблица 2. Размеры меланомы B16FW-PRAME в контрольных и опытных группах мышей
Р
Р
Р
Р
0
2
4
6
8
0
7
6
5
4
3
2
0
0
иммуноген Срок измерения, сут. день
14 18 21 18-й 21-й
объем опухоли, мм3 тро, %
Адъювант+рекPRAME 0 0,02 ± 0,003 11,2 ± 2,5 99,97 98,41
рекPRAME 0 1,0 ± 0,4 9,6 ± 2,1 98,74 98,64
Адъювант 0 79,5 ± 20,5 703,9 ± 123,8 - -
0,9 % №01 19,25 ± 7,3 199,7 ± 31,2 547,1 ± 110,2 - -
1200
1000
800
о
X
600
400
200
0 2 3 4
Группа
Рис. 6. Размеры меланомы B16F10-PRAME у мышей на 21-й день: 1 — peKPRAME + адъювант; 2 — рекPRAME; 3 — адъювант; 4 — физиологический раствор
иммунный ответ противоопухолевый эффект, можно будет узнать, проведя дополнительные эксперименты in vitro по изучению механизма действия специфических антител в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих антиген PRAME.
Похожие данные были получены на модели клеток карциномы кишечника CT26, стабильно транс-
фицированной PRAME-экспрессирующей плазмидой [17], где также использовалась схема четырехразовой иммунизации животных рекомбинантным белком РКАМЕ внутримышечно перед введением опухолевых клеток. При этом был достигнут значительный противоопухолевый эффект иммунизации при тех же порядках титров антител в сыворотке животных, что и в представленной работе. В другом исследовании [9] подобные результаты, но в отношении раково-тестикулярного антигена NY-ESO-1, были достигнуты и при двукратной подкожной иммунизации животных. Очевидно, схему иммунизации, дозу антигена и способ введения требуется подбирать экспериментально для каждого белка.
Раково-тестикулярный человеческий антиген PRAME интенсивно исследуется в качестве компонента противоопухолевых вакцин как в виде реком-бинантного белка [18, 19], где у пациентов после иммунизации был получен стойкий специфический гуморальный ответ, так и в виде синтетических пептидов, распознаваемых иммунной системой человека [20].
Заключение
Представленные результаты свидетельствуют о возможном противоопухолевом потенциале полученного рекомбинантного белка РКАМЕ как антигена для иммунизации. В дальнейшем предстоит продолжить детальное изучение иммунного ответа, в том числе Т-клеточного, на рекомбинантный белок РКАМЕ на различных моделях опухолей.
0
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Барышников А.Ю., Демидов Л. В., Кадагвдзе З.Г. и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей. Вестник Московского онкологического общества 2008;1:6-10. [Baryshnikov A.Yu., Demidov L.V., Kadagidze Z.G. et al. Current problems of anti-cancer biotherapy. Vestnik Moskovskogo onkologicheskogo obschestva = Bulletin of the Moscow Cancer Society 2008;1:6-10 (In Russ.)].
2. Cheever M.A., Allison J.P., Ferris A.S. et al. The prioritization of cancer antigens: a national cancer institute pilot project for the acceleration
of translational research. Clin Cancer Res 2009;15(17):5323-37. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-09-0737. PMID: 19723653.
3. Ikeda H., Lethé B., Lehmann F. et al. Characterization of an antigen that
is recognized on a melanoma showing partial HLA loss by CTL expressing an NK inhibitory receptor. Immunity 1997;6:199-208. DOI: 10.1016/S1074-7613(00)80426-4. PMID: 9047241
4. Абраменко И.В., Белоус Н.И., Крячок И.А. и др. Экспрессия гена PRAME при множественной миело-ме. Терапевтический архив 2004;74(7):77-81. [Abramenko I.V., Belous N.I., Kryachok I.A. et al. Expression of PRAME gene in multiple myeloma. Terapevticheskii arkhiv = Therapeutic Archive 2004;74(7):77-81 (In Russ.)].
5. Мисюрин В.А., Мисюрин А.В., Лукина А.Е. и др. Профили экспрессии раково-тестикулярных генов в клеточных линиях меланомы. Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии
2014;31(2):104—109. DOI: 10.7868/S0233475514020054. [Misyurin V.A., Misyurin A.V., Lukina A.E. et al. Cancer-testis Gene Expression Profile in Human Melanoma Cell Lines. Biologicheskie membrany = Biological membranes 2014;31(2):104-9 (In Russ.)].
6. Quintarelli C., Dotti G., Hasan S.T. et al. High-avidity cytotoxic T lymphocytes specific for a new PRAME-derived peptide can target leukemic and leukemic-precursor cells.
Blood 2011;117:3353-62.
DOI: 10.1182/blood-2010-08-300376.
PMID: 21278353.
7. Rezvani K., Yong A.S., Tawab A. et al. Ex vivo characterization of polyclonal memory CD8+ T-cell responses
to PRAME-specific peptides in patients with acute lymphoblastic leukemia and
acute and chronic myeloid leukemia. Blood 2009;113:2245-55. DOI: 10.1182/blood-2008-03-144071. PMID: 18988867.
8. Luetkens T., Schafhausen P., Uhlich F. et al. Expression, epigenetic regulation, and humoral immunogenicity of cancer-testis antigens in chronic myeloid leukemia. Leuk Res 2010;34(12):1647-55. DOI: 10.1016/j.leukres.2010.03.039. PMID: 20409582.
9. Maraskovsky E., Sjolander S., Drane D. et al. NY-ESO-1 protein formulated
in ISCOMATRIX adjuvant is a potent anticancer vaccine inducing both humoral and CD8+ t-cell-mediated immunity and protection against NY-ESO-1+ tumors. Clin Cancer Res 2004;10(8):2879-90. DOI: 10.1158/ 1078-0432.CCR-03-0245. PMID: 15102697.
10. Hance K., Zeytin H., Greiner J. Mouse models expressing human carcinoembryonic antigen (CEA)
as a transgene: evaluation of CEA-based cancer vaccines. Mutat Res 2005; 576(1-2):132-54.
DOI: 10.1016/j.mrfmmm.2004.10.014. PMID: 15888344.
11. Chiriva-Internati M., Yu Y., Mirandola L. et al. Cancer testis antigen vaccination affords long-term protection in a murine model of ovarian cancer.
PLoS One 2010;5(5):e10471. DOI: 10.1371/journal.pone. 0010471. PMID: 20485677.
12. Финашутина Ю.П., Мисюрин А. В., Ахлынина Т.В. и др. Получение ре-комбинантного раково-тестикуляр-ного белка PRAME и моноклональ-
ных антител к нему. Российский биотерапевтический журнал 2015;14(3):29-36. [Finashutina Yu.P., Misyurin A.V., Akhlynina T.V. et al. Production of recombinant PRAME cancer testis antigen and its specifi c monoclonal antibodies. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2015;14(3):29-36. (In Russ)].
13. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;224: 680-5. DOI: 10.1038/227680a0. PMID: 5432063.
14. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. Под ред. А.Н. Миронова, Н.Д. Бунятян и др. М.: Гриф и К, 2012:642-57. [Treshchalina E.M., Zhukova O.S., Gerasimova G.K. et al. Guidance on pre-clinical study of antitumor activity of drugs. In: Guide to conduct preclinical studies of drugs. Part 1. Eds. A.N. Mironov, N.D. Bunyatyan et al. Мoscow: Grif i K, 2012:642-57 (In Russ.)].
15. Eisenthal A., Lafreniere R., Letor A. et al. Effect of anti-B,16 melanoma monoclonal antibody on established murine B16 melanoma liver metastases. Cancer Res 1987;47:7140-5. PMID: 3494504.
16. Seliger B., Wollscheid U., Momburg F. et al. Characterization of the major
histocompatibility complex class I deficiencies in B16 melanoma cells. Cancer Res 2001;61(3):1095-9. PMID: 11221838.
17. Gérard C., Baudson N., Ory T. et al. A comprehensive preclinical model evaluating the recombinant PRAME antigen combined with the AS15 immunostimulant to fight against PRAME-expressing tumors.
J Immunother 2015;38(8):311-20. DOI: 10.1097/CJI.0000000000000095. PMID: 26325375.
18. Pujol J., De Pas T., Rittmeyer A. et al. Safety and Immunogenicity
of the PRAME Cancer Immuno-therapeutic in Patients with Resected Non-Small Cell Lung Cancer: A Phase I Dose Escalation Study. J Thorac Oncol 2016;11(12):2208-17. DOI: 10.1016/j.jtho.2016.08.120. PMID: 27544054.
19. Gutzmer R., Rivoltini L., Levchenko E. et al. Safety and immunogenicity
of the PRAME cancer immunothe-rapeutic in metastatic melanoma: results of a phase I dose escalation study. ESMO Open 2016;1(4):e000068. DOI:10.1136/esmoopen-2016-000068. PMID: 27843625.
20. Weber J.S., Vogelzang N.J., Ernstoff M.S. et al. A phase
1 study of a vaccine targeting preferentially expressed antigen in melanoma and prostate-specific membrane antigen in patients with advanced solid tumors. J Immunother 2011;34(7):556-67. DOI: 10.1097/CJI.0b013e3182280db1. PMID: 21760528.
конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
