CC BY
13
© Коллектив авторов, 2022
Ушакова Е.И., Пичугин А.В., Федорова А.А., Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И.
Интенсивность противоопухолевых иммунных реакций на иммунизацию вакцинами Multivac против карциномы 4T1 у мышей BALB/c и меланомы B16 у мышей C57BL/6J не зависит от генотипа «хозяина» и тканевой природы опухоли
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Ранее мы сообщали о новой методической платформе Multivac для создания персонализированных противоопухолевых вакцин. Сила иммунного ответа зависит от генов главного комплекса гистосовместимости и их продуктов, представленных на поверхности антиген-презентирующих клеток. Природа антигенов и их разнообразие в составе вакцины тоже могут сильно влиять на интенсивность иммунного ответа при вакцинации. Противоопухолевые вакцины серии Multivac, полученные из ткани опухоли или из злокачественных клеток опухоли, содержат большую коллекцию опухолевых антигенов. Это позволяет предположить, что такие вакцины будут вызывать интенсивные иммунные реакции и формировать иммунную память, независимо от генотипа индивидуума и тканевой природы опухоли.
Цель. В данной работе мы сравнивали иммуногенность вакцин серии Multivac против двух значительно различающихся опухолей (карцинома молочной железы и мела-нома) у двух инбредных линий мышей, существенно различающихся генетической основой и генами главного комплекса гистосовместимости, от которых критически зависит интенсивность адаптивных иммунных реакций.
Материал и методы. Мультиантигенные вакцины Multivac-1 были получены из ткани солидной карциномы 4Т1 молочной железы мышей BALB/c (генотип H-2d) или ткани меланомы B16F10 мышей C57BL/6J (генотип H-2b). Вакцины Multivac-4 создавали на основе лизатов злокачественных клеток 4Т1-карциномы или меланомы B16F10, выращенных в условиях культуры клеток in vitro. Мультиантигенные лизаты ткани опухоли или злокачественных клеток дополняли молекулярными иммуноадъювантами из класса PRR-агонистов. Системные иммунные реакции против антигенов карциномы 4Т1 и меланомы B16F10 определяли по содержанию противоопухолевых Т-клеток в селезенке и антител в сыворотке крови мышей. Антиген-реактивные CD4+- и СБ8+-Т-клетки памяти и Т-клетки-эффекторы, секретирующие ИФН-у, анализировали методом ELISpot. Антитела к внутриклеточным антигенам карциномы 4Т1 и меланомы B16F10 исследовали методом иммуноферментного анализа.
Результаты. Обе линии мышей, BALB/c и C57BL/6J, эффективно отвечали на иммунизацию вакциной Multivac-1, полученной, соответственно, из тканей опухолей 4Т1 и B16F10. В селезенках мышей накапливалось > 1000 CD4+-Т-клеток-эффекторов, CD4+-и CD8+-Т-клеток памяти (в расчете на 1 млн соответствующих Т-клеток). Еще более интенсивные иммунные реакции развивались в селезенках мышей BALB/c и C57BL/6J, иммунизированных вакциной Multivac-4. У мышей обеих линий вакцинация Multivac-4 вызывала интенсивное накопление антиген-реактивных Т-клеток памяти. Иммунизация мышей BALB/c и C57BL/6J вакцинами серии Multivac, соответственно, против карциномы 4Т1 и меланомы B16F10, индуцировала накопление в сыворотке крови животных большого количества противоопухолевых антител, связывающихся с антигенами клеток карциномы 4Т1 и меланомы B16F10.
Заключение. Вакцины Multivac, созданные на основе мультиантигенных лизатов опухолевой ткани или злокачественных клеток карциномы 4Т1 или меланомы B16F10,
Для корреспонденции
Атауллаханов Равшан Иноятович -доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии, заведующий лабораторией активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
/qi
продемонстрировали одинаково высокую иммуногенность. Интенсивность иммунных реакций в ответ на иммунизацию вакцинами серии МиШуас не зависела от генотипа реципиентов вакцины. У мышей БЛЬБ/с и С57БЬ/61 наблюдались одинаково высокие уровни Т-клеточной и антительной реакций на опухолевые антигены, использованные в соответствующих вакцинах.
Ключевые слова: противоопухолевая терапевтическая вакцина; Т-клеточные реакции; антитела к антигенам опухоли; генотип вакцинируемого; тканевая природа опухоли
Статья получена 13.09.2022. Принята в печать 21.10.2022.
Для цитирования: Ушакова Е.И., Пичугин А.В., Федорова А.А., Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И. Интенсивность противоопухолевых иммунных реакций на иммунизацию вакцинами МиШуас против карциномы 4Т1 у мышей БЛЬБ/с и меланомы Б16 у мышей С57БЬ^ не зависит от генотипа «хозяина» и тканевой природы опухоли. Иммунология. 2022; 43 (6): 691-701. Б01: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-691-701
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 20-15-00391.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Постановка экспериментов, статистическая обработка, редактирование статьи - Ушакова Е.И.; планирование и постановка экспериментов, анализ данных - Пичугин А.В.; постановка экспериментов - Федорова А. А.; дизайн вакцины, анализ данных - Лебедева Е.С.; концепция, дизайн экспериментов, анализ данных, написание статьи - Атауллаханов Р. И.
Ushakova E.I., Pichugin A.V., Fedorova A.A., Lebedeva E.S., Ataullakhanov R.I.
The intensity of antitumor immune responses to immunization with Multivac vaccines against 4T1 carcinoma in BALB/c mice and B16 melanoma in C57BL/6J mice does not depend on the host genotype and the tissue origin of the tumor
National Research Center - Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Previously, we reported on the new Multivac methodological platform for the development of personalized antitumor vaccines. The strength of immune response depends on the major histocompatibility complex genes and their products presented on the surface of antigen-presenting cells. The nature of antigens and their diversity in the vaccine composition can also strongly influence the intensity of the immune response during vaccination. Antitumor vaccines of the Multivac series, prepared from tumor tissue or malignant tumor cells, contain a large collection of tumor antigens. This suggests that such vaccines will induce intense immune responses and immune memory, regardless of the genotype of the individual and the tissue nature of the tumor.
Aim. In this work we compared the immunogenicity of the Multivac vaccines against two significantly different tumors (mammary gland carcinoma and melanoma) in two inbred mouse strains that differ significantly in their genetic basis and the genes of the major histocompatibility complex, on which the intensity of adaptive immune responses critically depends.
Material and methods. The multi-antigenic vaccines Multivac-1 were prepared from solid 4T1 mammary carcinoma tissue of BALB/c mice (H-2d genotype) or B16F10 melanoma tissue of C57BL/6J mice (H-2b genotype). Multivac-4 vaccines were based on lysates of malignant cells of 4T1-carcinoma or melanoma B16F10 grown under in vitro cell culture conditions. Multi-antigenic lysates of tumor tissue or malignant cells were supplemented with molecular immunoadjuvants from the class of PRR agonists. Systemic immune responses against 4T1 carcinoma and B16F10 melanoma antigens were determined according to the numbers of antitumor T cells in the spleen and the levels of tumor-specific antibodies in the blood serum of mice. Antigen-reactive CD4 and CD8 T memory cells, and T effector cells secreting interferon-y were analyzed by ELISpot. Antibodies to intracellular antigens of 4T1-carcinoma and B16F10-melanoma were studied by ELISA.
For correspondence
Ravshan I. Ataullakhanov -MD, PhD, Professor, Head of the Immune Biotechnology Dept., Head of the Immunity Activation Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
Results. Both BALB/c and C57BL/6J mouse strains responded effectively to immunization with the Multivac-1 vaccine prepared from 4T1 and B16F10 tumor tissues respectively. More than 1000 CD4+ T effector cells, CD4+ T memory cells, CD8+ T memory cells (per 1 million corresponding T cells) were recorded in the spleens of immunized mice. Even more intense immune responses developed in the spleens of BALB/c and C57BL/6J mice immunized with the Multivac-4 vaccine. Vaccination with Multivac-4 caused an intense accumulation of antigen-reactive T cells memory in mice of both genotypes. Immunization of BALB/c against 4T1-carcinoma and C57BL/6J mice against B16F10-melanoma with vaccines of the Multivac series induced the accumulation in blood serum of a large amounts of antitumor antibodies binding antigens of 4T1 carcinoma and B16F10 melanoma cells.
Conclusion. Multivac vaccines based on multi-antigen lysates of tumor tissue or malignant cells of 4T1 carcinoma or B16F10 melanoma demonstrated equally high immunogenicity. The intensity of immune reactions in response to immunization with the Multivac vaccines did not depend on the genotype of the vaccine recipients. BALB/c and C57BL/6J mice exhibited equally high levels of T-cell and antibody responses to the tumor antigens used in the respective vaccines.
Keywords: antitumor therapeutic vaccine; T-cell reactions; antibodies to tumor antigens; the genotype of the vaccine recipient; tissue nature of the tumor
Статья получена 13.09.2022. Принята в печать 21.10.2022.
For citation: Ushakova E.I., Pichugin A.V., Fedorova A.A., Lebedeva E.S., Ataullakhanov R.I. The intensity of antitumor immune responses to immunization with Multivac vaccines against 4T1 carcinoma in BALB/c mice and B16 melanoma in C57BL/6J mice does not depend on the host genotype and the tissue nature of the tumor. Immunologiya. 2022; 43 (6): 691-701. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-691-701 (in Russian).
Funding. This study was supported by a grant from the Russian Science Foundation (project No. 20-15-00391).
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Conducting experiments, statistical processing, editing the article - Ushakova E.I.; planning and conductiong experiments, data analysis - Pichugin A.V.; conducting experiments - Fedorova A.A.; vaccine design, data analysis, article editing - Lebedeva E.S.; concept, design of experiments, data analysis, article writing - Ataul-lakhanov R.I.
Введение
Ранее мы сообщали [1] об успешной индукции Т-клеточных и антительных реакций против опухолевых антигенов с помощью мультиантигенной вакцины, созданной из лизата ткани опухоли (МиШуас-1) или злокачественных клеток опухоли (МиШуас-4). Для успешного применения любой вакцины, в том числе противоопухолевой вакцины серии МиШуас, необходимо обеспечить ее эффективность у максимально широкой популяции людей, что является нетривиальной задачей в силу значительных индивидуальных различий по способности к развитию иммунных реакций. Иммунизация большой популяции одним и тем же антигеном, в том числе вакциной, демонстрирует порядковые различия в способности индивидуумов к иммунному ответу на иммунизацию. В ответ на иммунизацию одним и тем же антигеном одни люди реагируют выработкой сильных иммунных реакций, другие отвечают значительно более слабыми реакциями, а третьи вообще не реагируют. И такие различия не связаны с принципиальной неспособностью иммунной системы к адекватным ответам на иммунизацию. Индивидуумы, не реагирующие или слабо реагирующие на один антиген, вполне эффективно реагируют на сотни других антигенов, т. е. их иммунная система вполне здорова и функциональна, но на какие-то конкретные антигены реагировать не может.
Молекулярные и клеточные механизмы, определяющие уровни иммунного ответа на антигены, хорошо изучены. Они ассоциированы с генами главного комплекса гистосовместимости (МНС) и их продуктами, представленными на поверхности антиген-презентиру-ющих клеток [2, 3]. Если небольшие фрагменты антигена в виде пептидов размером 8-10 аминокислотных остатков прочно удерживаются в белках МНС класса I, то такой комплекс МНС с антигенным пептидом распознается СБ8+-Т-клетками [4]. Аналогично небольшие фрагменты антигена в виде пептидов размером от 13 до 25 аминокислотных остатков могут прочно удерживаться в комплексе с МНС класса II, и такие комплексы распознаются СБ4+-Т-клетками [5, 6].
Индивидуумы различаются аллельными вариантами МНС, и далеко не все аллельные варианты МНС способны прочно удерживать любой антигенный пептид. При процессинге конкретного антигена в антиген-пре-зентирующих клетках образуется набор антигенных пептидов. Если ни один из этих пептидов не может прочно удерживаться в аллельных вариантах МНС данного человека, то Т-клетки данного индивидуума не смогут развить иммунные реакции на этот конкретный антиген. Это и приведет к слабым иммунным реакциям или к полному отсутствию иммунных реакций на данный антиген. Тот же индивид может отлично реагиро-
вать на сотни других антигенов, поскольку пептидные фрагменты этих антигенов прочно ассоциируются с аллельными вариантами MHC на его антиген-презен-тирующих клетках. Иными словами, интенсивность иммунных реакций на антигены и вакцины может сильно различаться в зависимости от генотипа иммунизируемого человека [7-9].
Вероятность интенсивных иммунных реакций зависит не только от генома иммунизируемого человека. Природа антигенов и их разнообразие в составе вакцины тоже могут сильно влиять на интенсивность иммунного ответа при вакцинации. Чем крупнее белковые антигены, тем разнообразнее и многочисленнее набор антигенных пептидов, получающихся при их протеоли-тическом расщеплении. Чем больше разнообразие антигенных пептидов, являющихся фрагментами конкретного антигена, тем выше вероятность высокоаффинного взаимодействия хотя бы некоторых антигенных пептидов с конкретными аллельными вариантами MHC данного индивида и, как следствие, выше вероятность интенсивных иммунных реакций на эпитопы данного антигена. Аналогично с увеличением разнообразия белковых антигенов в составе вакцины увеличивается разнообразие антигенных пептидов и, следовательно, возрастает вероятность интенсивных иммунных реакций в ответ на вакцину [8, 10, 11].
Противоопухолевые вакцины из серии Multivac содержат большой набор антигенов, экспрессированных в злокачественных клетках опухоли - неоантигены, являющиеся продуктами соматических мутаций в злокачественных клетках опухоли, онкоэмбриональные, раковотестикулярные, а также антигены с повышенным уровнем экспрессии [12]. Большое разнообразие антигенов в составе вакцин серии Multivac позволяет предположить, что такие вакцины будут вызывать интенсивные иммунные реакции независимо от генотипа вакцинируемого [13-17].
Это предположение мы проверили в экспериментальных моделях. Результаты представлены в данном сообщении. Кроме того, мы проанализировали, зависит ли интенсивность иммунных реакций на вакцинацию Multivac от тканевой природы опухоли, из которой создается такая мультиантигенная вакцина.
Материал и методы
Экспериментальные животные. Мыши линий BALB/c и C57BL/6J 8-10-недельного возраста были получены из питомника «Столбовая», содержались на стандартной диете в стандартных условиях вивария ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными локальным комитетом по этике (Резолюция 4/17 от 13.07.2017).
Культуры клеток in vitro. Линия клеток 4T1 карциномы молочной железы (ATCC, США, Cat.
No. CRL-2539) была получена от профессора М.Г. Агад-жаняна (Institute for Molecular Medicine, Huntington Beach, CA). Линия клеток меланомы B16F10 была получена от профессора Д.М. Чудакова (ФГБУН Институт биоорганической химии РАН, Москва). Суспензии клеток селезенки и костного мозга мыши получали в асептических условиях стандартными методами, описанными ниже. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM (Thermo Fisher Scientific, США) с 25 мМ HEPES, дополненной смесью заменимых аминокислот, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Cytiva, GE Healthcare Life Sciences HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ ß-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы «ПанЭко», Россия), при 37 оС, в увлажненной атмосфере с содержанием 5 % СО2.
Мышей выводили из эксперимента дислокацией шейных позвонков. В асептических условиях выделяли селезенку. Клеточную суспензию готовили в фосфатном буфере с 0,5 % бычьего альбумина (ФБ-БСА). Фракцию мононуклеарных клеток получали методом центрифугирования в градиенте фиколла («ПанЭко», Россия). Клетки отмывали ФБ-БСА. Для сортировки CD4+-и CD8+-Т-клеток суспензию окрашивали антителами CD4-PE и CD8-APC. Лейкоциты подсчитывали с окрашиванием CD45-BV510. Жизнеспособность суспензий определяли при окрашивании DAPI. Сортировку клеток проводили с помощью проточного цитометра-сортировщика BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США). Чистота полученных популяций CD4+- и CD8+-Т-клеток составляла 98 %.
Получение антиген-презентирующих дендритных клеток in vitro. Дифференцировку дендритных клеток и макрофагов костного мозга мышей осуществляли in vitro в присутствии гранулоцитарно-макрофа-гального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) (Sigma, США). В асептических условиях выделяли бедренные и большие берцовые кости мышей. Костный мозг вымывали шприцом (игла 25G) в чашку Петри с раствором ФБ-БСА и тщательно суспендировали. Клетки отмывали ФБ-БСА. Эритроциты удаляли осмотическим лизисом. Ядросодержащие клетки культивировали в ПС с добавлением 10 нг/мл ГМ-КСФ и 50 мкМ ß-меркаптоэтанола при 37 оС и 5 % CO2. Через 3-4 дня в культуры вносили равный объем ПС с теми же добавками. На 7-й день дендритные клетки активировали ЛПС из E. coli в конечной концентрации 0,1 мкг/мл и нагружали антигеном. В качестве антигена использовали лизат опухолевых клеток 4T1 или B16F10 в конечной концентрации 10 мкг/мл (по белку). Концентрацию белка в лизате определяли методом Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, США). Для презентации антигенов в комплексе с MHC-II активированные дендритные клетки нагружали лизатом опухолевых клеток 4T1 или B16F10. Для презентации антигенов в комплексе с MHC-I активированные дендритные клетки культивировали совместно с клетками карциномы 4T1 или B16F10.
Иммунизация мультиантигенными вакцинами против карциномы 4T1 или меланомы B16F10. Вакцинные антигены получали из ткани опухоли 4T1 или B16F10, а также из злокачественных клеток линии 4T1 или B16F10, выращенных в культуре in vitro. Для создания солидной опухоли мышам BALB/c подкожно вводили клетки карциномы 4T1 в количестве 15 тыс. клеток на мышь, а мышам C57BL/6J - клетки меланомы B16F10 в количестве 200 тыс. клеток на мышь. При достижении размеров опухолей 5-10 мм мышей выводили из эксперимента дислокацией шейных позвонков. Ткань опухоли получали в асептических условиях, измельчали и лизировали с помощью замораживания-оттаивания. Лизат замораживали до использования. Линии клеток 4T1 карциномы и B16F10 меланомы поддерживали регулярными пересевами в ПС. Клетки карциномы 4T1 и меланомы B16F10 получали из культуры in vitro, ли-зировали с помощью замораживания-оттаивания. Лизат замораживали до использования. В лизат гомогената опухолевой ткани или лизат клеток 4T1 (или B16F10) добавляли молекулярные адъюванты, агонисты PRR, действие которых детально исследовано и описано нами ранее [18-24]. Одна доза вакцины Multivac для иммунизации мышей массой 20-25 г содержала лизат из 50 мг ткани опухоли 4T1 (или B16F10) или лизат из 5 млн клеток 4T1 (или B16F10), дополненные 10 мкг кислого пептидогликана из растений (агонист TLR4), 4 мкг сополимера полиинозиновой и полицитидиловой кислот (агонист TLR3) и 1,6 мкг неметилированного CpG-олигонуклеотида (агонист TLR9).
Вакцина Multivac-1 была приготовлена на основе лизата ткани опухоли 4T1 (или опухоли B16F10), а вакцина Multivac-4 - на основе лизата клеток 4T1 (или B16F10). Иммунизацию мышей вакцинами серии Mul-tivac проводили внутрибрюшинно, 4-кратно, с интервалом 2 нед между иммунизациями. Через 2 нед после последней иммунизации у мышей брали кровь для анализа антител и выводили из эксперимента дислокацией шейных позвонков, выделяли селезенки, в которых методом ELISpot исследовали количество CD4+- и CD8+-T-клеток, секретирующих интерферон (ИФН)-у.
Анализ Т-клеточных реакций, специфичных к антигенам карциномы 4T1 или меланомы B16F10. Антиген-специфический ответ Т-клеток оценивали по секреции ИФН-у. Специфический Т-клеточный ответ индуцировали в совместной культуре Т-клеток с анти-ген-презентирующими дендритными клетками, предварительно нагруженными лизатом клеток 4Т1 (или B16F10), как описано выше, или совместно с клетками карциномы 4T1 (или B16F10). В лунки планшета для ELISpot (BD TM ELISPOT Mouse IFN-y, кат. 551083, BD Biosciences, США) помещали 30 тыс. CD4+- или CD8+-Т-клеток, очищенных с помощью проточного сортировщика FACS Aria II, культивировали совместно с 50 тыс. дендритных клеток. Для активации ОЭ8+-Т-клеток в совместную культуру Т-клеток и дендритных клеток вносили 10 тыс. клеток карциномы 4Т1 или ме-ланомы B16F10. Совместные культуры инкубировали
в течение 36 ч при 37 °C и 5 % CO2, после чего выявляли клетки, секретирующие ИФН-у, в соответствии с инструкцией производителя. Фотографии каждой лунки делали с помощью микроскопа Levenhuk DTX 700 LCD, количество спотов считали с помощью компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Количество ИФН-у-секретирующих антиген-реактивных Т-клеток представляли в расчете на 1 млн CD4+- или CD8+-Т-клеток.
Анализ антител, специфично связывающихся с антигенами карциномы 4T1 или меланомы B16F10. Сывороточные антитела, связывающиеся с внутриклеточными антигенами клеток карциномы 4Т1 или мела-номы B16F10, исследовали методом иммунофермент-ного анализа (ИФА). Использовали планшеты MaxiSorp (NUNC). В лунках планшета адсорбировали лизат клеточной линии 4Т1 или меланомы B16F10. Для этого в каждую лунку вносили 100 мкл лизата с концентрацией 50 мкг/мл, инкубировали в течение 12 ч при 4 °С. После блокировали 4 % БСА в лунки планшета вносили разведения исследуемых сывороток, инкубировали в течение 2 ч. Отмывали фосфатным буфером с 0,05 % Tween-20, затем инкубировали с козьими антителами к тяжелым и легким цепям IgG мыши, конъюгирован-ными с биотином (Cat. No. 103008, Bio-Rad, США). Вновь отмывали фосфатным буфером с 0,05 % Tween-20 и инкубировали со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (Oat. No. 710005, Bio-Rad, США). Добавляли субстрат пероксидазы хрена - ТМБ. Реакцию останавливали раствором серной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм.
Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения Graph-Pad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., США). Результаты экспериментов представляли в виде медианы и про-центилей (25-й и 75-й процентили). Статистический анализ данных проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (различия считались значимыми приp < 0,05).
Результаты
Сравнение интенсивности Т-клеточных реакций на вакцину Multivac у мышей BALB/c и C57BL/6J
Мы сравнили иммуногенность вакцин серии Mul-tivac у мышей, различающихся своей генетической основой и имеющих значительные различиями по генам гистосовместимости. Использовали две экспериментальные модели сингенных опухолей - карциному молочной железы 4Т1 у мышей BALB/c и меланому B16F10 у мышей C57BL/6J.
Мыши BALB/c гомозиготны по генам MHC, имеют 3 гена MHC класса I, представленных аллельными вариантами H-2Kd, H-2Dd и H-2Ld, а также 2 гена MHC класса II, представленных аллельными вариантами H-2Ad и H-2Ed. Мыши C57BL/6J тоже гомозиготны по генам MHC, имеют 2 гена MHC класса I в виде ал-лельных вариантов H-2Kb и H-2Db, а также 1 ген MHC класса II в виде аллельного варианта H-2Ab.
Рис. 1. Интенсивность противоопухолевых Т-клеточных реакций у мышей БЛЬБ/с на иммунизацию МиШуас-1 против карцинома: 4Т1 и у мышей С57БЬ/61 на иммунизацию МиШуас-1 против меланомы Б16И0
Представлены результаты исследования методом ЕЫБрМ очищенных сортировкой популяций СБ4+- и СБ8+-Т-клеток, выделенных из селезенок индивидуальных мышей. По оси ординат - количество Т-клеток-эффекторов или Т-клеток памяти (в расчете на 1 млн СБ4+- или СВ8+-Т-клеток) в селезенках мышей через 2 нед после 4 иммунизаций вакциной МиШуас-1. Контроль - мыши, получавшие ложную иммунизацию (инъекции физиологического раствора 0,9 % МаС1 вместо вакцины). Представлены медианные значения в группе и процентили (25-й и 75-й процентили). Достоверность различий (р) между группами анализировали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.
х и
О s а
" 1 §
о 2 s
¡S ^
S & S
R н Я
.9 8 о
J то
^ а
к «, ©
S
« 2 Ji Е-
3 ¥ S
^ X о w Е2 *
^ f я
S2 13 Еа (р-
я
Мыши BALB/с иммунизация Multivac-1 против карциномы 4Т1
Т-клетки-эффекторы против карциномы 4Т1
5000-1 40003000 -2000 -1000 -0 -
0,0134
0,0534
Ш
CD4
CD8
Антиген-реактивные Т-клетки памяти против карциномы 4Т1
0,0326
<0,0001
3000 п
2000 -
2 & Й 1000 -
н g г
о 9 о ©¿Yd
tr v &
SK »
g © w
« S
0
fil
■
1
I
CD4 П Контроль
CD8 □ Multivac-1
Т ле x 3 оин
о 2 s S ^ S
лт н оее
Ко кре ете
К . ©
s
к
й о ыт я S ^
ивн -кл отк тик Т- лет
TO О
a is
^ э ®
§ 2 S р 1
и
й ^ Ы
я н я а е е
' & 6;
е
Мыши C57BL/6J иммунизация Multivac-1 против меланомы B16F10
Т-клетки-эффекторы против меланомы В16
2500-. 20001500 -1000 -500 -0-
<0,0001
1
i
CD4
CD8
Антиген-реактивные Т-клетки памяти против меланомы В16
ок в ек
5 у « £
я Д м
§ © w
« S
5000 4000 3000 2000 1000 0
<0,0001
<0,0001
i
5
CD4 CD8
[J Контроль В Multivac-1
I'/.S
Ткань первичной опухоли, полученную при хирургической резекции, либо чистую популяцию злокачественных клеток опухоли, выращенную в культуре клеток in vitro, использовали для приготовления вариантов мультиантигенной вакцины Multivac-1 и Multivac-4, как это было описано ранее [1]. Мышей иммунизировали 4-кратно с интервалами в 2 нед между иммунизациями. Интенсивность иммунных реакций анализировали через 2 нед после последней иммунизации. Иммуноген-ность вакцин Multivac-1 и Multivac-4 у двух генетически различающихся линий мышей сравнивали по накоплению в селезенке CD4+- и CD8+-Т-клеток-эффекторов, секретирующих ИФН-у, а также CD4+- и CD8+-Т-клеток памяти, специфически отвечающих на реактивацию антигенами соответствующей опухоли.
Интенсивность Т-клеточных реакций у мышей BALB/c и C57BL/6J в ответ на два варианта Multivac-1,
приготовленных, соответственно, из тканей опухолей 4Т1 и Б16Б10, представлена на рис. 1. Обе линии мышей эффективно отвечали на иммунизацию вакцинами МиШуас-1, однако наблюдались некоторые различия в детальных характеристиках иммунного ответа. В селезенках мышей БЛЬБ/с накапливалось 3070 ± 2277 СБ4+-Т-клеток-эффекторов и 2560 ± 1301 СБ8+-Т-клеток-эффекторов, секретирующих ИФН-у (в расчете на 1 млн соответствующих Т-клеток). В селезенках мышей С57БЬ/61 тоже накапливалось 2044 ± 568 СБ4+-Т-клеток-эффекторов, секретирующих ИФН-у. Однако содержание СБ8+-Т-клеток-эффекторов не отличалось от такового в селезенках контрольных, неиммунизиро-ванных, мышей.
Количество антиген-реактивных Т-клеток памяти, вырабатывающих ИФН-у при реактивации антигенами опухоли 4Т1, в селезенках мышей БЛЬБ/с, иммунизи-
Рис. 2. Интенсивность противоопухолевых Т-клеточных реакций у мышей BALB/c на иммунизацию Multivac-4 против карциномы 4T1 и у мышей C57BL/6J на иммунизацию Multivac-4 против меланомы B16F10
Представлены результаты исследования методом ELISpot очищенных сортировкой популяций CD4+- и СВ8+-Т-клеток, выделенных из селезенок индивидуальных мышей. По оси ординат - количество Т-клеток-эффекторов или Т-клеток памяти (в расчете на 1 млн CD4+-Т-клеток или CD8+-1-клеток) в селезенках мышей через 2 нед после 4 иммунизаций вакциной Multivac-4. Контроль - мыши, получавшие ложную иммунизацию (инъекции физиологического раствора 0,9 % NaCl вместо вакцины). Представлены медианные значения в группе и процентили (25-й и 75-й процентили). Достоверность различий (p) между группами анализировали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.
В И
§ о
^ и
х 3
о s я
" i §
о 2 s
S ^ —
^ Ср ^
s ^ s
5 ^ *
5 » о
(D F
■О О
' й
^ &
аз «, ©
и с
х
s
S г'
Й M
5 « э *
2 я ^^
6 « я и
i
и -
Й *
к н
rt il w
g & S
H « £
I " 8
F ^ &
я К Ä
g ©
« S
4000-, 3000 -2000 -1000 -0 -
Мыши BALB/с иммунизация Multivac-4 против карциномы 4Т1
Т-клетки-эффекторы против карциномы 4Т1
0,0001 0,0009
CD4
CD8
Антиген-реактивные Т-клетки памяти против карциномы 4Т1
ле к ко
8000-1 6000400020000-
<0,0001
0,0002
J^L
Ï
CD4 CD8
□ Контроль □ Multivac-4
к о т
Т- ле х sä оин H % 5
и
2
и ир
Мыши C57BL/6J иммунизация Multivac-4 против меланомы B16F10
Т-клетки-эффекторы против меланомы В16
т
и
лт оее
Ко кре ете
(U F
о о
-а
^ &
аз «, ©
6000
4000
2000
<0,0001
П,П
CD4
CD8
* s
ны олет вл и -к тки Т-
^ 3 *
5 2 ä
6 ^
H я ^
Я H Я
а ре е о кр те вке
S3 ¥ 5 g ^ â
s я «
g © w
« S
Антиген-реактивные Т-клетки памяти против меланомы В16
0,0113
4000-1 3000200010000-
CD4 CD8
□ Контроль В Multivac-4
ns
0
рованных МиШуас-1, составило 1495 ± 611 в популяции СБ4+-Т-клеток и 2550 ± 909 в популяции СБ8+-Т-клеток. Еще более мощным был ответ мышей С57БЬ/61 на вакцинацию МиШуас-1 против меланомы Б16Б10, в их селезенках накапливалось 3467 ± 1024 СБ4+-Т-клеток памяти и 4163 ± 618 СБ8+-Т-клеток памяти (рис. 1).
Подобно вакцинам МиШуас-1, иммунизация МиШ-уас-4 индуцировала интенсивные иммунные реакции против антигенов соответствующих опухолей. Так, у мышей БАЬБ/с, иммунизированных МиШуас-4 против карциномы 4Т1, в селезенках накапливалось 3250 ± 1114 СБ4+-Т-клеток-эффекторов и 2848 ± 1266 СБ8+-Т-клеток-эффекторов (рис. 2). У мышей С57БЬ/61, вакцинированных МиШуас-4 против меланомы Б16Б10, в селезенках накапливалось 4700 ± 1998 СБ4+-Т-клеток-эффекторов, однако, как и при иммунизации МиШуас-1, не происходило накопления СБ8+-Т-клеток-эффекторов.
У мышей обоих генотипов вакцинация МиШуас-4 вызывала интенсивное накопление антиген-реактив-
ных Т-клеток памяти. После иммунизации вакциной МиШуас-4 против карциномы 4Т1 в селезенках мышей БАЬБ/с накапливалось 6155 ± 1633 СБ4+-Т-клеток памяти и 3507 ± 1008 СБ8+-Т-клеток памяти. У мышей С57БЬ/61 вакцинация МиШуас-4 индуцировала образование 1855 ± 840 СБ4+-Т-клеток памяти и 3522 ± 678 СБ8+-Т-клеток памяти (рис. 2).
Сравнение интенсивности антительных реакций на вакцину Multivac у мышей BALB/c и C57BL/6J
Независимо от генотипа мыши БАЬБ/с и С57БЬ/61 в ответ на иммунизацию вакцинами серии МиШуас интенсивно продуцировали сывороточные антитела, специфически связывающиеся с антигенами опухоли, использованной для приготовления вакцины. На рис. 3 представлены результаты измерения концентрации противоопухолевых антител в сыворотках крови мышей. Иммунизация вакциной МиШуас-4 индуцировала накопление в сыворотке крови мышей БАЬБ/с антител, связывающихся с антигенами клеток карциномы 4Т1, в титрах выше 1 : 10 000. Аналогично, в сыворотках
2,5-1 2,0-
х 1,5-
е 1,0-о
0,5-| 0,0
Мыши BALB/с иммунизация Multivac-4 против карциномы 4Т1
■ Multivac-4
■ Контроль
* p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001 ****p < 0,0001
10 100 1000 10 000 100 000 1 000 000 Разведения сывороток
2,5
2,0
и 1,5 0 5
ti-t^ 1,0 О
0,5 0,0
Мыши C57BL/6J иммунизация Multivac-4 против меланомы B16F10
Multivac-4 Контроль
* p < 0,05 **p < 0,01
10 100 1000 10 000 100 000 1 000 000
Разведения сывороток
Рис. 3. Содержание антител, специфически связывающихся с опухолевыми антигенами, в сыворотках крови мышей БЛЬБ/с, вакцинированных МиШуас-4 против карциномы 4Т1, и у мышей С57БЬ/61, вакцинированных МиШуас-4 против меланомы Б16П0 МиШуас-4 - вакцинированные мыши через 2 нед после 4 иммунизации. Сыворотки индивидуальных мышей титровали методом иммуноферментного анализа. В качестве антигена использовали лизаты соответствующих опухолей (см. Материал и методы). Контроль - мыши, получавшие ложную иммунизацию (инъекции физиологического раствора 0,9 % МаС1 вместо вакцины). Представлены медианные значения в группе и процентили (25-й и 75-й процентили). Достоверность различий (р) между группами анализировали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.
*
крови мышей С57БЬ/61, иммунизированных вакциной МиШуас-4 против меланомы Б16Р10, накапливались специфические к меланоме антитела в титрах более 1 : 10 000.
Обсуждение
Представленные в данной работе результаты исследования свидетельствуют о том, что вакцины серии МиШуас в одинаковой степени эффективны при иммунизации инбредных мышей, имеющих разные генотипы и существенно различающихся аллельными вариантами генов МНС классов I и II. Высокая иммуногенность вакцины, не зависящая от генотипа иммунизируемого индивида, - это желанное свойство для любой вакцины, в том числе для МиШуас. Результаты успешной иммунизации мышей двух разных генотипов позволяют надеяться, что и у пациентов, генотип которых всегда уникален, вакцины серии МиШуас будут эффективными.
Различия между мышами БЛЬБ/с и С57БЬ/61 по накоплению СБ8+-Т-клеток-эффекторов после иммунизации вакцинами МиШуас (рис. 1 и 2) могут объясняться различиями в динамике иммунных реакций у этих двух генотипов мышей. Через 2 нед после 4-й иммунизации мы не видели накопления СБ8+-Т-клеток-эффекторов, секретирующих ИФН-у, у мышей С57БЬ/6Ь В то же время у этих же мышей в селезенках мы регистрировали большое количество антиген-реактивных СБ8+-Т-клеток памяти. Маловероятно, если вообще возможно, чтобы в популяции СБ8+-Т-клеток шла мощная адаптивная реакция в ответ на вакцину с образованием большого числа СБ8+-Т-клеток памяти без генерации значительного пула СБ8+-Т-клеток-эффекторов.
Т-клетки-эффекторы и Т-клетки памяти являются стадиями одного и того же процесса - экспоненциального размножения и дифференцировки антиген-специ-
фических Т-клеток [25]. Стадия клеток-эффекторов предшествует формированию клеток памяти. Полученный нами результат может указывать на то, что у мышей C57BL/6J эффекторная фаза Т-клеточной реакции происходит и завершается быстрее, чем у мышей BALB/c. По этой причине через 2 нед после последней иммунизации мы уже не выявляем короткоживущие CD8+-T-клетки-эффекторы, но обнаруживаем долгоживущую популяцию CD8+-T-клеток памяти. Это предположение требует проверки путем экспериментального сравнения динамики эффекторной фазы реакции Т-клеток в ответ на иммунизацию вакциной Multivac у мышей C57BL/6J и BALB/c.
Полученные нами данные доказывают, что высокая иммуногенность вакцин серии Multivac не зависит от генотипа вакцинируемого «хозяина». Причины такой независимости от генотипа вакцинируемого, скорее всего, кроются в разнообразии опухолевых антигенов в составе таких вакцин. Интенсивность ответа на индивидуальный антигенный эпитоп прямо зависит от аффинности его взаимодействия с молекулами MHC, экспонированными на поверхности антиген-презенти-рующих клеток.
Вакцины серии Multivac содержат множество антигенов опухоли, поскольку в их составе используется лизат ткани опухоли или лизат злокачественных клеток, полученных из опухоли методом культивирования in vitro. При процессинге вакцины в антиген-презен-тирующих клетках, большое количество различных по природе антигенов превращается в еще большее количество антигенных пептидов. Из каждого белкового антигена образуются многие десятки или даже сотни пептидных фрагментов, потенциально способных экспонироваться в комплексе с молекулами MHC. Чем больше множество антигенных пептидов, тем выше
вероятность того, что какие-то антигенные пептиды из этого множества будут взаимодействовать с высокой аффинностью с аллельными вариантами MHC данного пациента. Иными словами, обогащенность различными опухолевыми антигенами является большим достоинством вакцин серии Multivac, поскольку создает материальную основу для высокой вероятности хорошего иммунного ответа, несмотря на уникальность аллельных вариантов генов MHC пациента.
В исследовании, описанном в этой работе, сравнивалась эффективность иммунизации вакцинами Multivac не только у генетически различающихся линий мышей. Мы также сравнивали эффективность вакцин серии Multivac, созданных на основе лизатов двух совершенно различных по своей природе опухолей - карциномы молочной железы и меланомы.
Огромные различия между этими опухолями доказаны на уровне геномных аберраций [26]. В карциноме 4Т1 доказано наличие 505 однонуклеотидных замен (SNV), 20 небольших нуклеотидных вставок (indel) и 12 событий слияния последовательностей различных генов (fusion) [27]. В меланоме B16F10 доказана экспрессия 1392 мутаций на уровне мРНК, из них
■ Литература
1. Ушакова Е.И., Федорова А.А., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Иммуногенность мультиантигенной вакцины, приготовленной из лизата злокачественных клеток опухоли. Иммунология. 2022; 43 (4): 389-400. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-389-400
2. Rammensee H.G., Friede Т., Stevanoviic S. MHC ligands and peptide motifs: first listing. Immunogenetics. 1995; 41 (4): 178-228. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00172063 PMID: 7890324.
3. Castro C.D., Luoma A.M., Adams E.J. Coevolution of Т-cell receptors with MHC and non-MHC ligands. Immunol. Rev. 2015; 267 (1): 30-55. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12327 PMID: 26284470.
4. Szeto C., Lobos C.A., Nguyen AT., Gras S. TCR recognition of peptide-MHC-I: rule makers and breakers. Int. J. Mol. Sci. 2020; 22 (1): 68. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22010068 PMID: 33374673.
5. Wieczorek M., Abualrous Е.Т., Sticht J., Älvaro-Benito M., Stolzenberg S., Noe F., Freund C. Major histocompatibility complex (MHC) class I and MHC class II proteins: conformational plasticity in antigen presentation. Front. Immunol. 2017; 8: 292. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2017.00292 PMID: 28367149.
6. ten Broeke Т., Wubbolts R., Stoorvogel W. MHC class II antigen presentation by dendritic cells regulated through endosomal sorting. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013; 5 (12): a016873. DOI: https://doi. org/10.1101/cshperspect.a016873 PMID: 24296169.
7. Calis J.J., Maybeno M., Greenbaum J.A., Weiskopf D., De Silva A.D., Sette A., Ke§mir C., Peters B. Properties of MHC class I presented peptides that enhance immunogenicity. PLoS Comput. Biol. 2013; 9 (10): e1003266. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003266.
8. Kotturi M.F., Scott I., Wolfe Т., Peters B., Sidney J., Cheroutre H., von Herrath M.G., Buchmeier M.J., Grey H., Sette A. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ Т cell immunodominance. J. Immunol. 2008; 181 (3): 2124-33. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.181.3.2124 PMID: 18641351.
9. Tynan F.E., Borg N.A., Miles J.J., Beddoe Т., El-Hassen D., Sil-ins S.L., van Zuylen W.J., Purcell A.W., Kjer-Nielsen L., McCluskey J., Burrows S.R., Rossjohn J. High resolution structures of highly bulged viral epitopes bound to major histocompatibility complex class I. Implications for Т-cell receptor engagement and Т-cell immunodominance. J. Biol. Chem. 2005; 280 (25): 23 900-9. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc. M503060200 PMID: 15849183.
10. Kreiter S., Vormehr M., van de Roemer N., Diken M., Löwer M., Diekmann J., Boegel S., Schrörs B., Vascotto F., Castle J.C., Tad-mor A.D., Schoenberger S.P., Huber C., Türeci Ö., Sahin U. Mutant MHC
962 мутации несинонимические, создающие основу для существенных изменений в структуре и антигенных свойствах мутантного белка [28]. Из 50 генов, чаще всего мутирующих в раковых клетках, в карциноме 4T1 мутировано 12 генов, а в меланоме B16F10 -26 генов. Причем совпадений между двумя опухолями по мутированным генам всего 7, т. е. на уровне геномных аббераций и, как следствие, по мутационным антигенам меланома B16F10 и карцинома 4T1 драматически различаются [26].
В экспериментах, описанных в этом сообщении (рис. 1-3), вакцины Multivac, в составе которых содержались лизаты клеток карциномы 4T1 или клеток меланомы B16F10, продемонстрировали одинаково высокую иммуногенность, несмотря на значительные различия по антигенному составу между карциномой 4T1 и ме-ланомой B16F10. Иначе говоря, технологическая платформа Multivac позволяет создавать высокоиммуно-генные вакцины из злокачественных клеток опухолей, различных по тканевой природе и антигенному составу, а интенсивные иммунные реакции в ответ на иммунизацию вакцинами серии Multivac не зависят от генотипа иммунизируемого индивида.
class II epitopes drive therapeutic immune responses to cancer. Nature. 2015; 520 (7549): 692-6. DOI: https://doi.org/10.1038/nature14426.
11. Chan Т. A., Wolchok J.D., Snyder A. Genetic Basis for Clinical Response to CTLA-4 Blockade in melanoma. N. Engl. J. Med. 2015; 373 (20): 1984. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMc1508163.
12. Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М. Вакцины для лечения злокачественных новообразований. Иммунология. 2019; 40 (4): 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-140
13. Sahin U., Derhovanessian E., Miller M., Kloke B.P., Simon P., Löwer M., Bukur V., Tadmor A.D., Luxemburger U., Schrörs B., Omoko-ko Т., Vormehr M., Albrecht C., Paruzynski A., Kuhn A.N., Buck J., He-esch S., Schreeb K.H., Müller F., Ortseifer I., Vogler I., Godehardt E., Attig S., Rae R., Breitkreuz A., Tolliver C., Suchan M., Martic G., Hohberger A., Sorn P., Diekmann J., Ciesla J., Waksmann O., Brück A.K., Witt M., Zillgen M., Rothermel A., Kasemann B., Langer D., Bolte S., Diken M., Kreiter S., Nemecek R., Gebhardt C., Grabbe S., Höller C., Utikal J., Huber C., Loquai C., Türeci Ö. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature. 2017; 547 (7662): 222-6. DOI: https://doi.org/10.1038/nature23003.
14. Ott P.A., Hu Z., Keskin D.B., Shukla S.A., Sun J., Bozym D.J., Zhang W., Luoma A., Giobbie-Hurder A., Peter L., Chen C., Olive O., Carter T.A., Li S., Lieb D.J., Eisenhaure Т., Gjini E., Stevens J., Lane W.J., Javeri I., Nellaiappan K., Salazar A.M., Daley H., Seaman M., Buchbinder E.I., Yoon C.H., Harden M., Lennon N., Gabriel S., Rodig S.J., Ba-rouch D.H., Aster J.C., Getz G., Wucherpfennig K., Neuberg D., Ritz J., Lander E.S., Fritsch E.F., Hacohen N., Wu C.J. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma. Nature. 2017; 547 (7662): 217-21. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22991 PMID: 28678778.
15. Yamamoto T.N., Kishton R.J., Restifo N.P. Developing neoantigen-targeted Т cell-based treatments for solid tumors. Nat. Med. 2019; 25 (10): 1488-99. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-019-0596-y PMID: 31591590.
16. Hu Z., Ott P.A., Wu C.J. Towards personalized, tumour-specific, therapeutic vaccines for cancer. Nat. Rev. Immunol. 2018; 18 (3): 168-82. DOI: https://doi.org/10.1038/nri.2017.131 PMID: 29226910.
17. Sahin U., Oehm P., Derhovanessian E., Jabulowsky R.A., Vormehr M., Gold M., Maurus D., Schwarck-Kokarakis D., Kuhn A.N., Omo-koko Т., Kranz L.M., Diken M., Kreiter S., Haas H., Attig S., Rae R., Cuk K., Kemmer-Brück A., Breitkreuz A., Tolliver C., Caspar J., Quinkhardt J., Hebich L., Stein M., Hohberger A., Vogler I., Liebig I., Renken S., Sikorski J., Leierer M., Müller V., Mitzel-Rink H., Miederer M., Huber C., Grabbe S., Utikal J., Pinter A., Kaufmann R., Hassel J.C., Loquai C., Türeci Ö. An RNA vaccine drives immunity in checkpoint-in-
hibitor-treated melanoma. Nature. 2020; 585 (7823): 107-12. DOI: https:// doi.org/10.1038/s41586-020-2537-9 PMID: 32728218.
18. Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Багаев А.В., Пичугин А.В., Ата-уллаханов Р.И. Комбинированная иммунотерапия метастатической карциномы у лабораторных мышей путем резекции первичного опухолевого узла и последующего перепрограммирования макрофагов и дендритных клеток с помощью агониста TLR4. Иммунология. 2021; 42 (5): 490-501. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-490-501
19. Багаев А.В., Рыбинец А.С., Федорова А.А., Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Синергизм агонистов TLR3 и TLR4 при перепрограммировании макрофагов в противоопухолевое состояние. Иммунология. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630
20. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Гараева А.Я., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Кооперативное взаимодействие сигнальных путей рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 в макрофагах мыши. Иммунология. 2018; 39 (1): 4-11. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-4-11
21. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М.М., Атауллаханов Р. И. Комбинированное применение трех агонистов рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 синергически увеличивает выработку белков-цитокинов макрофагами мыши. Иммунология. 2018; 39 (4): 172-7. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-172-177
22. Чулкина М.М., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Гараева А.Я., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Синергическая активация транскрипции генов INOS, IFN-ß, IL12p40, IL6, TNF-a при одновременном воздействии на макрофаги агонистами рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2. Иммунология. 2018; 39 (4): 178-85. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-178-185
23. Лебедева Е.С., Джаруллаева А.Ш., Багаев А.В., Ерохова А.С., Чулкина М.М., Тухватулин А.И., Пичугин А.В., Логунов Д.Ю., Атаул-
лаханов Р. И. Сочетанная стимуляция рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 синергически повышает защиту лабораторных мышей в модели летальной инфекции Salmonella enterica. Иммунология. 2018; 39 (5-6): 252-7. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-252-257
24. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Ataullakha-nov R., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunol. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x
25. Cui W., Kaech S.M. Generation of effector CD8+ T cells and their conversion to memory T cells. Immunol. Rev. 2010; 236: 151-66. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2010.00926.x PMID: 20636815.
26. Mosely S.I., Prime J.E., Sainson R.C., Koopmann J.O., Wang D.Y., Greenawalt D.M., Ahdesmaki M.J., Leyland R., Mullins S., Pacelli L., Marcus D., Anderton J., Watkins A., Coates Ulrichsen J., Bro-hawn P., Higgs B.W., McCourt M., Jones H., Harper J.A., Morrow M., Valge-Archer V., Stewart R., Dovedi S.J., Wilkinson R.W. Rational selection of syngeneic preclinical tumor models for immunotherapeutic drug discovery. Cancer Immunol. Res. 2017; 5 (1): 29-41. DOI: https://doi. org/10.1158/2326-6066.CIR-16-0114 PMID: 27923825.
27. Schrörs B., Boegel S., Albrecht C., Bukur T., Bukur V., Holts-träter C., Ritzel C., Manninen K., Tadmor A.D., Vormehr M., Sahin U., Löwer M. Multi-omics characterization of the 4T1 murine mammary gland tumor model. Front. Oncol. 2020; 10: 1195. DOI: https://doi.org/10.3389/ fonc.2020.01195 PMID: 32793490.
28. Castle J.C., Kreiter S., Diekmann J., Löwer M., van de Roemer N., de Graaf J., Selmi A., Diken M., Boegel S., Paret C., Koslowski M., Kuhn A.N., Britten C.M., Huber C., Türeci O., Sahin U. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res. 2012; 72 (5): 1081-91. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-11-3722 PMID: 22237626.
■ References
1. Ushakova E.I., Fedorova A.A., Lebedeva E.S., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Immunogenicity of a multi-antigen vaccine made from a lysate of tumor malignant cells. Immunologiya. 2022; 43 (4): 389-400. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-389-400 (in Russian)
2. Rammensee H.G., Friede T., Stevanoviic S. MHC ligands and peptide motifs: first listing. Immunogenetics. 1995; 41 (4): 178-228. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00172063 PMID: 7890324.
3. Castro C.D., Luoma A.M., Adams E.J. Coevolution of T-cell receptors with MHC and non-MHC ligands. Immunol. Rev. 2015; 267 (1): 30-55. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12327 PMID: 26284470.
4. Szeto C., Lobos C.A., Nguyen A.T., Gras S. TCR recognition of peptide-MHC-I: rule makers and breakers. Int. J. Mol. Sci. 2020; 22 (1): 68. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22010068 PMID: 33374673.
5. Wieczorek M., Abualrous E.T., Sticht J., Älvaro-Benito M., Stolzenberg S., Noe F., Freund C. Major histocompatibility complex (MHC) class I and MHC class II proteins: conformational plasticity in antigen presentation. Front. Immunol. 2017; 8: 292. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2017.00292 PMID: 28367149.
6. ten Broeke T., Wubbolts R., Stoorvogel W. MHC class II antigen presentation by dendritic cells regulated through endosomal sorting. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013; 5 (12): a016873. DOI: https://doi. org/10.1101/cshperspect.a016873 PMID: 24296169.
7. Calis J.J., Maybeno M., Greenbaum J.A., Weiskopf D., De Silva A.D., Sette A., Ke§mir C., Peters B. Properties of MHC class I presented peptides that enhance immunogenicity. PLoS Comput. Biol. 2013; 9 (10): e1003266. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003266 PMID: 24204222.
8. Kotturi M.F., Scott I., Wolfe T., Peters B., Sidney J., Cheroutre H., von Herrath M.G., Buchmeier M.J., Grey H., Sette A. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J. Immunol. 2008; 181 (3): 212433. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.18L3.2124.
9. Tynan F.E., Borg N.A., Miles J.J., Beddoe T., El-Hassen D., Si-lins S.L., van Zuylen W.J., Purcell A.W., Kjer-Nielsen L., McCluskey J., Burrows S.R., Rossjohn J. High resolution structures of highly bulged viral epitopes bound to major histocompatibility complex class I. Implications for T-cell receptor engagement and T-cell immunodominance. J. Biol. Chem. 2005; 280 (25): 23 900-9. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc. M503060200 PMID: 15849183.
10. Kreiter S., Vormehr M., van de Roemer N., Diken M., Löwer M., Diekmann J., Boegel S., Schrörs B., Vascotto F., Castle J.C., Tadmor A.D., Schoenberger S.P., Huber C., Türeci Ö., Sahin U. Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses to cancer. Nature. 2015; 520 (7549): 692-6. DOI: https://doi.org/10.1038/nature14426.
11. Chan T.A., Wolchok J.D., Snyder A. Genetic Basis for Clinical Response to CTLA-4 Blockade in melanoma. N. Engl. J. Med. 2015; 373 (20): 1984. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMc1508163.
12. Lebedeva E.S., Ataullakhanov R.I., Khaitov R.M. Vaccines for the treatment of malignant neoplasms. Immunologiya. 2019; 40 (4): 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-14008 (in Russia)
13. Sahin U., Derhovanessian E., Miller M., Kloke B.P., Simon P., Löwer M., Bukur V., Tadmor A.D., Luxemburger U., Schrörs B., Omokoko T., Vormehr M., Albrecht C., Paruzynski A., Kuhn A.N., Buck J., Heesch S., Schreeb K.H., Müller F., Ortseifer I., Vogler I., Godehardt E., Attig S., Rae R., Breitkreuz A., Tolliver C., Suchan M., Martic G., Hohberger A., Sorn P., Diekmann J., Ciesla J., Waksmann O., Brück A.K., Witt M., Zillgen M., Rothermel A., Kasemann B., Langer D., Bolte S., Diken M., Kreiter S., Nemecek R., Gebhardt C., Grabbe S., Höller C., Utikal J., Huber C., Lo-quai C., Türeci Ö. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature. 2017; 547 (7662): 222-6. DOI: https://doi.org/10.1038/nature23003 PMID: 28678784.
14. Ott P.A., Hu Z., Keskin D.B., Shukla S.A., Sun J., Bozym D.J., Zhang W., Luoma A., Giobbie-Hurder A., Peter L., Chen C., Olive O., Carter T.A., Li S., Lieb D.J., Eisenhaure T., Gjini E., Stevens J., Lane W.J., Javeri I., Nellaiappan K., Salazar A.M., Daley H., Seaman M., Buchbinder E.I., Yoon C.H., Harden M., Lennon N., Gabriel S., Rodig S.J., Ba-rouch D.H., Aster J.C., Getz G., Wucherpfennig K., Neuberg D., Ritz J., Lander E.S., Fritsch E.F., Hacohen N., Wu C.J. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma. Nature. 2017; 547 (7662): 217-21. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22991 PMID: 28678778.
15. Yamamoto T.N., Kishton R.J., Restifo N.P. Developing neo-antigen-targeted T cell-based treatments for solid tumors. Nat. Med. 2019; 25 (10): 1488-99. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-019-0596-y.
16. Hu Z., Ott P.A., Wu C.J. Towards personalized, tumour-specific, therapeutic vaccines for cancer. Nat. Rev. Immunol. 2018; 18 (3): 168-82. DOI: https://doi.org/10.1038/nri.2017.131 PMID: 29226910.
17. Sahin U., Oehm P., Derhovanessian E., Jabulowsky R.A., Vormehr M., Gold M., Maurus D., Schwarck-Kokarakis D., Kuhn A.N., Omokoko T., Kranz L.M., Diken M., Kreiter S., Haas H., Attig S., Rae R., Cuk K., Kemmer-Brück A., Breitkreuz A., Tolliver C., Caspar J., Quinkhardt J., Hebich L., Stein M., Hohberger A., Vogler I., Liebig I., Renken S., Sikorski J., Leierer M., Müller V., Mitzel-Rink H., Miederer M., Huber C., Grabbe S., Utikal J., Pinter A., Kaufmann R., Hassel J.C., Lo-quai C., Türeci Ö. An RNA vaccine drives immunity in checkpoint-inhibitor-treated melanoma. Nature. 2020; 585 (7823): 107-12. DOI: https://doi. org/10.1038/s41586-020-2537-9 PMID: 32728218.
18. Ushakova E.I., Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Pichugin A.V., Ataul-lakhanov R.I. Combined immunotherapy of metastatic carcinoma by resection of the primary tumor and subsequent reprogramming of macrophages and dendritic cells using a TLR4 agonist in laboratory mice. Immunologi-ya. 2021; 42 (5): 490-501. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-490-501 (in Russian)
19. Bagaev A.V., Rybinets A.S., Fedorova A.A., Ushakova E.I., Lebe-deva E.S., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Synergism of TLR3 and TLR4 agonists during reprogramming of macrophages to antitumor state. Immunologiya. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630 (in Russian)
20. Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Garaeva A.Y., Chulkina M.M., Pi-chugin A.V., Ataullakhanov R.I. The cooperative interaction of TLR4-, TLR9- and NOD2-signaling pathways in mouse macrophages. Immu-nologiya. 2018; 39 (1): 4-11. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-4-11 (in Russian)
21. Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M.M., Ataullakhanov R.I. Combined activation with agonists of TLR4, TLR9 AND NOD2 receptors synergistically increases production of cytokine-proteins in mouse macrophages. Immunologiya. 2018; 39 (4): 172-7. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-172-177 (in Russian)
22. Chulkina M.M., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Garaeva A.Ya., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Synergistic activation of INOS, IFN-p, II12p40, IL6, TNF-a genes transcription in macrophages under simultaneous influence with agonists of TLR4, TLR9 and NOD2 receptors. Im-munologiya. 2018; 39 (4): 178-85. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-178-185 (in Russian)
23. Lebedeva E.S., Dzharullaeva A.Sh., Bagaev A.V., Erokhova A.S., Chulkina M.M., Tukhvatulin A.I., Pichugin A.V., Logunov D.Yu., Ataul-lakhanov R.I. Combined stimulation of receptors of TLR4, TLR9 and NOD2
Сведения об авторах
Ушакова Екатерина Игоревна - мл. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ekaterina.ushakova95@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2143-1021
Пичугин Алексей Васильевич - канд. физ.-мат. наук, вед. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: pichalvas@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5356-3331
Федорова Анастасия Алексеевна - лаборант лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: anastasyafedorovafedorova@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-2687-9319
Лебедева Екатерина Семеновна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. активации иммунитета отд. иммунной биотехнологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ekaterinalebedeva2612@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0384-9299
Атауллаханов Равшан Иноятович - д-р мед. наук, проф., руководитель отд. иммунной биотехнологии, зав. лаб. активации иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
synergistically in- creases protection of laboratory mice in lethal Salmonella enterica infection model. Immunologiya. 2018; 39 (5-6): 252-7. DOI: http:// dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-252-257 (in Russian)
24. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Ataullakhanov R., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunol. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x
25. Cui W., Kaech S.M. Generation of effector CD8+ T cells and their conversion to memory T cells. Immunol. Rev. 2010; 236: 151-66. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2010.00926.x PMID: 20636815.
26. Mosely S.I., Prime J.E., Sainson R.C., Koopmann J.O., Wang D.Y., Greenawalt D.M., Ahdesmaki M.J., Leyland R., Mullins S., Pacelli L., Marcus D., Anderton J., Watkins A., Coates Ulrichsen J., Brohawn P., Higgs B.W., McCourt M., Jones H., Harper J.A., Morrow M., Valge-Archer V., Stewart R., Dovedi S.J., Wilkinson R.W. Rational selection of syngeneic preclinical tumor models for immunotherapeutic drug discovery. Cancer Immunol. Res. 2017; 5 (1): 29-41. DOI: https://doi. org/10.1158/2326-6066.CIR-16-0114 PMID: 27923825.
27. Schrörs B., Boegel S., Albrecht C., Bukur T., Bukur V., Holtsträ-ter C., Ritzel C., Manninen K., Tadmor A.D., Vormehr M., Sahin U., Löwer M. Multi-omics characterization of the 4T1 murine mammary gland tumor model. Front. Oncol. 2020; 10: 1195. DOI: https://doi.org/10.3389/ fonc.2020.01195 PMID: 32793490.
28. Castle J.C., Kreiter S., Diekmann J., Löwer M., van de Roe-mer N., de Graaf J., Selmi A., Diken M., Boegel S., Paret C., Koslowski M., Kuhn A.N., Britten C.M., Huber C., Türeci O., Sahin U. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res. 2012; 72 (5): 1081-91. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-11-3722.
Authors' information
Ekaterina I. Ushakova - Junior Researcher, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ekaterina.ushakova95@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2143-1021
Alexey V. Pichugin - PhD, Leader Researcher, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: pichalvas@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-5356-3331
Anastasiya A. Fedorova - Research Assistant, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: anastasyafedorovafedorova@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-2687-9319
Ekaterina S. Lebedeva - PhD, Senior Researcher, Immunity Activation Lab., Immune Biotechnology Dept., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: ekaterinalebedeva2612@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-0384-9299
Ravshan I. Ataullakhanov - MD, PhD, Prof., Head of Immune Biotechnology Dept., Head of the Immunity Activation Lab., NRC Institute of Immunology of FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4767-6409
