CC BY
14
УДК: 579.842.11:577.112.7:578.865.1
DOI: 10.15372/SSMJ20180605
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО АПОЛИПОПРОТЕИНА А-I В КАЧЕСТВЕ ТРАНСПОРТЕРОВ МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ
Александр Владимирович РЯБЧЕНКО, Мария Владимировна КОТОВА, Роман Александрович КНЯЗЕВ, Наталия Викторовна ТРИФОНОВА, Лев Михайлович ПОЛЯКОВ
НИИ биохимии ФИЦ фундаментальной и трансляционной медицины 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
В связи с широким развитием явления РНК-интерференции перед исследователями стоит задача получения эффективных переносчиков малых интерферирующих РНК (миРНК). Ранее нами получен модифицированный рекомбинантный полипептид на основе аполипопротеина А-I человека (апо А-I), способный связываться с плазмидными ДНК. Цель исследования - изучение способности модифицированных рекомбинантных белков апо А-I переносить миРНК в опухолевые клетки. Материал и методы. Исследования проводились на модели трансформированных макрофагов мышей линии RAW 264.7, стабильно экспрессирующих ген зеленого флуоресцирующего белка GFP (клеточная линия клона 8А3). В качестве переносчиков миРНК использовали рекомбинантный про-апо А-I и модифицированный аналог про-апо А-I, несущий на С-конце 10 аминокислотных остатков лизина (апоАК10). Для трансфекции использовали липофектамин 2000 (lipofectamine 2000). Белки получали из соответствующих штаммов-продуцентов E. coli. Объектом переноса служил дуплекс миРНК, в котором один нуклеотид был комплементарен матричной РНК гена gfp. Измерение флуоресценции клеток проводили с помощью флуоресцентного планшетного анализатора. Результаты и их обсуждение. Обнаружено, что белки про-апо А и апо АК10, меченные флуоресцеина изотиоцианатом, проникают в клетки линии RAW 264.7. Результаты исследования РНК-интерференции показали, что инкубация клеток с миРНК и липофектамином 2000 вызывает снижение флуоресценции клеток линии 8А3, что свидетельствует о корректном подборе миРНК к матричной РНК гена gfp. В то же время флуоресценция клеток клона 8А3 при культивировании с миРНК и рекомбинантными формами про-апо А-I и апо АК10 не отличалась от флуоресценции контрольных клеток, инкубированных только с миРНК. Заключение. Рекомбинантные модифицированные формы про-апо А-I и апо АК10 проникают в трансформированные мышиные макрофаги линии RAW264.7, однако не способствуют явлению РНК-интерференции в этих клетках.
Ключевые слова: аполипопротеин А-I, рекомбинантные формы про-апо А-I и апо АК10, РНК-интерференция, миРНК, макрофаги линии RAW264.7.
В настоящее время явление РНК-интерференции представляется очень перспективным инструментом для генотерапии, поэтому поиск эффективных переносчиков малых интерферирующих РНК (миРНК) становится актуальной задачей. В литературе показано, что апо-липопротеины могут являться переносчиками генетического материала, в частности, белковый компонент липопротеинов высокой плотности -аполипопротеин А-I (апо A-I) [8, 13]. Единичные работы, касающиеся данной проблемы, демонстрируют участие апо А-I в составе полисом в
переносе олигонуклеотидов через гематоэнце-фалический барьер [10]. Показана способность рекомбинантных липопротеинов высокой плотности транспортировать малые интерферирующие РНК против вируса гепатита С в гепатоциты через SR-Bl-рецепторный путь [9]. Рецепторы к апо А-I находятся во многих тканях [8], что очень важно для рецепторно-опосредованного захвата клетками комплексов «апо A-I-миРНК». Липид-ный компонент аполипопротеинов может обеспечивать формирование контейнерной структуры, аналогичной липосомам, которая должна защи-
Рябченко А.В. - к.б.н., ведущий научный сотрудник, e-mail borrelia@mail.ru
Котова М.В. - младший научный сотрудник, e-mail zerokiri@mail.ru
Князев Р.А. - к.б.н., старший научный сотрудник, e-mail Knjazev_roman@mail.ru
Трифонова Н.В. - младший научный сотрудник, e-mail nataliya-tverdohleb@yandex.ru
Поляков Л.М. - д.м.н., проф., зав. лабораторией медицинской биотехнологии, e-mailplm@niibch.ru
щать экзогенную миРНК от разрушения в моделях in vivo. Нам кажется, что наиболее вероятным способом доставки таких комплексов («апо А-I-миРНК») к опухолевым клеткам является их прямое введение в кровоток живого организма.
Другим перспективным направлением получения переносчиков миРНК является конструирование полипептидов, несущих различные функциональные модули [5, 6]. Ранее мы пытались увеличить аффинность рекомбинантного апо А-I к ДНК путем добавления в структуру гена с 3'-конца фрагмента ДНК, кодирующего 10 аминокислотных остатков (а.о.) лизина [3]. Модифицированный апо А-I получил название апо АК10 и был способен, в отличие от нативного белка, задерживать ДНК размером 1000-5000 пар ну-клеотидов (п.н.) в агарозном геле. Кроме того, на примере эндонуклеазы рестрикции Hinf I было показано, что белок в определенной степени способен защищать плазмидную ДНК от гидролиза. Ранее мы изучили возможность использования нативного и рекомбинантного апо А-I нативной формы для доставки миРНК в опухолевые клетки макрофагов лини RAW 264.7, стабильно экс-прессирующие ген зеленого флуоресцирующего белка GFP (клеточная линия клона 8А3). Однако снижения флуоресценции в этих клетках обнаружено не было, что, возможно, обусловлено отсутствием специфического взаимодействия белка с миРНК. Получение модифицированного апо АК10, связывающего ДНК и обладающего большим аффинитетом, чем апо А-I нативной формы, позволяет по-новому изучить вопрос использования апо АК10 для доставки миРНК в опухолевые клетки. В связи с этим целью нашего исследования являлось изучение способности модифицированных рекомбинантных белков апо А-I (про-апо А-I и апо АК10) переносить миРНК в опухолевые клетки на модели мышиных макрофагов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Рекомбинантный апо А-I нативной формы и модифицированный апо АК10 получали из соответствующих штаммов-продуцентов Escherichia coli, сконструированных ранее в нашей лаборатории [3]. Для наработки биомассы использовали клетки E. coli штамм BL21(DE3). Из музейного клона продуцента выращивали ночную культуру в среде LB объемом 5 мл при 37 °С и на следующий день переносили в двухлитровую колбу с 500 мл свежей среды LB, содержащей кана-мицин 30 мкг/мл. Клетки выращивали при активном перемешивании и 37 °С до оптической плотности D600 = 0,8-1,2 о.е., добавляли индук-
тор изопропил^^-1-тиогалактопиранозид до 0,05 мМ, инкубировали 18 ч при 30 °С, после чего осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, осадок замораживали и хранили до выделения белка. Клетки разрушали ультразвуком в буфере с мочевиной (100 мМ диги-дрофосфата натрия, 10 мМ трис(гидроксиметил) аминометана, 6 М мочевины, 20 мМ имидазола, рН 8,0). Клеточный дебрис осаждали 20 мин при 15000 об/мин (~27000 g), а супернатант (лизат) использовали для выделения белков аффинной хроматографией на сорбенте «Ni-NTA Superflow» («Qiagen», США). Хроматографию проводили в аналогичном буфере, целевую фракцию белка элюировали буфером с добавлением имидазола до 250 мМ. Белки обессоливали методом диализа против стандартного фосфатно-солевого буфера рН 7,4-7,5 (ФСБ) и стерилизовали фильтрованием через поливинилиденфторидный фильтр с размером пор 0,22 мкм «Syringe-DivenFilters» («JetBiofilm», Корея). Качественный анализ белков проводили в 12%-м полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли.
Конъюгаты белков с флуоресцеинизотиоциа-натом (ФИТЦ) получали путем инкубации белков с ФИТЦ в течение ночи в карбонатном буфере рН 9,5 в соотношении 12,5 мкг ФИТЦ на 1 мг белка. Конъюгат от избытка метки отделяли с помощью гель-фильтрации. Образование конъ-югата подтверждали спектрофлуориметрически на наличие характерных для ФИТЦ пиков возбуждения (490 нм) и эмиссии (520 нм), а также в ПААГ. Концентрацию белков при X = 280 нм измеряли на спектрофотометре «Evolution 300» («ThermoFisher Scientific», США), флуо-риметрические измерения конъюгата «апо А -ФИТЦ» выполняли на спектрофлуорофотометре «RF-5301PC» («Shimadzu», Япония).
В качестве клеточной модели использовали трансформированные мышиные макрофаги линии RAW 264.7 и ее производный моноклон 8А3, стабильно экспрессирующий ген gfp (Евроген, Россия). Клетки выращивали в среде RPMI-1640 с глутамином (Биолот, Россия), рН 7,4, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки коров, 50 ЕД/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, в СО2-инкубаторе («Cole-Parmer», США) в атмосфере, содержащей 5 % СО2 и 95 % воздуха, при температуре 37 °С, используя 24-луночные планшеты («Orange Scientific», США). Клетки для пересева снимали с планшетов 0,25%-м раствором трипсина, жизнеспособность оценивали методом исключения трипанового синего, концентрацию рассчитывали в камере Горяева. Музейные образцы клеток хранили в жидком азоте
в среде RPMI-1640 с добавлением 40 % эмбриональной сыворотки коров и 10 % диметилсуль-фоксида.
Клетки инкубировали с комплексом «белок-ФИТЦ» в течение 18 ч, его концентрация составляла 5, 10 и 20 мкг/мл. Для визуального анализа флуоресценции использовали инвертированный флуоресцентный микроскоп «Axiovert 40 CFL» («Zeiss», Германия). Со смесью белков и миРНК клетки инкубировали в течение ~6 ч, меняли среду на свежую, инкубировали еще двое суток, дважды отмывали от среды ФСБ и исследовали на многофункциональном планшетном анализаторе «Varioskan Flash» («ThermoFisher Scientific» США), длинна волны возбуждения составляла 480 нм, испускания - 510 нм. Затем клетки снимали с планшета и рассчитывали их концентрацию. Исследование каждого образца повторяли не менее трех раз.
В работе использовали комплементарную пару олигорибонуклеотидов (по 22 ну-клеотида каждый), содержащие на 3'-концах по два дезокситимидиновых остатка: 5 '-CAAGCUGGAGAUCAAGUUCTT-3' и 3'-TTGU UCGACCUCUAGUUCAAG-5'. Данные нуклеотиды были синтезированы de novo на заказ (ЗАО «Биосан», г. Новосибирск), из них образовывали дуплекс путем эквивалентного смешения каждого олигорибонуклеотида с концентрацией 40 пмоль/мкл. В раствор дополнительно добавляли диэтилпирокарбонат до конечной концентрации 1 мкМ. Смесь инкубировали при 45-50 °С в течение 20 мин, охлаждали в ледяной бане, разливали в пробирки на мелкие порции и хранили при -70 °С. При работе с олигорибонукле-отидами использовали автоклавированную воду, предварительно очищенную с помощью системы «Merck Millipore» («Merck KGaA», Германия), а также наконечники для дозаторов и пробирки с маркировкой об отсутствии РНКаз («Axygen», США).
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (m), и представляли в виде M ± m. Различия между группами оценивали с помощью критерия Стьюдента, достоверными считались результаты при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Рекомбинантные белки про-апо А-I (далее по тексту апо А) и апо АК10 получали из соответствующих клеток-продуцентов E. coli, сконструированных нами ранее [3]. Белок про-апо А-I на N-конце содержал 6 а.о., характерных для про-
формы белка апо А - RHFWQQ, а на С-конце -8 а.о. гистидина. Белок апо АК10, в дополнение к указанным остаткам, между собственно белком апо А-I и 8 а.о. гистидина содержал фрагмент, несущий 10 а.о. лизина - LDGPAKKKKKLKKKKK. Схематичная структура белка апо АК10 имела следующий вид: N'-RHFWQQ-структура апоА-I зрелой формы-LDGPAKKKKKLKKKKK-HHHH НННН-С'. Выход рекомбинантных белков апо А и апо АК10 составил около 25-30 мг/л культуры клеток продуцентов.
За основу модели клеток млекопитающих была выбрана мышиная клеточная макрофагаль-ная линии RAW 264.7. Из литературы известно, что на макрофагах имеются рецепторы к апо А-I. Исходя из этого, мы предположили, что клетки линии RAW 264.7 также будут способны к рецеп-торно-опосредованному поглощению комплексов «апо АК10-миРНК». Для проверки этого предположения были получены конъюгаты рекомбинантного апо А и апо АК10 с флуоресцирующим красителем ФИТЦ и изучено их проникновение в клетки линии RAW 264.7. Клетки инкубировали с конъюгатами в течение ~18 ч, после чего дважды отмывали ФСБ и анализировали на инвертированном флуоресцентном микроскопе. Светящиеся клетки интерпретировали как поглотившие конъюгат. Типичный пример результатов инкубирования клеток линии RAW 264.7 и конъюгата «апо АК10-ФИТЦ» представлен на рис. 1.
Наибольшее количество светящихся клеток обнаруживалось при максимальной исследуемой концентрации конъюгата 20 мкг/мл и составляло около одной четверти от их общего числа. При этом количество светящихся клеток при исполь-
Рис. 1. Микроскопия клеток RAW 264.7, инкубированных с конъюгатом «апо АК10-ФИТЦ», в флуоресцентном режиме (х 40)
Клетки
Рис. 2. Интенсивность флуоресценции клеток 8А3. Клетки - контрольные клетки, интенсивность их флуоресценции принята за 100 %; РНК - клетки, инкубированные с миРНК; Lip. - клетки, инкубированные с липофектамином 2000; L-Р - клетки, инкубированные со смесью липофектамина 2000 и миРНК; Р : Б - клетки, инкубированные со смесью миРНК и апо АК10 при различных молярных соотношениях, от 1 : 1 до 1 : 8 (столбцы 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4 и 1 : 8) либо в отсутствие миРНК (столбцы 0 : 1, 0 : 2, 0 : 4, 0 : 8); * - отличие от интенсивности флуоресценции контрольных клеток и клеток, инкубированных с миРНК, статистически значимо при p < 0,05
зовании конъюгатов из рекомбинантного апо А и модифицированного белка апо АК10 было примерно одинаковым. Полученные результаты с конъюгатами позволили предполагать, что клетки будут способны также поглощать и немечен-ный белок апо АК10 и будут пригодны в качестве модели для изучения апо АК10 в качестве переносчика миРНК.
На основе клеток RAW 264.7 фирмой «Евро-ген» с помощью лентивирусного вектора pCD-TagGFP2-Puro получена моноклональная клеточная линия 8А3, стабильно экспрессирующая ген gfp [4] и использованная нами для изучения РНК-интерференции. В качестве олигонуклеоти-дов миРНК применялась пара олигонуклеотидов, описанная в работе [4]. Олигонуклеотиды были синтезированы de novo, из них образовывался дуплекс путем эквивалентного смешения, как описано в разделе «Материал и методы», который использовался в экспериментах по подавлению флуоресценции клеток с помощью рекомбинант-ного апо А, апо АК10 и липофектамина 2000. Дуплекс инкубировали с белками при комнатной температуре в течение 20 минут и затем добавляли к клеткам моноклона 8А3. миРНК вносили в количестве 20 пмоль на лунку, поскольку в серии предварительных экспериментов установили, что оно является оптимальным при транс-фекции липофектамином 2000. Молярные соотношения миРНК/белок были следующими: 1 : 1 (20 пмоль/0,665 мкг), 1 : 2 (20 пмоль/1,33 мкг),
1 : 4 (20 пмоль/2,66 мкг) и 1 : 8 (20 пмоль/5,32 мкг). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, инкубированные с миРНК (20 пмоль), и клетки, инкубированные только с белком в аналогичных количествах, в качестве положительного контроля - клетки, инкубированные со смесью миРНК и липофектамина 2000 (20 пмоль/2 мкл). Инкубирование длилось ~6 ч, после чего среду меняли на свежую, не содержащую трансфици-рующих реагентов, и через ~40 ч после клетки промывали дважды буфером ФСБ, определяли их флуоресценцию, после чего снимали клетки с планшетов и измеряли их концентрацию. Флуоресценцию контрольных клеток принимали за 100 %, данные образцов были пересчитаны на флуоресценцию 200 000 клеток.
На диаграмме с результатами анализа (рис. 2) представлены только те клетки, на которых исследовалось их инкубирование с апо АК10. Статистически значимое снижение интенсивности флуоресценции клеток, которое наблюдалось только в образцах, инкубированных со смесью миРНК и липофектамина 2000, составило 62,3 ± 5,4 % от уровня флуоресценции контрольных клеток. Выраженность уменьшения интенсивности флуоресценции GFP соответствовала литературным данным, согласно которым при использовании данной пары олигонуклеотидов на клетках различного типа уровень флуоресценции снижался до 50-90 % [13]. Это подтверждает корректность подобранной нами пары олигорибо-
нуклеотидов для изучения РНК-интерференции на клетках RAW 264.7 линии 8А3. В клетках, инкубированных со смесью миРНК и рекомби-нантных апо А и апо АК10, даже в соотношениях с максимальным количеством белка (миРНК/ белок = 20 пмоль/5,32 мкг) интенсивность флуоресценции была такой же, как в контрольных клетках и инкубированных только с миРНК. Эти результаты говорят о том, что на данной модели апо АК10 не способствовал РНК-интерференции.
Полученные результаты можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, несмотря на то, что апо АК10 способен взаимодействовать с фрагментами ДНК размером 5000-1000 п.н., нет полной уверенности, что белок специфически связывался с дуплексом малой РНК размером 22 п.н. и, соответственно, образовывал стабильные комплексы. Во-вторых, при проникновении комплекса «белок - нуклеиновая кислота» в клетку он в первую очередь оказывается в эн-досомах, внутренняя среда которых постепенно закисляется [2, 6], что приводит к деградации нуклеиновой кислоты. Поэтому, если белок не обладает каким-либо защитным средством, как правило, это может быть фьюзогенный мотив, способствующий высвобождению комплексов из эндосом, нуклеиновая кислота в составе комплекса неспецифически гидролизуется и далее не способна выполнять свои функции. В используемых нами переносчиках - рекомбинантном апо А и апо АК10 - такие фьюзогенные мотивы отсутствуют, что могло быть одной из причин отрицательных результатов РНК-интерференции. В-третьих, хотя нами и продемонстрировано, что апо АК10 способен защищать плазмидную ДНК от гидролиза эндонуклеазами рестрикции на примере Hinf I [1], белок мог недостаточно защищать дуплекс РНК от нуклеаз, присутствующих в куль-туральной среде за счет добавления эмбриональной сыворотки коров. Это также могло приводить к гидролизу дуплекса РНК, а соответственно, и к отсутствию эффекта снижения флуоресценции в опытных клетках.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Как рекомбинантный белок про-апо А-I человека, так и его модифицированная форма апо АК10 проникают в трансформированные мышиные макрофаги линии RAW 264.7, однако в комплексе с миРНК они не способствуют снижению флуоресценции клеток. Вероятной причиной этого является отсутствие специфического взаимодействия апо А с миРНК, а также недостаточная защищенность миРНК в комплексе с белком от нуклеаз и эндосом клетки.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Спектрометрические измерения» (НИИ биохимии ФИЦ ФТМ) и ЦКП «Современные оптические системы» (НИИ экспериментальной и клинической медицины ФИЦ ФТМ).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Котова М.В., Рябченко А.В., Трифонова Н.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Получение модифицированного рекомбинантного аполипопротеина А-I для переноса нуклеиновых кислот // Междунар. журн. прикл. и фундам. исслед. 2017. (12-2). 317-321.
2. Розенкранц А.А., Уласов А.В., Сластнико-ва Т.А., Храмцов Ю.В., Соболев А.С. Использование процессов внутриклеточного транспорта для доставки лекарств в заданный компартмент клетки // Биохимия. 2014. 79. (9). 1148-1168.
3. Рябченко А.В., КотоваМ.В., Трифонова Н.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Изучение рекомбинантного аполипопротеина А-I как переносчика плаз-мидных ДНК на модели гепатоцитов крыс // Сиб. науч. мед. журн. 2017. 37. (6). 10-15.
4. Рябченко А.В., КотоваМ.В., Трифонова Н.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Изучение аполипопротеина А-I как переносчика малых интерферирующих РНК // Междунар. журн. прикл. и фундам. исслед. 2017. (12-1). 123-127.
5. Canine B.F., Hatefi A. Development of recombinant cationic polymers for gene therapy research // Adv. Drug Deliv. Rev. 2010. 62. (15). 15241529.
6. Canine B.F., Wang Y., Ouyang W., Hatefi A. Development of targeted recombinant polymers that can deliver siRNA to the cytoplasm and plasmid DNA to the cell nucleus // J. Control. Release. 2011. 151. (1). 95-101.
7. Danielle L.M., Kasey C.V. Lipoprotein carriers of microRNAs // Biochim. Biophys. Acta. 2016. 1861. (12). 2069-2074.
8. Farve G., Tazi K., Le G., Bennis F., Hachem H., Soula G. High density lipoprotein3 bindings sites are related to DNA biosynthesis in the adenocarcinoma cell line A549 // J. Lipid. Res. 1993. 34. (7). 1093-1106.
9. Kim S.I., Shin D., Lee H., Ahn B.Y., Yoon Y., Kim M. Targeted delivery of siRNA against hepatitis C virus by apolipoprotein A-I bound cationic liposomes // J. Hepatol. 2009. 50. (3). 479-488.
Kratzer I., Werning K., Panzenboeck U., Bernhart E., Reicher H., Wronski R., Windisch M., Hammer A., Malle E., Zimmer A., Sattler W. Apolipoprotein A-I coating of protamine-oligonucleotide nanoparticles increases particle uptake and transcytosis in an in vitro model of the blood-brain barrier // J. Control. Release. 2007. 117. (3). 301-311.
11. Lee H, Kim S.I., Shin D, Yoon Y., Choi T.H., Cheon G.J., Kim M. Hepatic siRNA delivery using recombinant human apolipoprotein A-I in mice // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. 378. (2). 192-196.
12. Tabet F., Vickers K.C., Cuesta Torres L.F., Wiese C.B., Shoucri B.M., Lambert G., Catherinet C., Prado-Lourenco L., Levin M.G., Thacker S.,
Sethupathy P., Barter P.J, Remaley A.T., Rye K.A. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells // Nat. Commun. 2014. 5. 3292.
13. Tschuch C., Schulz A., Pscherer A., Werft W., Benner A., Hotz-Wagenblatt A., Barrionuevo L.S., Lichter P., Mertens D. Off-target effects of siRNA specific for GFP // BMC Mol. Biol. 2008. 9. 60.
STUDY OF MODIFIED RECOMBINANT APOLIPOPROTEIN A-I AS A CARRIER OF SMALL INTERFERRING RNA
Aleksandr Vladimirovich RYABCHENKO, Mariya Vladimirovna KOTOVA, Roman Aleksandrovich KNYAZEV, Nataliya Viktorovna TRIFONOVA, Lev Mikhaylovich POLYAKOV
Research Institute of Biochemistry, Federal Research Center for Fundamental and Translational Medicine 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
With the widespread development of the phenomenon of RNA interference, currently, researchers are puzzled to obtain effective carriers of small interfering RNA (siRNA). Previously, we obtained a modified recombinant polypeptide based on human apolipoprotein A-1 (apoA-I), capable of binding to plasmid DNA. The aim of the investigation was to study the possibilities of modified recombinant proteins of apolipoprotein A-I to transfer siRNA into tumor cells. Material and methods. The studies were performed on a model of transformed macrophages of mice RAW 264.7 that stably expressed the green fluorescent protein (GFP) gene (line of clone 8A3). Recombinant pro-apo A-I, its modified analog, carrying at the C-terminus of 10 amino acid residues of lysine (apo AK10), and Lipofectamine 2000 transfection reagent were studied as siRNA carriers. Proteins were obtained from the corresponding E. coli producer strains. The transfer object was a siRNA duplex, in which one nucleotide was complementary to the matrix RNA of GFP gene. Cell fluorescence was measured on the second day using a fluorescent plate analyzer. Results and discussion. The results of the study showed that proteins pro-apoA and apoAK10 labeled with fluorescein isothiocyanate penetrate the RAW 264.7 cells. The results of the study RNA interference showed that the incubation of cells with a mixture of miRNA and Lipofectamine 2000 caused a decrease in the fluorescence of the 8A3 cell lines, which indicates a correct selection of siRNA to the matrix RNA of the gfp gene. However, when 8A3 cells were incubated with a mixture of miRNA and recombinant pro-apo A-I and apo AK10, a decrease in fluorescence relative to the control cells incubated only with miRNA was not observed. Conclusion. It was shown that both the recombinant protein pro-apo A-I and the modified apoAK10 penetrate the transformed mouse macrophages of the line RAW264.7, but do not promote RNA interference in these cells.
Key words: apolipoprotein A-I, recombinant protein, pro-apo A-I, pro AK10, RNA interference, siRNA, RAW264.7 macrophages.
Ryabchenko A.V. - candidate of biological sciences, senior researcher, e-mail borrelia@mail.ru Kotova M.V. - junior researcher, e-mail zerokiri@mail.ru
Knyazev R.A. - candidate of biological sciences, senior researcher, e-mail Knjazev_roman@mail.ru Trifonova N.V. - junior researcher, e-mail nataliya-tverdohleb@yandex.ru
Polyakov L.M. - doctor of medical sciences, professor, head of the laboratory, e-mail plm@niibch.ru
