CC BY
78
УДК: 575.113: 577.112.384.2/.4: 579.842.11
КОНСТРУИРОВАНИЕ СУПЕРПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНОГО АПОЛИПОПРОТЕИНА А-I ЧЕЛОВЕКА НА ОСНОВЕ КЛЕТОК ESCHERICHIA СОИ
Александр Владимирович РЯБЧЕНКО, Мария Владимировна КОТОВА, Лев Михайлович ПОЛЯКОВ
ФГБНУ Научно-исследовательский институт биохимии 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
В работе представлены материалы по получению химерного рекомбинантного полипептида в клетках Escherichia coli и превращению его в зрелую форму аполипопротеина А-I человека. В гене аполипопротеина А-I кодон, кодирующий во второй позиции белка глутаминовую аминокислоту, был заменен на кодон аспарагиновой аминокислоты, это позволило отщеплять лидерную последовательность химерного полипептида методом кислотного гидролиза. Кодоны рекомбинантной ДНК были оптимизированы для экспрессии в клетках E. coli, в результате выход химерного полипептида из культуры клеток в среднем составил около 200 мг/л.
Ключевые слова: аполипопротеин А-I, рекомбинантный белок, E. coli.
В последнее десятилетие аполипопротеин А-I (апо А-I) вызывает широкий интерес исследователей всего мира, что связано, прежде всего, с перспективами его использования при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, в частности атеросклероза [3]. В связи с этим получение белка апо А-I в препаративных количествах, а затем и в промышленных масштабах с целью дальнейшего использования имеет практическое значение. Классические методы получения апо А-I основаны на выделении белка из сыворотки крови. Однако по понятным этическим причинам этот источник белка не может быть использован в промышленных масштабах. С развитием технологий рекомбинантных ДНК появились системы для получения рекомбинантного белка апо А-I в клетках бактерий [7], дрожжей [8] насекомых и млекопитающих (клетки яичников китайского хомячка) [9]. Общим недостатком вышеупомянутых систем является низкий выход рекомбинантного апо А-I. Наибольший выход белка 100 мг/мл был достигнут в работе [11], где в качестве продуцентов использовались клетки Escherichia coli; кодоны гена были модифицированы с целью введения в него сайтов эндонуклеаз рестрикции, а белок был получен в виде химерного полипептида с ли-дерной последовательностью из 6 аминокислотных остатков (а.о.) гистидина. Мы предположили, что если оптимизация кодонов для экспрессии
гена в клетках E. coli будет нести целенаправленный характер, то уровень синтеза белка в клетках должен увеличиться. Целью настоящей работы являлись конструирование суперпродуцента ре-комбинантного апо А-I человека на основе клеток E. coli и оптимизация условий получения реком-бинантного белка.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
При конструировании модели рекомбинант-ной ДНК за основу была взята структура гена зрелой формы апо А-I человека (gi4557320 в базе данных National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ 4557320). Анализ частоты встречаемости редких кодонов в геноме E. coli проводили с помощью программы интернет-ресурса «Классической и молекулярной биологии» (http://molbiol.ru/ scripts/01_11.html). Рекомбинантная ДНК, кодирующая химерный полипептид (Хапо А), размером 852 пар нуклеотидов, была синтезирована из нуклеотидов по принципу «de novo» фирмой «АТГ Сервис Ген» (Россия) и получена в составе плазмиды pBluescript. Для экспрессии гена Хапо А рекомбинантную ДНК встраивали в модифицированный вектор pET36b(+) «Novagen» (США), полученный нами ранее [6].
Рябченко А.В. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, e-mail: borrelia@mail.ru
Котова М.В. - аспирант лаборатории медицинской биотехнологии, e-mail: zerokiri@mail.ru Поляков Л.М. - зав. лабораторией медицинской биотехнологии, e-mail: plm@niibch.ru
Трансформацию клеток E. coli проводили общеизвестным химическим методом с использованием хлорида кальция. Клетки выращивали на агаризованной среде LB (lysogeny broth), содержащей соответствующий антибиотик. Для наработки плазмидных ДНК использовали E. coli шт. NovaXGF «Novagen» (США). Плазмиды выделяли набором «Plasmid Maxiprep» «Евроген» (Россия), анализ проводили электрофоретически в 0,8 % геле агарозы с окрашиванием ДНК бромистым этидием.
Плазмиды гидролизировали эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI согласно инструкции фирмы-производителя ферментов «СибЭнзим» (Россия). Фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле с последующим извлечением нужного фрагмента из геля набором «Cleanup Standard» «Евроген» (Россия). Фрагменты ДНК лигировали с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы согласно инструкции фирмы-производителя «СибЭнзим» (Россия). Подтверждение корректности структуры рекомбинантной ДНК, в составе экспрессирующего вектора, проводили с помощью секвенирования соответствующего района плазмиды в ЦКП «Геномика» СО РАН (Россия).
Для экспрессии гена Хапо А использовали клетки E. coli шт. BL21(DE3). Из отобранного клона E. coli выращивали ночную культуру в среде LB объемом 5 мл при 37 °С. На следующий день ночную культуру переносили в двухлитровую колбу с 500 мл свежей среды LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина. Клетки выращивали при активном перемешивании и 37 °С до оптической плотности D600 = 0,8-1,2 о.е. Для анализа отбирали пробу (контроль) и добавляли индуктор -изопропил^^-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до 50 мкМ. Далее клетки инкубировали 4 ч при аналогичных условиях либо 18 ч при 30 °С. По окончании инкубации отбирали пробу для анализа (опытный образец), оптическая плотность клеток достигала D600 = 5,0-6,0 о.е. Клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, осадок замораживали и хранили до выделения белка. Клеточные лизаты и белки анализировали в 12%-м полиакриламидном геле по Лэммли.
Для выделения Хапо А клетки разрушали обработкой ультразвуком (УЗГ 13-0,1/22, ФГУП «ВНИИТВЧ», Россия) в присутствии 6 М гуани-дин-гидрохлорида. Выделение и очистку белка Хапо А из клеточного лизата проводили с помощью одностадийной аффинной хроматографии лизата клеток на колонке со смолой «Ni-NTA-Superflow» в денатурирующих условиях,
в присутствии 6 М мочевины. За основу метода был взят протокол фирмы-производителя смолы «Quiagen» (США). Концентрацию белка измеряли спектрофотометрически при X = 280 нм.
Для получения зрелой формы белка апо А-I (Рапо А) химерный полипептид обессоливали методом диализа в фосфатно-солевом буфере -ФСБ (на 10 мл раствора белка 1 л буфера). После диализа к суспензии белка в соответствии с условиями, описанными в работе [11], добавляли муравьиную кислоту до конечной концентрации 45 %. Раствор белка выдерживали при 55 оС в течение 4 ч при периодическом перемешивании, после чего белок снова обессоливали диализом в ФСБ, затем осаждали центрифугированием (30 мин при 27000 g) после предварительного добавления сульфата аммония до 40%-го насыщения. Осадок растворяли в ФСБ, содержащем 6 М мочевину (объем буфера составлял половину от исходного объема белка). Рекомбинантный апо А отделяли от продуктов неполного гидролиза с помощью аффинной хроматографии в денатурирующих условиях на смоле «Ni-NTA-Superflow». Фракцию, содержащую Рапо А, разбавляли до 1 о.е./мл буфером, содержащим 6М мочевину, и обессоливали диализом в ФСБ. Далее Рапо А очищали от эндотоксинов с помощью смолы «Pierce High Capacity Endotoxin Removal Resin» («Thermo Fisher Scientific», США) согласно протоколу фирмы-производителя смолы. На заключительном этапе раствор белка обессоливали диализом в ФСБ и стерилизовали фильтрованием через фильтр с размером пор 0,22 мкм «Syringe-Diven Filters» («Jet Biofilm», Корея). Стерильный чистый Рапо А хранили при 4 оС либо замораживали.
В случае ферментативного гидролиза Хапо А (отщепление лидерной последовательности) реакцию проводили при комнатной температуре в буфере со следующим составом: 50 мМ трис(гидроксиметил)аминометан, 0,5 мМ эти-лендиаминтетрауксусная кислота, 1 мМ ди-тиотреитол, рН составлял 8,0. Отношение фермент:субстрат (в молях) варьировалось в пределах от 1:5 до 1:80, время реакции составляло 18 ч. В качестве фермента использовали проте-азу вируса табачной мозаики (tobacco etch virus (TEV) protease), «Sigma-Aldrich», кат. № T4455 (США).
Выделение и очистку нативного апо А-I из плазмы крови человека проводили по методике, описанной в работе [4].
В работе количество выделяемого белка представлено как среднее значение величины ± ошибка средней величины (n - количество опытов).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
С целью оптимизации кодонов для экспрессии в клетках E. coli в структуру гена апо А-I (gi4557320) был внесен ряд мутаций: 33 синонимические замены кодонов (см. таблицу), были заменены все кодоны с частотой менее 11/1000 (за исключением 1 а.о. гистидина - частота осталась 8,8/1000). Кроме того, была сделана замена кодона, кодирующего во второй позиции зрелого белка апо А-I глутаминовую аминокислоту,
Таблица
Сравнение кодонов гена зрелой формы белка апо А-I человека (gi4557320 - «дикий тип») и генаХапоА
№ Позиция а.о. а.о. Кодоны гена «дикого типа» Кодоны гена Хапо А
1 2 Glu2Asp GAA - 37.9 GAT - 32.9
2 3 Pro CCC - 5.6 CCG - 19.3
3 4 Pro CCC - 5.6 CCG - 19.3
4 7 Pro CCC - 5.6 CCG - 19.3
5 10 Arg CGA - 4.1 CGC - 18.3
6 22 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
7 27 Arg AGA - 4.5 CGC - 18.3
8 31 Ser TCC - 9.3 AGC - 15.0
9 36 Ser TCC - 9.3 AGC - 15.0
10 39 Gly GGA - 10.7 GGC - 25.5
11 42 Leu CTA - 4.5 CTG - 45.8
12 44 Leu CTA - 4.5 CTT - 12.6
13 46 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
14 55 Ser TCC - 9.3 AGC - 15.0
15 64 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
16 66 Pro CCT - 8.0 CCG - 19.3
17 79 Thr ACA - 10.8 ACC - 21.3
18 83 Arg AGG - 2.6 CGC - 18.3
19 99 Pro CCC - 5.6 CCG - 19.3
20 114 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
21 126 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
22 143 Pro CCA - 8.7 CCG - 19.3
23 165 Pro CCC - 5.6 CCG - 19.3
24 181 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
25 188 Arg AGA - 4.5 CGC - 18.3
26 193 His CAC - 8.8 CAT - 12.5
27 203 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
28 209 Pro CCC - 5.6 CCG - 19.3
29 211 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
30 214 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
31 220 Pro CCC - 5.6 CCG - 19.3
32 233 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
33 234 Glu GAG - 18.8 GAA - 37.9
34 240 Leu CTC - 10.1 CTG - 45.8
Примечание. В таблице указаны только те кодоны, которые были изменены относительно гена «дикого типа». Позиция аминокислоты обозначает позицию аминокислоты в зрелой форме белка. Частота встречаемости кодонов приведена на 1000 кодонов для генома E. coli.
на аспарагиновую (Glu2Asp). Замена Glu2Asp привела к возникновению в конечной структуре Хапо А неустойчивого к кислотам дипептида AspPro (2-3 а.о. в структуре зрелого белка апо А-I), что в последующем позволяло отщеплять «ли-дерную последовательность» с помощью кислотного гидролиза.
Для эффективной экспрессии гена химерного белка и его последующей очистки к гену с 5'-конца были добавлены фрагменты ДНК, кодирующие «лидерную последовательность»: 6 а.о. гистидина; 6 а.о. проформы человеческого апо А-I; 15 а.о. бычьей панкреатической РНКазы А (S-tag); 6 а.о. проформы человеческого апо А-I (повтор фрагмента); 7 а.о. сайта узнавания про-теазы вируса табачной мозаики (ENLYFQ/G). Включение проформы человеческого апо А-I обусловлено влиянием на уровень экспрессии гена в целом, в литературе показано, что его отсутствие на порядок уменьшает выход конечного рекомбинантного белка [10]. Проформа апо А-I была повторно вставлена для увеличения молекулярной массы Хапо А и облегчения идентификации белков Хапо А и Рапо А при анализе в по-лиакриламидном геле. Для этого же в структуру был введен фрагмент бычьей панкреатической РНКазы А. Сайт узнавания протеазы вируса табачной мозаики был добавлен с целью последующего отщепления лидерной последовательности аналогично работе [12]. На заключительном этапе планирования к модели рекомбинантной ДНК с 5'-конца был добавлен сайт эндонуклеазы рестрикции NdeI, а с 3'-конца - стоп-кодон ТАА и сайт XhoI.
В результате экспрессии гена Хапо А в составе модифицированного экспрессирующего вектора pET36b(+) в клетках E. coli шт. BL21(DE3) был получен белок Хапо А с молекулярной массой ~ 33,4 кДа (рис. 1, дорожка 2). Выход Хапо А из биомассы, полученной индукцией клеток в течение 4 ч при 37 °С и концентрации индуктора 50 мкМ, составил 140 ± 20 мг/л культуры клеток (n = 3) (рис. 1, дорожка 3). Полученное количество белка на 40 % превышало результаты, представленные в работе [11], в которой авторы использовали аналогичную экспрессирующую систему (клетки E. coli шт. BL21(DE3), ген апо А-I под контролем промотора гена 10 бактериофага Т7) и хромато-графический способ очистки белка на аффинном сорбенте в денатурирующих условиях.
Следует также отметить, что ранее в данной системе (вектор pET36b(+) и клетки E. coli шт. BL21(DE3) или Rosetta 2), без предварительной оптимизации кодонов, нами был получен ряд ге-терологичных для E. coli белков [1, 2, 6], в том числе человеческий тропонин Т и белок кардио-
Рис. 1. Фрагмент электрофореграммы белковых образцов на различных стадиях получения белка Рапо А. Дорожки: 1 - лизат клеток-продуцентов, инкубированных без добавления индуктора (контроль); 2 - лизат клеток-продуцентов, инкубированных с 50 мкМ индуктора (биомасса для выделения белка); 3 - очищенный белок Хапо А (~ 33,4 кДа); 4 - продукты кислотного гидролиза Хапо А; 5 - продукты кислотного гидролиза Хапо А после извлечения Рапо А; 6 - очищенный белок Рапо А (~ 28 кДа); 7 - на-тивный апо А-I, выделенный из плазмы крови человека (~ 28 кДа); 8 - маркерные белки (10, 20, 25, 30, 40, 50, 60 и 80 кДа; «Сибэнзим», Россия)
миоцитов человека, связывающий жирные кислоты [5], выход рекомбинантных белков варьировал в пределах 20-50 мг/л. Мы предполагаем, что высокий выход Хапо А в настоящей работе достигнут за счет оптимизации кодонов гена апо А-I для экспрессии в клетках E. coli.
Следующей задачей исследования стала оптимизация методов культивирования и индукции экспрессии гена Хапо А. Результаты определения зависимости уровня экспрессии гена Хапо А от концентрации индуктора ИПТГ показали, что при индукции в течение 4 ч при 37 оС максимальный уровень экспрессии достигался уже при концентрации 20-25 мкМ (рис. 2, дорожка 7). При увеличении концентрации индуктора до 1000 мкМ (1 мМ) уровень экспрессии не изменялся. Сравнения также проводились и при выделении белка из биомасс, полученных с различной концентрацией ИПТ Г. Такое снижение концентрации индуктора, почти в 20 раз по сравнению с работами [9, 11], как и высокий выход рекомбинантного белка, вероятно, объясняется оптимизацией кодонов в структуре гена апо А-I для экспрессии в клетках E. coli.
При изучении зависимости уровня экспрессии гена Хапо А от времени инкубации кле-
Рис. 2. Фрагмент электрофореграммы лизатов клеток-продуцентов Хапо А, предварительно инкубированных с различной концентрацией индуктора. Дорожки: 1 - очищенный Хапо А; 2 - лизат неиндуцированных клеток (контроль); 3-8 - лизаты клеток с добавлением индуктора в концентрации 0,05, 0,2, 1,0, 5,0, 20 и 100 мкМ соответственно
ток (концентрация ИПТГ 20 мкМ, температура 37 °С) установлено, что максимальный уровень экспрессии наблюдается уже через 3-4 ч (анализ клеточных лизатов не приводится).
Из литературных данных известно, что при экспрессии апо А-I в клетках E. coli белок накапливается в основном в тельцах включения [9, 11], поэтому для оптимизации мы использовали прием с увеличением времени инкубации клеток-продуцентов до 18 ч и понижением температуры до 30 °С. В этих условиях (50 мкМ ИПТГ) выход Хапо А достигал 270 мг и в среднем составил 202 ± 40 мг/л культуры клеток (n = 6), или 40,0 ± 7,5 мг из 1 г влажной биомассы. Вероятно, в этих условиях белок в основном локализовался в цитоплазме, что приводило к большому накоплению его в клетках.
Выход очищенного Рапо А, полученного с помощью кислотного гидролиза (рис. 1, дорожки 4-6), составлял 37 ± 1,7 мг из 100 мг исходного Хапо А (n = 3). Полученный белок с молекулярной массой ~28 кДа не имел двух аминокислотных остатков с N-конца (аспарагиновая и глутамино-вая кислоты), в остальном по первичной структуре он был идентичен зрелому белку апо А-I человека и при анализе в ПААГ показывал сходную подвижность (рис. 1, дорожки 6 и 7).
При получении Рапо А из Хапо А с помощью ферментативного гидролиза выход Рапо А имел низкое значение (данные не приведены). Мы наблюдали низкую степень гидролиза Хапо А даже при длительной инкубации реакционной смеси и высоком молярном отношении фермент:субстрат, равном 1:5. Следует заметить, что в работе [12]
гидролиз наблюдался уже после 30 мин инкубации при комнатной температуре. Мы предполагаем, что полученный нами Хапо А имеет сте-рическое препятствие для посадки фермента, в отличие от работы с аналогичной конструкцией [12]. Возможно, это было обусловлено повторным введением профрагмента апо А-I в структуру белка.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате выполненной работы на основе клеток E. coli шт. BL21(DE3) получен продуцент рекомбинантного химерного белка аполипопротеина А-I человека с высоким выходом белка -202 ± 40 мг/л. Данный результат достигнут за счет оптимизации кодонов гена апо А-I для экспрессии в клетках E. coli. Оптимальными условиями культивирования клеток-продуцентов были следующие: выращивание клеток до логарифмической фазы роста, добавление индуктора до концентрации 50 мкМ и последующая инкубация клеток в течение 18 ч при 30 °С. В результате кислотного гидролиза химерного рекомбинантного белка может быть получен апо А-I человека зрелой формы в количестве 37 ± 2 мг из 100 мг исходного белка.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Караваев В.С., Рябченко А.В., БеклемишевА.Б. Иммунохимический анализ рекомбинантного белка FlaA западно-сибирского изолята Borrelia garinii II Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. (4). 66-71.
2. Караваев В.С., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Оценка значимости рекомбинантного белка DbpB спирохет Borrelia garinii для серодиагностики Лайм-боррелиоза II Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2013. (3). 73-79.
3. Поляков Л.М., Панин Л.Е. Липопротеины высокой плотности и аполипопротеин А-I: регу-
ляторная роль и новые терапевтические стратегии лечения атеросклероза II Атеросклероз. 2013. 9. (1). 42-53.
4. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Князев Р.А., Панин Л.Е. Анализ взаимодействия липопротеинов и стероидных гормонов II Биомед. химия. 2011. 57. (3). 308-313.
5. Рябченко А.В., Афиногенова Г.Н., Беклемишев А.Б. Получение рекомбинантных белков - кар-диомаркеров острого инфаркта миокарда II Кардиология на перекрестке наук: сб. науч. ст. II Междунар. конгр. Тюмень, 2011. 280-281.
6. Рябченко А.В., Караваев В.С., Беклемишев А.Б. Сравнительный структурный и иммунохимический анализ рекомбинантных антигенов OspC новосибирских изолятов спирохет Borrelia garinii и Borrelia afzelii II Бюл. СО РАМН. 2010. (2). 6-12.
7. Bergeron J., Frank P.G., Emmanuel F. et al. Characterization of human apolipoprotein A-I expressed in Escherichia coli II Biochim. Biophys. Acta. 1997. 1344. (7). 139-152.
8. FengM.Q., Cai Q.S., Song D.X. et al. High yield and secretion of recombinant human apolipoprotein AI in Pichia pastoris II Protein Expr. Purif. 2006. 46. (2). 337-342.
9. Panagotopulos S.E., Witting S.R., Horace E.M. et al. Bacterial expression and characterization of mature apolipoprotein A-I II Protein Expr. Purif. 2002. 25. (2) 353-361.
10. Pyle L.E., Fidge N.H., Barton P.A., Luong A., Sviridov D. Production of mature human apolipoprotein A-I in a baculovirus-insect cell system: propeptide is not essential for intracellular processing but may assist rapid secretion II Anal. Biochem. 1997. 253. (2). 253258.
11. Ryan R.O., Forte T.M., Oda M.N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I II Protein Expr. Purif. 2003. 27. (1). 98-103.
12. Tubb M.R., Smith L.E., Davidson W.S. Purification of recombinant apolipoproteins A-I and A-IV and efficient affinity tag cleavage by tobacco etch virus protease II J. Lipid Res. 2009. 50. (7). 14971504.
DESIGNING SUPERPRODUCER OF RECOMBINANT HUMAN APOLIPOPROTEIN A-I BASED ON ESCHERICHIA COLI CELLS
Aleksandr Vladimirovich RYABCHENKO, Mariya Vladimirovna KOTOVA, Lev Mikhaylovich POLYAKOV
Research Institute of Biochemistry 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2.
This article presents materials on the production of a chimeric recombinant polypeptide in E. coli cells and its transformation into a mature form of human apolipoprotein A-I. Glu2Asp mutation was introduced into the gene apolipoprotein A-I, it is allowed to cleave the leader sequence of the chimeric polypeptide by acid hydrolysis. Codons of recombinant DNA were optimized for expression in E. coli, resulting in the output of the chimeric polypeptide from the cell culture averaged 200 mg/l.
Key words: apolipoprotein A-I, recombinant protein, E. coli.
Ryabchenko A.V. - candidate of biological sciences, senior researcher, laboratory of medical biotechnology, e-mail: borrelia@mail.ru
Kotova M.V. - postgraduate student, laboratory of medical biotechnology, e-mail: zerokiri@mail.ru Polyakov L.M. - head of the laboratory of medical biotechnology, e-mail: plm@niibch.ru
