CC BY
86
С.А. Деркачёва, В.И. Ткаченко, А.Б. Беклемишев
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА Р38
М. TUBERCULOSIS И ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ
ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ В СЕРОДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, г. Новосибирск
Целью настоящей работы было получение рекомбинантного белка р38 М. tuberculosis и ouei ка возможности использования его в серодиагностике туберкулеза. Мы сконструировали р комбинантный штамм E. coli, продуцирующий химерный белок (гР38), содержащий в C-koi цевой области аминокислотную последовательность зрелого антигена р38 М. tuberculosa Антигенные свойства рекомбинантного химерного белка были исследованы методом тверд! фазного иммуноферментного анализа на панели 106 сывороток, полученных от здоровых д< норов и от больных туберкулезом (ТВ). Было показано, что рекомбинантный антиген rPí связывается с IgG 84,7% сывороток больных ТБ. Кроме того, было обнаружено присутств! антител к р38 М. tuberculosis с высоким титром как в сыворотках крови больных ТБ, проше; ших и не прошедших курс лечения, так и в сыворотках крови клинически излеченных пац! ентов. Таким образом, рекомбинантный химерный антиген гР38 может быть использова наряду с другими рекомбинантными антигенами, специфичными для М. tuberculosis, дл конструирования на его основе тест-системы для серодиагностики туберкулеза.
Ключевые слова: М. tuberculosis, клонирование, рекомбинантный антиген, р38, ИФА, сер< диагностика, туберкулез
Введение
Туберкулез (ТВ) занимает лидирующее положение в заболеваемости и смертности от этой инфекции среди людей во всем мире. Каждый третий человек в мире инфицирован возбудителями ТВ и имеет 10% вероятность прогрессии инфекции в клиническую форму заболевания. Увеличение заболеваемости туберкулезом, сопровождаемое расширением распространения возбудителей с множественной лекарственной устойчивостью, и отсутствие в России и за рубежом высокоспецифичных и чувствительных экспресс-тестов для иммунодиагностики туберкулеза, пригодных для массового скрининга населения, а также универсальных быстрых методов определения лекарственной устойчивости изолятов возбудителей, выдвигают решение этих вопросов в круг первоочередных задач здравоохранения. Решение этих задач представляется принципиальным как для выбора более рационального и эффективного способа лечения, так и для оценки эпидемиологической ситуации по туберкулезу.
Разработка усовершенствованных тестов для иммунодиагностики ТВ требует детального понимания иммунных процессов, индуцируемых ТВ инфекцией у человека и животных, и выявления ключевых антигенов, вовлеченных в гуморальный и Т-клеточный ответ в течение ТВ заболевания.
Микобактериальные антигены, используемые
для конструирования диагностических тест-сгк тем, должны удовлетворять следующим требе ваниям: а) быть высоко специфичными для мг кобактерий туберкуленого комплекса (МТК) б) не экспрессироваться или экспрессироватьс на очень низком уровне в вакцинных штамма М. bovis BCG. В последние десять лет исследовг тели из различных лабораторий мира идентифг цировали и иммунологически охарактеризовал ряд специфичных для представителей МТК ил мунодоминантных белков, потенциально приго/ ных для разработки на их основе высокосиецг: фичных тест-систем для иммунодиагностики Ti [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Исследование антигенных свойст этих белков представляет особый интерес для сс здания специфичных и чувствительных иммунс ферментных методов серодиагностики туберку леза. К числу таких белков относится и антиге р38 с молекулярной массой 38 кДа.
Белок р38 Mycobacterium tuberculosis выпол няет функцию фосфат-связывающего белка [7 имеет сигнальную последовательность; активн секретируется, но частично связан с поверхность! клетки липидным хвостом, который также отве чает за связывание карбогидратов с этим белкол В процессе роста культуры микобактерий проис ходит накопление свобдного липопротеина p3i в культуральной среде [8]. Идентифицирован! два неперекрывающихся антигенных эпитоп,
белка р38, распознаваемых моноклональными антителами ТВ71 и ТВ72. Охарактеризована способность антигена р38 вызывать гуморальный и клеточный иммунный ответ. Andersen A.B. и Hansen Е.В. секвенировали ген, кодирующий РаЬ, и обнаружили два эпитопа для множества моноклональных антител, полученных к белку 38 кДа. Одна группа антител связывает С-концевой участок (91 аминокислотных остатков) белка, другая группа антител распознает домен, локализованный в средней части молекулы [9].
Целью данной работы являлось получение рекомбинантного антигена р38 М. tuberculosis и оценка возможности его использования в серодиагностике туберкулеза.
Материалы и методы
Реактивы: Акриламид, ]\Г,Ы’-метилен-бисакри-ламид, додецилсульфат натрия (SDS), персульфат аммония, М,]М,М’,№-тетраметилэтилендиа-мин (ТЕМЕД), бромфеноловый синий, сахароза, 2-меркаптоэтанол, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), глицерин, глюкоза, хлорам-феникол, ампициллин, Твин 20, Тритон Х-100, ПЭГ (м.в. 6000), Трис-гидроксиметиламиноме-тан (Трис) фирмы «Serva» (Германия). Агароза, бромистый этидий, дезоксирибонуклеозид-5’-грифосфаты, протеиназа К, бычий сывороточный альбумин (БСА), минеральное масло фирмы «Sigma» (США). Дрожжевой экстракт, бакто-гриптон, агар фирмы «Difeo» (Великобритания). Остальные реактивы квалификации «ХЧ» или «ОСЧ» производства «Реахим» (Россия).
Ферменты: Протеиназа К, ДНК-полимераза I из Thermus aquaticus (Taql), ДНК-лигаза бактериофага Т4, («USB», США), эндонуклеазы рестрикции: Xhol, HindIII («Сибэнзим», Россия).
Бактериальные штаммы Escherichia coli:
ER2566: F~ k~ fhuA2 [Ion] ompT lacZ::T7 genel gal sulAll A(mcrC-mrr)114::IS10 R(mcr-73:: miniTnlO-TetS)2 R(zgb-210::Tnl0 )(TetS) endAl [dem];
Rosetta 2(DE3): F ompThsdSv(r0 mB)galdem (DE3) pRARE23 (CamR);
XLl-Blue: F' ::TnlO pro А ~ В ' lacl4 A(lacZ)M15/ recA1 endAl gyrA% (Nalr) thi hsdR17 (rK mK+) glnV44 relA1 lac
Векторные ДНК: вектор pET36b<+) фирмы «Novagen» (США), pGEM-T Easy Vector фирмы «Promega», (США).
Сыворотки: 106 клинических сывороток были предоставленны для исследований больницей ИК-10 МЮ РФ (г. Новосибирск), из которых 20 сывороток от здоровых доноров и 86 — от больных туберкулезом. Из них 43 — от пациентов, находящихся на лечении, 27 — от больных туберкулезом, не проходивших курс лечения, 10 — от
лиц, клинически излеченных от ТБ, 3 — от контактных по туберкулезу лиц, 2 — с неподтвержденным диагнозом ТБ, т.е. с неспецифическими заболеваниями легких, 1 — от больного, латентно перенесшего туберкулез.
Методы. Выделение ДНК М. tuberculosis проводили хлороформной экстракцией, как описано нами ранее [10].
ПЦР. Область гена, кодирующую зрелый белок р38, амлифицировали методом ПЦР с использованием прямого (PR168) и обратного (PR170) праймеров, на 5’- концах которых предусмотрены сайты узнавания рестриктазами HindiII и Xhol соответственно. По данным сайтам рестрикции предполагалось встроить ампликоны в экспрессирующий вектор pET36b+. Ниже приведены нуклеотидные последовательности праймеров, подобранных с помощью программы OLIGO (версия 3.3) .
PR168:
5'-CCCAAGCTTTCGAAACCACCGAGCGG
PR170:
5'CCGCTCGAGGCTGGAAATCGTCGCGATC
ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 50 мкл. К 5 мкл предварительно денатурированной ДНК микобактерий, добавляли 45 мкл смеси компонентов. Конечная реакционная смесь содержала 16,6 mM (NH4)2S04, 67 тМ Tris-HCl (pH 8,8), 2,5 тМ MgCl2, 0,01% Tween 20, по 0,05тМ каждого из 4 dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), no 0,2 мкМ каждого из праймеров, 10% глицерина и по 2,5 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере МС2 («ДНК-технология», Москва) в режиме активного регулирования температуры реакционной смеси. Реакцию вели при следующих температурных режимах: денатурация ДНК при 96 °С 3 мин на 1-м цикле и при 94 °С 0,5 мин на последующих 35 циклах; отжиг праймеров с матрицей-мишенью при 63 °С 0,5 мин на первых 5 циклах и при 79 °С 0,5 мин на последующих циклах; полимеризация цепи ДНК при 72 °С 1 мин. Время полимеризации цепи на последнем цикле составляло 8 мин.
Электрофорез ДНК в гелях. Продукты амплификации ДНК анализировали с помощью электрофореза в 5-12% ПААГ или в 0,8-2% агарозном геле [И].
Обработка ДНК ферментами. Гидролиз ДНК рестриктазами и сшивку фрагментов ДНК при помощи ДНК-лигазы фага Т4 проводили согласно прилагаемым к препаратам ферментов инструкциям фирм-производителей.
Экстракция ДНК из геля агарозы. Смесь фрагментов ДНК разделяли электрофорезом в агарозном геле. Полоску агарозного геля, содержащую
целевой фрагмент ДНК, растворяли при 60 °С в равном объеме 8 М NaC104. В раствор, содержащий ДНК, вносили суспензию мелкодисперсного оксида кремния «Силика». Емкость сорбента составляла 2,5 мкг ДНК на 1 мг оксида кремния. Сорбцию ДНК на поверхности частиц оксида кремния проводили в растворе 4 М NaC104 в течение 15 мин при комнатной температуре. Сорбированную ДНК элюировали дистиллированной водой или ТЕ-буфером при 56 °С.
Трансформацию клеток E. coli плазмидными ДНК проводили методом электропорации в соответствие с руководством фирмы-производи-теля электропоратора «PeqLab, Biotechnologie GmbH».
Выделение и очистка рекомбинантных белков. Клетки E. coli штаммов Rosetta 2 или ER2566, трансформированные плазмидой рЕТ36Ь(+) со вставкой гена, кодирующего зрелый белок р38 М. tuberculosis, выращивали при 37 °С в термостате на шейкере в 100 мл среды LB с соответствующими антибиотиками. После достижения культурой оптической плотности при 600 нМ, равной 0,5 (ОП600 = 0,5), в культуру вносили индуктор IPTG до концентрации 1,0 мМ. Дальнейшее выращивание проводили при 30 °С до ОП600 = 1,5. Клетки из культуры осаждали центрифугированием при 3000 об/мин 10 мин, суспендировали в фосфатносолевом буфере (PBS) и однократно промывали центрифугированием в тех же условиях.
Очистку рекомбинантного белка р38 проводили методами аффинной хроматографии, как в нативных условиях на Ni2+-NTA-Sepharose 6В-CL, так и в денатурирующих условиях на Со2+-carboxymethylaspartate-Sepharose 6B-CL в соответствие с инструкциями фирм изготовителей сорбентов. В случае использования нативных условий аффинной хроматографии, собранные центрифугированием клетки E. coli разрушали с помощью многократного (8-10 раз) замораживания-оттаивания клеток, суспендированных в лизис-буфере, содержащем 0,1 М Трис-НС1, pH 6,8,
0,01% Тритон X-100, 5 мг/мл лизоцима и 0,1 мМ PMSF. Для разрушения высокомолекулярной ДНК, лизат клеток обрабатывали ДНК-азой I 30 минут при 37 °С и центрифугировали 20 мин при 40000xg. Осветленный лизат наносили на хроматографическую колонку, заполненную Ni2+-NTA-сефарозой-бВ, и проводили аффинную хроматографию.
В случае применения денатурирующих условий аффинной хроматографии, отмытые центрифугированием клетки E. coli суспендировали в фосфатном буфере, содержащем 20 мМ Na фосфат (pH 7,0), 250 мМ NaCl, 1,0 мМ EDTA и 0,1 мМ PMSF, и разрушали озвучиванием в ледяной
ванне. Гомогенат центрифугировали 20 мин пр 40000xg при 4 °С. Супернатант отбрасывали, осадок, содержащий тела включения, растворял в фосфатном буфере, содержащем 6 М гуаниди хлорид. Раствор центрифугировали 40 мин пр lOOOOxg при 4 °С. Осветленный раствор наносил на хроматографическую колонку, заполненну Co2+-carboxymethylaspartate-Sepharose 6B-CL, проводили аффинную хроматографию.
Ренатурацию белка, очищенного аффиннс хроматографией в денатурирующих условия проводили диализом в две ступени при +4-6 °( На первой ступени диализ вели против буфер содержащего 2 М мочевина, 20 мМ Na фосфг (pH 7,0), 100 мМ NaCl, 1,0 мМ EDTA, на второ
— против буфера, содержащего 20 мМ Na фосфг (pH 7,0), 100 мМ NaCl 1,0 мМ EDTA.
Электрофорез белков в пластинах полиакрр ламидного геля в денатурирующих условиях прс водили по методу Лэммли. После элетрофоре:-белки в геле окрашивали кумасси G-250.
Твердофазный иммуноферментный анали Рекомбинантный белок р38, очищенный аффиг ной хроматографией, разводили в карбонатно-бг карбонатном буфере (pH 9,6) до рабочей концег трации, вносили в лунки планшета по 100 мкл оставляли для сорбции при +4 °С на 15-18 часо] После завершения сорбции проводили послед} ющие процедуры промывки лунок и инкубаци с блокирующим раствором и коньюгатом по о i щепринятой схеме. После окончании инкубаци с коньюгатом лунки промывали, в каждую из ни вносили по 100 мкл субстрата для пероксидазы выдерживали 20 мин при 20-25 °С в защищенно] от света месте. Реакцию останавливали внесение] в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (раство 2М H2S04). Результаты иммуноферментного ап; лиза (ИФА) регистрировали на спектрофотомет ре. Оптическую плотность (ОП) измеряли пр длине волны 492 нм.
Результаты и обсуждение
Ампликон гена белка р38 первоначально клс нировали в составе вектора pGEM-T в клетка E. coli шт. XL 1-Blue. Затем этот вырезали из ре комбинантной плазмиды по сайтам рестрикци Hind III и Xho I и по этим же сайтам встраивал в экспрессирующий вектор рЕТ36Ь(+)с помощы ДНК-лигазы фага Т4. Лигазной смесью транс формировали компетентные клетки E. coli пг ER2566 и проводили селекцию клонов. Анали клонов на наличие рекомбинантных плазмид, не сущих ген белка р38, проводили методом ПЦР использованием праймеров PR168 и PR170. Был обнаружено 3 клона, давших положительный от вет. На рисунке 1 приведены результаты одного и таких анализов. Можно видеть, что клоны 47-9 ]
79-9 (дорожки 5 и 12, соответственно) содержат рекомбинантные плазмиды со вставками целевого гена.
Отобранные клоны исследовали на способность продуцировать рекомбинантный химерный полипептид. В случае правильной встройки гена белка р38 в вектор, продукт его экспрессии должен содержать в N-концевой области аминокислотную последовательность целлюлозосвязывающего домена (157 аминокислотных остатков, а.о.) п последовательность, кодируемую поли-лиикером вектора (63 а.о.). N-концевая область химерного белка должна состыковываться с С-концевой областью, представленной последовательностью зрелого белка р38 М. tuberculosis (359 а.о.). содержащей на С-конце кодируемый вектором 8-ми гистидиновый участок. Таким образом, по расчетам молекулярная масса химерного полипептида, состоящего из 579 а.о., должна составлять 59373 /1а.
После индукции культур клонов ИГ1ТГ синтез химерного белка р38 наблюдался в двух клонах: 34-5 и 79-9. На рисунке 2 приведены результаты электрофореза лизатов клеток ряда клонов в SDS-полиакриламидном геле. Как видно из рис. 2, клон № 34-5 после индукции ИПТГ (дорожка 15), продуцирует химерный белок молекулярная масса которого, судя по результатам электрофореза в SDS-ПААГ, составляет -60 кДа, то есть соответствует выше приведенным расчетам. На долю рекомбинантного белка, обозначенного нами как гР38, приходится всего -6-8% от суммарного белка клетки. Столь низкий уровень синтеза гР38, по-видимому, объясняется высоким содержанием в его гене редко встречаемых в геноме E.coli кодонов пролипа — ССС.
Для проведения работ, связанных с оценкой антигенных свойств рекомбинантного химерного белка гР38, была осуществлена его препаративная наработка. Культуру клеток клона № 34-5 растили до оптической плотности при длине волны 600 нм 0.5-0.6 O.E. затем индуцировали ИПТГ (конечная концентрация 5 тМ) и инкубировали при 27 °С 14 часов. Выделение рекомбинантного белка проводили методом аффинной хроматографим в нативных условиях. Основная масса белка гР38 выходила с фронтом элюента в 2-3 объемах колонки. Чистота белка колебалась в диапазоне 85-96%. Концентрацию белка определяли методом Лоури.
Для оценки диагностической значимости полученного антигена гР38 он был протестирован на образцах сывороток от больных туберкулезом и от здоровых доноров (см. «Материалы и методы»).
С целью определения оптимальной концентрации антигена для последующего проведения
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных при анализе клонов на наличие фрагмента гена, кодирующего зрелый белок р38 М. tuberculosis. Электрофорез проводили в 1% агарозном геле.
Дорожки: (1) — ампликоп фрагмента гена белка p'J8 (положительный контроль ПЦР); (2-12) — продукты ПЦР, полученные на ДНК клонов №№: 43-9, 44-9, 45-9,46-9, 47-9, 76-9, 77-9, 76-9, 77-9. 78-9, 79-9, соответственно. Стрелкой отмечено полож ение ампликона гена белка р38
Рис. 2. Электрофореграмма белков из лизатов клеток клонов E.coli, содержащих рекомбинантную плазмиду рЕТ36Ь(+) со вставкой ДНК, кодирующей зрелый белок р38 М. tuberculosis. Электрофорез проводили в 12,5% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по Лэммли. Дорожки: (1) — маркеры молекулярных масс; (2-3) — лизаты клонов E.coli. содержащих плазмиду рЕТ36Ь(+) без вставки гена, неиндуцированных (2) и индуцированных (3) IPTG; (4-15) — лизаты различных клопов E.coli, содержащих плазмиду рЕТ36Ь(+) со вставкой гена белка р38, неиндуцированных (четные номера дорожек) и индуцированных (нечетные номера дорожек). На дорожках 14 и 15 лизаты клона № 34-5, продуцирующего химерный белок р38 М.tuberculosis
твердофазного ИФА антиген наносили с двукратным шагом разведений в лунки планшет в концентрациях от 1 до 0,05 мкг/лунку и проводили иммуноферментный анализ. Результаты определения показали, что 0,1 мкг антигена гР38 на лунку является его оптимальной дозой.
Из 86 сывороток больных туберкулезом положительный ответ в иммуноферментном анализе дали 72 сыворотки, отрицательный — 14, четыре из которых тоже дали отрицательный ответ при их тестировании на экспериментальной диагностической тест-системе фирмы «Lionex» (ФРГ). Четырнадцать образцов сывороток, давших отрицательный ответ в ИФА, представлены пятыо сыворотками от лиц больных туберкулезом, находящихся на лечении, тремя, взятыми от больших туберкулезом, не проходивших курс лечения, двумя — от лиц, клинически излеченных от туберкулеза, одной — от лица, контактного по туберкулезу, двумя — от пациентов, прошедших курс лечения, и одной — от лица с неподтвержденным диагнозом туберкулеза. Все сыворотки, полученные от здоровых доноров, дали отрицательный ответ.
Полученные результаты позволяют дать предварительную оценку чувствительности ИФА, основанного на использовании рекомбинантного химерного антигена гР38, которая составляет 84,7%. Что касается оценки специфичности ИФА, то для ее корректного определения необходимо на ряду с сыворотками больных туберкулезом протестировать сыворотки, полученные от лиц с неспеци-фическими заболеваниями легких, а также лиц инфицированных нетуберкулезными микобактериями (М. smegmatis, М. avium, М. fortuitum, М. intracellulare), а также от BCG-вакцннированных лиц. Такие исследования планируется провести в ближайшей перспективе.
Следует подчеркнуть, что все 86 проанализированных сывороток предварительно были протестированы на коммерческой тест-системе «Lionex Tuberculosis Antibody ELISA kits» (Cat. No.: LIO-TUB01), предназначенной для выявления специфических IgG в сыворотках крови к антигенам М. tuberculosis. Из проанализированных сывороток, полученных от больных туберкулезом, 7 дали отрицательный результат, из них 4 сыворотки от лиц, находящихся на лечении, 2 — от пациентов до лечения и одна от человека с неподтвержденным диагнозом туберкулеза. Таким образом, по предварительным данным, чувствительность данной тест-системы составляет 91,9%.
Как уже отмечалось выше, клон № 34-5 продуцировал очень малое количество рекомбинантного белка г-Р38 (Рис. 2). В связи с этим из клеток этого клона была выделена рекомбинантная плаз-
мида и ею были трансформированы клетки E. cot штамма Rosetta 2 (DE3), несущие ColEl-совмес тимую плазмиду: pRARE23 (CamR), содержащук гены т-РНК для семи редко встречаемых КОДОНО! E. coli.
Отобранные рекомбинантные клоны штамм: Rosetta 2 (DE3) были исследованы на способ ность продуцировать химерный полипептид гР38 После индукции культур клонов ИПТГ синте; химерного белка гР38 наблюдался в двух кло пах: №4 и №8. На рисунке 3 приведены результа ты электрофореза лизатов клеток этих клонов i SDS-полиакриламндном геле. Как видно из рис 3, анализируемые клоны после индукции ИПТ1 (дорожки 2,3 и 5), продуцируют химерный бело!
Рис. 3. Электрофореграмма белков из лизатов клеток двух клонов E. coli штаммов Rosset а 2, продуцирующего химерный белок р38 М. tuberculosis. Электрофорез проводили в 15% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по Лэммли.
Дорожки: (1-3) — лизаты клона №8 E. coli шт. Rosetta 2. неиндуцированного (1) и индуцированного (2,3) ИПТГ; (4-5) — лизаты клона №4 E.coli uim. Rosetta 2, неиндуцированного (4) и индуцированного (5) ИПТГ
гР38. На долю рекомбинантного белка приходится всего -30-35% от суммарного белка клеток E. coli. Основная масса рекомбинантного антигена выявлялась в телах включения (Рис. 4). Выход белка гР38, выделенного аффинной хроматографией в денатурирующих условиях из лизата клеток, выращенных в 100 мл культуры, составлял 1,2-1,5 мг. Степень очистки белка по данным электрофореза в ПААГ составляла 88% (Рис. 4). В процессе проведения ренатурации рекомбинантного белка гР38 с помощью диализа этот белок присутствовал в растворенном состоянии и его количество оставалось неизменным. В процессе хранения в таком буфере при -20 °С в течении 6 месяцев белок не разрушался. Таким образом, рекомбинантные клоны №4 и №8 штамма Rosetta 2 (DE3), могут быть использованы в качестве продуцентов антигена р38 М. tuberculosis.
Заключение
В последние годы достигнуты значительные успехи в идентификации иммунодоминантных антигенов М. tuberculosis. Белок 38 кДа (р38) является наиболее изученным из них и включен в большое количество исследований, направленных на создание диагностических тест-систем. В зависимости от страны проживания и от стадии заболевания антиген р38 связывает антитела 16
— 80% сывороток больных туберкулезом [9, 12, 13]. В связи с этим антиген р38 включен как один из нескольких компонентов в трех различных коммерческих тест-системах для диагностики ТБ (ICT Tuberculosis AMRAD-ICT [Amrad, Sydney, Australia], RAPID test ТВ, and PATHOZYME-MYCO). Эти тест-системы позволяют диагностировать туберкулез в 25-64% случаях [14, 15].
По нашим данным, антитела к рекомбинантному антигену р38 в крови больных туберкулезом до лечения, в течение лечения и у клинически излеченных пациентов обнаруживаются в высоком титре. По предварительным оценкам, чувствительность твердофазного иммунофермент-ного анализа, основанного на рекомбинантном химерном антигене р38, составляет 84,7%. Таким образом, рекомбинантный химерный антиген р38 может быть использован, наряду с другими рекомбинантными антигенами, специфичными для М. tuberculosis, для конструирования на его основе иммуноферментной тест-системы для серодиагностики туберкулеза.
Авторы признательны проф. М. Сингху за любезно предоставленные им наборы диагностических тест-систем на туберкулез фирмы «Ыопех» (ФРГ).
W $
- Л
Рис. 4. Электрофореграмма белков из лизатов клеток клона №8 Е. coli шт. Rosetta 2, продуцирующего химерный белок р38
М. tuberculosis. Электрофорез проводили в 15% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по Лэммли.
Дорожки: (1-3) — лизаты клона №8 E.coli шт.
Rosetta 2, неиндуцированного (1) и индуцированного
(2) ИПТГ; (4) — белки клона №8, индуцированного
ИПТГ, присутствующие в телах включения; (4—9)
— фракции белка, элюированного с аффинного сорбента
150 мМ имидазолом; (10) — маркеры молекулярных масс белков
OBTAINING OF р38 RECOMBINANT ANTIGEN OF M. TUBERCULOSIS AND AN EVALUATION OF POSSIBILITY OF ITS APPLICATION IN SERODIAGNOSTIC ASSAY OF TUBERCULOSIS.
S.A. Derkachyova, V.I. Tkachenko, A.B. Beklemishev
The aim of the present study was obtaining of p38 recombinant antigen of M.tuberculosis and an evaluation of possibility of its application in sérodiagnostic assay of tuberculosis. We have designed recombinant E.coli strain, producing chimeric protein (rP38), containing amino acid sequence of a mature p38 antigene of M. tuberculosis in the C- terminal region. Antigenic properties of recombinant chimeric protein were investigated by ELISA with use of the panel of 106 sera received from healthy donors and from patients with tuberculosis (ТВ). It was shown, that recombinant antigen rP38 binds IgG in 84.7 % of serum samples from patients with ТВ. Moreover, presence of antibody to p38 M. tuberculosis with high titres both in blood sera of patients with ТВ, past and not past course of treatment, and in blood sera of clinically cured patients was revealed. Thus, recombinant chimeric antigen rP38 can be used, alongside with others recombinant antigens specific for M.tuberculosis, for designing on its basis the tests for serodiagnosis of tuberculosis.
Литература
1. Clinical value of the measurement of Mycobacterium tuberculosis specific antibody in pulmonary tuberculosis
/ G.H. Bothamley, R. Rudd, F. Festenstein, J. Ivanyi // Thorax. - 1992. - Vol. 47. - P. 270-275.
2. Evaluation of different tests for the serodiagnosis of tuberculosis and the use of likelihood ratios in serology. / A. Verbon, G.J. Weverling, S. Kuijper et al. // Am. Rev. Respir. Dis. - 1993. - Vol. 148. - P. 378-384.
3. Specific and early detection of IgG, IgA and IgM antibodies to Mycobacterium tuberculosis 38kDa antigen in pulmonary tuberculosis / K.R. Uma Devi, B. Ramalingam, P.J. Brennan et al. // Tuberculosis (Edinb)
- 2001. - Vol. 81 (3). - P. 249-253.
4. Molecular cloning, purification, and serological characterization of MPT63, a novel antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis / C. Manca, K. Lyashchenko, H.G. Wiker et al. // Infect Immun. — 1997. — Vol. 65. — P. 16-23.
5. MTC28, a novel 28-kilodalton proline-rich secreted antigen specific for the Mycobacterium tuberculosis complex / C. Manca, K . Lyashchenko, R. Colangeli, M. L. Gennaro // Infect Immun. — 1997. — Vol. 65. — P. 4951-4957.
6. Evidence for occurence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tyberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG / M. Harboe, T. Oettinger, H.G. Wiker et al. // Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64. - P. 16-22.
7. Andersen A.B. Evidence that protein antigen b of Mycobacterium tuberculosis is involved in phospate metabolism. / A.B. Andersen, L. Ljungqvist, M. Olsen // Gen. Microbiology. — 1990. — Vol. 136. — P. 477-480.
8. Young D.B. Lipoprotein antigens of Mycobacterium tuberculosis / D.B. Young, T.R. Garbe // Res. Microbiol.
- 1991. - Vol. 142. - P. 55-65.
9. Andersen A.B. Structure and mappins of antigeni domains of protein antigen b, a 38,000-molecular weigh protein of Mycobacterium tuberculosis / A.B. Andersei E.B. Hansen // Infect. Immun. — 1989. — Vol. 57 (10
- P. 3123-3130.
10. Выявление микобактерий туберкулезного koiv плекса методом полимеразной цепной реакции с однс временной идентификацией вида М. tuberculosis / A.I Беклемишев, Е.М. Хорошева, Н.Ю. Номоконова и д] // Клиническая лабораторная диагностика. — 200:
- № 7. - С. 50-54.
11. Маниатис Т. Методы генетической инженерш Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрш Дж. Сэмбрук. — М., 1984. — 480 с.
12. Heterogeneous antibody responses in tuberculosis К. Lyashchenko, R. Colangeli, M.H. Houde et al. // Infec Immun. - 1998. - Vol. 66. - P. 3936-3940.
13. Factors associated with humoral response t ESAT-6, 38 kDa and 14 kDa in patients with a spectrur of tuberculosis / V.M. Silva, G. Kanaujia, M.L. Gennart D. Menzies // Int. J. Tuberc. Lung Dis. — 2003. — Vol.'
- P. 478-484.
14. Serologic diagnosis of tuberculosis using a simpl commercial multiantigen assay / M.D. Perkins, M.E Conde, M. Martins, A.L. Kritski // Chest. — 2003. — Vo 123.-P. 107-112.
15. Pottumarthy S. Comparison of seven tests fo serological diagnosis of tuberculosis / Pottumarthy S. V.C. Wells, A.J. Morris //Clin. Microbiol. — 2000. — Vo 38. - P. 2227-2231.
