Получение микобактериальных антигенов, слитых с целлюлозосвязывающим белковым доменом, с целью создания на их основе субъединичных противотуберкулезных вакцин Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.371:579.873.21].012:577.21

О. В. Сергиенко1, А. М. Лящук1, Е. И. Аксенова1, З. М. Галушкина1, Н. Н. Полетаева1, Н. Е. Шарапова1, А. С. Семихин1, А. П. Котнова1, А. М. Веселов1, В. Н. Башкиров1, Н. Л. Куликова3, В. С. Хлебников3, Т. К. Кондратьева2, А. С. Карягина-Жулина1'4, А. С. Апт2,

В. Г. Лунин1, А. Л. Гинцбург1

получение микобактериальных антигенов, слитых с целлюлозосвязывающим белковым доменом, с целью создания на их основе субъединичных противотуберкулезных вакцин

1ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва; Центральный НИИ туберкулеза РАМН, Москва; 'Институт инженерной иммунологии, Любучаны, Чеховский район, Московская область; 4НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского МГУ, Москва

Нуклеотидные последовательности генов белков Ag85A, Esa-6 и С/plO Mycobacterium tuberculosis были проанализированы по базе данных (GenBank) с целью подбора и синтеза пар прай-меров, соответствующих каждому из указанных генов. С помощью методики ПЦР были получены ампликоны целевых антигенов. В качестве матрицы для амплификации ДНК использовали хромосомную ДНК M. tuberculosis H37Rv. Полученные ПЦР-продукты были клонированы в плазмиде pQE6 и размножены в штамме Es^richia coli М15. Для получения химерных конструкций, содержащих, помимо генов микобактериальных белков, целлюлозосвязывающий домен (ЦСД, CBD ), полученные плазмиды обрабатывали соответствующими эндонуклеа-зами рестрикции. Фрагмент, соответствующий ЦСД, получали аналогичной обработкой плазмидыpttlü. Были отобраны плаз-миды, несущие слитные последовательности микобактериаль-ных генов антигенов и ЦСД. Индукция экспрессии всех трех микобактериальных белков в клетках E. coli М15 приводила к накоплению соответствующих рекомбинантных продуктов ожидаемой молекулярной массы. Содержание Cfp10-CBD составило 20%, а Ag85A-CBD и ESAT6-CBD - около 15% от тотального белка. Полученные таким образом химерные белки обладают высокой аффинностью к целлюлозе и стабильностью. Иммобилизация ЦСД-содержащих рекомбинантных белков на микрочастицах целлюлозы представляет собой одностадийный процесс, обеспечивающий одновременно очистку и адсорбцию целевого белка на целлюлозе. Низкая стоимость целлюлозных сорбентов и использование целлюлозы как для очистки, так и для иммобилизации белка должны приводить к существенному снижению стоимости производства вакцин, основанных на предлагаемой технологии. Следует отметить, что многие препараты целлюлозы нетоксичны, биосовместимы и широко применяются в медицинской практике.

Кл юче вые слова : туберкулез, Mycobacterium tuberculosis, антигены, целлюлозосвязывающий домен, субъединичные вакцины

Одной из важнейших форм борьбы с туберкулезом является профилактика этого заболевания, а для этого необходима высокоспецифичная и эффективная вакцина. Существующая вакцина BCG (bacilli Calmette-Guerin) создана еще в начале XX века. Она безопасна, недорога и в настоящее время является единственной эффективной и широко применяемой противотуберкулезной вакциной. Вакцинация детей BCG защищает их от милиарного туберкулеза, препятствует диссемина-ции возбудителя инфекции и возникновению туберкулезного менингита [6, 19], но не защищает взрослых от легочного туберкулеза. К сожалению, эффективность вакцины BCG колеблется от 80 до 0% [10].

Приведенные выше данные свидетельствуют о необходимости создания новых противотуберкулез-

ных вакцин. Однако, несмотря на многочисленные попытки, значительных успехов в этой области пока нет. Представляется весьма перспективным создание противотуберкулезных вакцин, состоящих из белковых компонентов микобактерий, так называемых субъединичных вакцин [24]. Под субъединичными генно-инженерными вакцинами понимают препараты, в составе которых есть протективные детерминанты многих патогенов, полученные синтетическим или генно-инженерным путем.

Преимущество субъединичных вакцин состоит в том, что на них относительно просто получить достаточно сильный и хорошо контролируемый иммунный ответ, поскольку они содержат ограниченное количество T-клеточных эпитопов. Существенным моментом является отсутствие в таких вакцинах непротек-тивных или иммуносупрессивных компонентов. Кроме того, субъединичные вакцины существенно проще стандартизировать по составу и свойствам (иммуно-генности и протективности), чем живые.

Поиск перспективных антигенов для включения в состав вакцин и потенциальных молекул-мишеней для новых противотуберкулезных лекарств ведется с использованием экспериментальных молекулярно-генетических подходов. В настоящее время, после расшифровки геномов двух штаммов Mycobacterium tuberculosis, H37Rv [7] и CDC1551 [11], штамма AF2122/97 M. bovis [12] и близкородственной бактерии Mycobacterium leprae [8], у исследователей появилась возможность использовать методы сравнительной геномики для разработки новых вакцин и лекарств против туберкулеза.

В последние годы идентифицировано множество антигенов M. tuberculosis, потенциально важных в качестве компонентов новых вакцин и диагностических систем. К ним относятся, в частности, иммунодоми-нантные секретируемые антигены, присутствующие в культуральном фильтрате M. tuberculosis, ответ на которые обеспечивает достаточно высокий уровень противотуберкулезной защиты в моделях на животных [3].

Среди секретируемых антигенов M. tuberculosis наиболее хорошо изучены белки комплекса Ag85, включающего три близкородственных белка, а также антигены ESAT6 и CFP10.

ЭКCПЕPИMЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Белок ESAT6 - основной антиген M. tuberculosis, способный индуцировать протективный иммунитет ТЫ-типа у животных и человека [13, 14, 17, 18, 20, 22].

Нативный и рекомбинантный ESAT6 является им-мунологически активным и способен вызывать повышение уровня продукции интерферона-у у мышей, зараженных M. tuberculosis. Оценка клеточного иммунного ответа на ESAT6 позволяет различать случаи поражения легких, вызываемые M. tuberculosis и M. avium [15].

Другим иммунологически активным белком, индуцирующим высокий уровень интерферона-у, является CFP10, белок размером 10 кД, кодируемый открытой рамкой считывания 6 области RD1 \5].

Оба белка используют для разработки различных тестов для серологической диагностики туберкулеза \4, 9, 16, 23].

Для повышения уровня экспрессии и стабильности чужеродных белков в бактериальной системе, а также для простоты тестирования и применения эффективной системы очистки данных белков существует ряд генно-инженерных подходов. Одним из перспективных подходов является fusion-технология - технология слитных (химерных) белков, в основе которой лежит метод, основанный на соединении в одной рамке считывания двух генов (гена белка-носителя и гена исследуемого продукта), приводящий к синтезу в бактериальной системе химерного белка [21].

Pанее в нашей лаборатории была разработана методика использования ЦСД в качестве белка-носителя не только с целью одновременной очистки, концентрации, иммобилизации, но и с целью защиты антигена от клеточных протеаз штамма-продуцента \1].

Цель настоящей работы - получение химерных белков, содержащих соответствующий антиген, соединенный через спейсерную последовательность с целлюлозосвязывающим доменом, для использования их при создании субъединичных вакцин и тест-систем для оценки иммунного ответа и определения туберкулезного инфицирования с помощью количественного анализа антигенспецифической индукции интерферона-у в образцах цельной крови.

Материалы и методы

Ферменты и другие реактивы. В работе использовали коммерческие препараты специфических эндонуклеаз и других ферментов фирм "Boehringer" (Германия), "Promega" (США) и "Fermentas MBI" (Литва).

Для приготовления буферных и других растворов использовали соли и другие реактивы фирм "Serva" (Германия), "Pharmacia" (Швеция), "Sigma" (США), "Merck" (Германия), а также соли производства "Pеахим" Россия) маркировки х.ч. и о.с.ч.

Бактериальные штаммы. В работе были использованы следующие лабораторные штаммы:

1. Штамм Escherichia coli М15 (рREP4, F') nal str rif lac ara gal mtl. pREP4 - плазмида, обеспечивающая устойчивость к ка-намицину в концентрации 25 мкг/мл ("Qiagen", США ).

2. Штамм E. coli DH5a (f80dlacZDM15, recA1, endA1, gyrA9б, thi-1, hsdR17 (rK mK+), supE44, relA1, deoR, D(lacZYA-argF) U196) ("Life Technologies", Англия). Для выращивания клеток E. coli использовали бактотриптон, бактоагар и дрожжевой экстракт фирмы "Difco" (США).

3. Штамм M. tuberculosis H37Rv (Пастер). Культуру M. tuberculosis H37Rv выращивали в жидкой среде Дюбо при 37°C на протяжении 3 нед. Концентрацию микобактерий определяли с помощью подсчета микроколоний через 3 дня после посева на

твердую среду Дюбо. После этого бактерии отмывались центрифугированием в буфере PBS. Концентрация бактериальных клеток составляла 1 • 1010.

Плазмидные векторы. Использовались стандартные плаз-мидные векторы pQE6 (Apr) фирмы "Qiagen" (США), содержащие промотор фага Т5 под контролем Lac-репрессора.

Получение фрагментов ДНК, кодирующих соответствующие белки-антигены. В качестве матрицы для амплификации ДНК использовали хромосомную ДНКM. tuberculosis, выделенную с помощью стандартной фенол-фенол-хлороформной экстракции с последующим осаждением этанолом.

Расчетные температуры отжига праймеров определяли с помощью программы Oligo 4.0. Полученные методом ПЦР фрагменты генов cfp10, ESAT6 и Ag85A были проанализированы с помощью рестрикционного анализа, который показал полное соответствие рассчитанных размеров фрагментов размерам фрагментов, полученных при гидролизе.

Получение рекомбинантных плазмид. ПЦР-продукты были клонированы в плазмиде pQE6 по сайтам рестрикции NcoI и Kpn2I. Плазмидную и ампликонную ДНК обрабатывали эндо-нуклеазами NcoI и Kpn2I, затем полученные фрагменты разделяли электрофорезом и лигировали с помощью лигазы фага T4 ("Fermentas MBI", Литва). Полученной лигазной смесью с помощью электропорации трансформировали клетки E. coli М15 (pREP4). Отбор клонов E. coli M15 \pEsat6, pRep4], M15 \pcfp10, pRep4], M15 \pAg85A, pRep4] проводили с применением антибиотиков - ампициллина и канамицина.

Рекомбинантные плазмиды были выделены из 16 полученных клонов и проанализированы с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Установлено, что их размеры соответствуют расчетному значению.

Прямое секвенирование вставленных в pQE6 участков, которые предположительно кодировали Ag85A, Cfp10 и Esat6, проводили c помощью набора реактивов для секвенирования Су5 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit фирмы "Amersham-Pharmacia-Biotech" (США). Электрофоретическое разделение продуктов секвенирования проводили с помощью автоматического секве-натора ALF Express II фирмы "Amersham-Pharmacia-Biotech" (США).

Выделение и очистка рекомбинантных белков Ag85A, ESAT6 и Cfp10, соединенных с ЦСД и иммобилизованных на целлюлозе. Культуры клеток штаммов М15 E. coli/pCFP 10, М15 E. coli/pEsat6 и М15 E. coli/pAg85A центрифугировали 15 мин при 6000 об/мин. Полученную биомассу выдерживали при температуре -20oC в течение 30-60 мин. После заморозки клетки помещали в лизирующий буфер, содержащий 50 мМ трис-HCl (pH 8,0), 0,25 М NaCl, 0,005 М MgCl2, 1 мМ PMSF, 0,5% тритон Х-100, 0,1 мг/ мл лизоцима и гомогенизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (4 раза по 20 с).

Суспензию центрифугировали 30 мин при 10 000 об/мин. К полученному супернатанту добавляли буфер, содержащий 0,5% тритона Х-100, 30 мМ трис-HCl (pH 8,0), 0,5 М NaCl и 30% суспензию целлюлозы (кристаллическая Perloza МТ-200, Чехия) (1/3 от исходного объема). Полученную суспензию инкубировали при перемешивании 1 ч при 25oC. Затем суспензию центрифугировали 10 мин при 8000 об/мин. Полученный осадок промывали 3-4 раза буфером, содержавшим 0,5% тритон Х-100, 0,5 М NaCl, 30 мМ трис-HCl (pH 8,0).

Суспензию целлюлоза + рекомбинантные белки переносили в колонку для хроматографии и промывали раствором 4 М мочевины и 50 мМ трис-HCl (рН 8,0). Ступенчатое снятие белков с целлюлозы проводили 8 М раствором и 50 мМ трис-HCl (рН 8,0). Фракции, содержащие рекомбинантные белки, анализировали методом электрофореза в ПААГ по Лэммли. Белки для хранения переносили в раствор PBS (pH 7,4).

Результаты и обсуждение

Получение плазмидных генно-инженерных конструкций Ag85A, Esat6 и Cfp10.

Нуклеотидные последовательности генов белков

Ag85A, Esat6 и С/р10 были проанализированы в базе данных (GenBank) с целью подбора и синтеза пар праймеров, соответствующих каждому из указанных генов. Сайты эндонуклеаз рестрикции Исо1, ВатН1 и Крп21, а также кодон инициации трансляции ATG и терминирующий кодон TGA были введены в соответствующие праймеры. В результате для амплификации и последующего клонирования гена белка Ag85A были синтезированы праймеры Ag85A1 и Ag85A2:

Esat6, Ag85A и ЦСД, они были использованы для получения слитных генно-инженерных конструкций.

Для получения химерной конструкции Ag85A-CBD плазмиду pAg85A, содержащую ген белка Ag85A, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BglII/XbaI и получали фрагменты длиной 3306 и 612 п.н. Плазмиду рП10, содержащую ген ЦСД, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции ВатН1/ХЬа1 и получали фрагменты длиной 1585 и 2443 п.н. В результате лигирования бы-

Ag85A1 (N-5' - CCG CCG GGATCC ATG GCA TTT TCC CGT CCG GGC TTG CCG GTG GAG-3'),

BamHI NcoI

Ag85A2 (N-5' - CGT TGT TCC GGA CTA AGA TCT GGC GCC CTG GGG CGC GGG CCC-3'),

Kpn 21

Для гена белка Esat6 - праймеры ESAT1 и ESAT2:

ESAT1 (N- 5 ' - CCT CCG GGA TCC ATG GCA GAG CAG CAG TGG AAT TTC-3')

BamHI NcoI

ESAT2 ( C- 5 ' - CGA TTC TTC GGA TTA AGATCT GAA CAT CCC AGT GAC GTT GCC TTC-37

Kpn 21 (BspMII) stop Bglll Для гена белка Cfp 10 - праймеры CFP1 и CFP2: CFP1 (5' - CGT CCA CCA TGG CAG AGA T G A A G A CCG ATG-3-NcoI

CFP2 (5' - C GT AT T T C C GGA T CA GGA T C C CAT T T G C GA GGA CA G C GC - 3 ' ). Kpn21

Полученные с использованием данных праймеров продукты амплификации кодируют полноразмерные белки CfplO, Esat6и Ag85A. При этом в рекомбинант-ном белке CfplO остаток фенилаланина замещен на серин на С-конце, а в белке Esat6 остаток треонина замещен на метионин на Ж-конце, а на С-конце ала-нин замещен аргинином и имеется дополнительный остаток серина. Предполагается, что эти замены не должны сильно повлиять на экспонирование эпито-пов. Области кодирования Ag85A, Esat6 и CfplO (во всех случаях без секреторной сигнальной последовательности) были амплифицированы c помощью ПЦР из хромосомной ДНК M. tuberculosis H37Rv с использованием указанных праймеров, соответствующих каждому из генов. ПЦР-продукты, соответствующие каждому гену, были клонированы в pQE6 ("Qiagen") по сайтам NcoI и Kpn2I. В результате были получены плазмидные генно-инженерные конструкции pCfplO, pEsat6 и pAg85A (рис. 1), экспрессирующие соответствующие рекомбинантные белки M. tuberculosis.

Конструирование штаммов E. coli — продуцентов рекомбинантных антигенов M. tuberculosis, соединенных с НЦСД. Штаммы E. coli М15, содержащие плазмиды pEsat6 и pAg85A, наращивались в препаративных количествах и из них были выделены и очищены соответствующие плазмидные ДНК.

Плазмида, несущая ген ЦСД (CBD) из термофильного микроорганизма Anaerocellum thermophilum (ptt10), была получена ранее [2]. Штамм E. coli DH5а, содержащий эту плазмиду, также наращивался в препаративных количествах, после чего плазмидная ДНК была выделена и очищена.

После получения и проверки рестрикционным картированием плазмидных ДНК, кодирующих гены

ла получена плазмидаpAg85A-CBD (4890 п.н.).

Химерная конструкция Esat6-CBD была получена аналогичным образом: плазмиду pEsat6 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BglIIIXbaI и получали фрагменты размером 2696 и 612 п.н. Плазмиду рП10 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamШ/XbaI и получали фрагменты размером 1585 и 2443 п.н. Для лигирования брали фрагменты 2696 и 1585 п.н. из плазмид pEsat6 и рЫ10 соответственно. В результате лигирования была получены плазмидаpEsat6-CBD (4281 п.н.).

Для получения химерной конструкции Cfp10-CBD плазмиду, содержащую ген белка с/р10, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BamHI/PvuI и получали фрагменты 2288 и 1033 п.н. Плазмиду рП10 обрабаты-

Nco\

ВатН\

Promoter SD

CFP10

Nco\

Promoter SD

EsatG

Nco\

Promoter SD

Рис.

Ад85А

Terminator

BglII Kpn2\

Terminator BglU Kpn2\

Terminator

1. Схема генно-инженерных конструкций pCFP10, pEsat6 и pAg85A.

Promoter T5 - промотор бактериофага T5; SD - последовательность Шайна-Дальгарно; Terminator - терминатор транскрипции; CFP 10 - ген белка cfp10 из M. tuberculosis; Esat6 - ген белка Esat6 из M. tuberculosis; Ag85A - ген белкаAg85A из M. tuberculosis; NcoI, BamHI, BglII и Kpn2I - сайты эндонуклеаз рестрикции.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Neo I

V

Bglïï HindlU

Promoter SD

О

spacer

>Г

AgSbA

Nco\

CBD Terminator BglW Hind\\\

Promoter SD

О

spacer

>r

Esat6

CBD Terminator

Nco\

BglW HindlU

у

->->

Promoter SD

:

spacer

>Г

CFP10

CBD Terminator

Рис. 2. Схема химерных рекомбинантных плазмид. Дополнительная большая стрелка обозначает целлюлозосвязывающий домен (ЦСД, CBD); spacer - спейсер между последовательностью микобакте-риального антигена и ЦСД. Остальные обозначения те же, что на рис. 1.

вали эндонуклеазами рестрикции BamHI/PvuI и получали фрагменты 3261 и 767 п.н. В результате лигирова-ния была получена плазмидаpCfpl0-CBD (4294 п.н.).

Схемы химерных конструкций Ag85A-CBD, Esat6-CBD и Cfp10-CBD изображены на рис. 2.

Полученные конструкции с помощью электропора-ции трансформировали в клетки E. coli М15 (рREP4). Отбор клонов E. coli M15 проводили с применением ампициллина и канамицина.

Индукция экспрессии всех трех белков в клетках М15 приводила к накоплению соответствующих реком-бинантных продуктов ожидаемой молекулярной массы. Содержание Cfp10-CBD составило 20%, а Ag85A-CBD и ESAT6-CBD - около 15% от уровня тотального белка.

Выделение и очистка белков Ag85A-CBD, ESAT6-CBD, Cfp10-CBD. Используемый в данной работе ЦСД из термофильного микроорганизма Anaerocellum thermophilum характеризуется высокой константой связывания c целлюлозой. Это позволяет проводить в одну стадию процедуру связывания, очистки и ренату-рации исследуемого химерного белка на твердой фазе. Следует отметить, что штамм E.coli М15не имеет собственных белков, специфически взаимодействующих с целлюлозой. Иммобилизованные на целлюлозном

Рис. 3. Электрофореграмма (12% ПААГ) рекомбинантных белков после диализа (на примере Cfp10-CBD, ESAT6-CBD). 1 - белок Cfp10-CBD - 0,5 мкл; 2 - белок Cfp10-CBD - 2 мкл; 3 - белок

Cfp10-CBD - 5 мкл; 4 - белок Cfp10-CBD - 10 мкл; 5 - контрольный белок, мол. масса 24 кД, 2 мкг/мл - 5 мкл; 6 - контрольный белок, мол. масса 45 кД - 5 мкл; 7 - белок ESAT6-CBD - 0,5 мкл; 8 - белок Е8АТ6-CBD - 2 мкл; 9 - белок ESAT6-CBD - 5 мкл; 10 - белок ESAT6-CBD - 10 мкл.

сорбенте антигены представляют собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белками.

Для выделения и очистки белков Ag85A-CBD, ESAT6-CBD, Cfplü-CBD в работе были использованы различные виды целлюлозы, опробованы разные способы элюции белков с сорбента с применением мочевины, формамида и пр., подобраны условия диализа белков и хранения чистых препаратов.

Степень очистки химерных белков по данным электрофореза по Лэммли составляла не менее 95% (рис. 3).

В результате проведенных исследований были впервые получены препараты химерных белков, состоящих из секретируемых антигенов M. tuberculosis Ag85A, ESAT6, Cfplü, соединенных через спейсер-ную последовательность с ЦСД. Наличие этого домена позволяет сохранять антигенные свойства Ag85A, ESAT6, Cfplü, что подтверждено иммуноблоттингом с использованием специфических антител и клеточных иммунологических тестов (данные не представлены), а также позволяет при очистке увеличить выход реком-бинантного белка (1-2 мг белка на l мл суспензии).

Получение секретируемых антигенов M. tuberculosis Ag85A, ESAT6, Cfplü в составе химерных конструкций дает возможность дальнейшего их исследования при создании субъединичных вакцин и диагностических тест-систем.

Решение поставленной задачи основывалось на ранее разработанном в нашей лаборатории специальном генно-инженерном подходе, позволяющем достаточно легко клонировать гены различных белков путей подсоединения их к гену ЦСД и экспрессировать полученные рекомбинантные конструкции. Полученные таким образом химерные белки обладают высокой аффинностью к целлюлозе и стабильностью. Важным обстоятельством является то, что константы связывания таких рекомбинантных белков с целлюлозой достаточно высоки, но при этом не достигают уровня, характерного для ковалентного связывания, что предполагает возможность медленной спонтанной диссоциации белков с целлюлозного носителя, в особенности in vivo. Иммобилизация содержащих ЦСД рекомбинантных белков на микрочастицах целлюлозы представляет собой одностадийный процесс, обеспечивающий одновременно очистку и адсорбцию целевого белка на целлюлозе. Низкая стоимость целлюлозных сорбентов и использование целлюлозы как для очистки, так и для иммобилизации белка должны приводить к существенному снижению стоимости производства вакцин, основанных на предлагаемой технологии. Следует отметить, что многие препараты целлюлозы нетоксичны, биосовместимы и широко применяются в медицинской практике.

Сведения об авторах:

ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздрав-соцразвития России:

Сергиенко Ольга Васильевна - канд. хим. наук, ст. науч. сотр.,

Лящук Александр Михайлович - канд. биол. наук, ст. науч. сотр.,

Аксенова Екатерина Ивановна - канд. биол. наук, мл. науч. сотр.,

Галушкина Зоя Михайловна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр.,

Полетаева Нина Николаевна - мл. науч. сотр.,

Шарапова Наталья Евгеньевна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр.,

Семихин Александр Сергеевич - канд. биол. наук, ст. науч. сотр.,

Котнова Алина Петровна - канд. хим. наук, науч. сотр.,

Башкиров Виктор Николаевич - канд. биол. наук, ст. науч. сотр., e-mail: vnbashkirov@gmail.com,

Карягина-Жулина Анна Станиславовна - д-р биол. наук, гл. науч. сотр., e-mail: akaryagina@ gmail.com,

Лунин Владимир Глебович - д-р биол. наук, зав. лаб., e-mail: lunin1955@gmail.com,

Гинцбург Александр Леонидович - акад. РАМН, д-р биол. наук, проф., дир.

Институт инженерной иммунологии Куликова Наталья Леонидовна - ст. науч. сотр., Хлебников Валентин Сергеевич - д-р биол. наук, проф., зав. лаб.,

Центральный НИИ туберкулеза РАМН Кондратьева Татьяна Константиновна - д-р биол. наук, вед. науч. сотр.,

Апт Александр Соломонович - д-р биол. наук, проф., зав. лаб.,

НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ Веселов Андрей Михайлович - аспирант.

ЛИТЕРАТУРА

1. Лящук А. М., Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Журнал микро-биол. - 2006. - № 4. - С. 65-68.

2. Лящук А. М., Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Биотехнология.

- 2006. - № 5. - С. 32-38.

3. Andersen P. // Scand. J. Immunol. - 1997. - Vol. 45, N 2. - P. 115-131.

4. Arend S. M., Andersen P., van Meijgaarden K. E. et al. // J. Infect. Dis. - 2000. - Vol. 181, N 5. - P. 1850-1854.

5. BerthetF. X., RasmussenP. B., RosenkrandsI. et al. // Microbiology.

- 1998. - Vol. 144, N 11. - P. 3195-3203.

6. Colditz G. A., Brewer T. F, Berkey C. S. et al. // J. A. M. A. - 1994. -Vol. 271. - P. 698-702.

7. Cole S. T, Brosch R, Parkhill J. et al. // Nature. - 1998. - Vol. 393, N 6685. - P. 537-544.

8. Cole S. T, Eiglmeier K., Parkhill J. et al. // Nature. - 2001. - Vol. 409. - P. 1007-1011.

9. Dillon D. C., Alderson M. R., Day C. H. et al. // J. Clin. Microbiol. -2000. - Vol. 38, N 9. - P. 3285-3290.

10. Fine P. E. // Lancet. -1995. - Vol. 346. - P.1339-1345.

11. FleischmannR. D., AllandD., Eisen J. A. et al. // J. Bacteriol. - 2002.

- Vol. 184, N 19. - P. 5479-5490.

12. GordonS. V., EiglmeierK., Garnier T. et al. // Tuberculosis. - 2001.-Vol. 81, N 1-2. - P. 157-163.

13. Johnson P. D., Stuart R. L., Grayson M. L. et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1999. - Vol. 6, N 6. - P. 934-937.

14. Lalvani A., Brookes R., Wilkinson R.J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1998. - Vol. 95, N 1. - P. 270-275.

15. Lein A. D., von Reyn C. F., Ravn P. et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1999. - Vol. 6, N 4. - P. 606-609.

16. Munk M. E., Arend S. M., Brock I. et al. // J. Infect. Dis. - 2001.- Vol. 183, N 1. - P. 175-176.

17. PathanA. A., Wilkinson K. A., Wilkinson R .J. et al. // Eur. J. Immunol. -2000. - Vol. 9. - P. 2713-2721.

18. Pollock J. M., Andersen P. // Infect. and Immun. -1997. - Vol. 65, N

7. - P.2587-2592.

19. Rodrigues L. C., Divan V. D., Wheeler J. G. // Int. J. Epidemiol. -1993. - Vol. 22. - P. 1154-1158.

20. Smith S. M, Klein M. R., Malin A. S. et al. // Infect. and Immun. -2000. - Vol. 68, N 12. - P. 7144-7148.

21. TerpeK. // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2003. - Vol. 60. - P. 523-533.

22. Ulrichs T., Anding P., Porcelli S. et al. // Infect. and Immun. - 2000. - Vol. 68, N 10. - P. 6073-6076.

23. van Pinxteren L. A., Ravn P., Agger E. M. et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2000. - Vol. 7, N 2. - P. 155 -160.

24. Williams A., Hatch G. J., Clark S. O.et.al. // Tuberculosis. - 2005. -Vol. 85. - P. 29-38.

PRODUCTION OF MYCOBACTERIAL ANTIGENES MERGED WITH CELLULOSE BINDING PROTEIN DOMAIN IN ORDER TO PRODUCE SUBUNIT VACCINES AGAINST TUBERCULOSIS

O. V. Sergienko1, A. M. Lyashchuk1, E. I. Aksenova1, Z. M. Galushkina1, N.N. Poletaeva1, N. E. Sharapova1, A. S. Semikhin1, A. P. Kotnova1, A.M. Veselov1, V. N. Bashkirov1, N. L. Kulikova3, V. S. Khlebnikov3, T. K. Kondrat'eva2, A.S. Karyagina-Zhulina14, A. S. Apt2, V. G. Lunin1, A.L. Gintsburg1

1 Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health and Social Development of the

Russian Federation, Moscow, Russia

2 Central Scientific-Research Institute of Tuberculosis, Russian

Academy of Medical Sciences, Moscow, Russia 3 Institute of Immunological Engineering, Lyubuchany, Chekhov District, Moscow Region, Russia

Protein genes Ag85A, Esat-6, and Qp10 of Mycobacterium tuberculosis were sequenced using the database GenBank to implement selection and synthesis of primer pairs of given genes. PCR was used to obtain target amplicons of the genes. Chromosome DNA of M. tuberculosis H37Rv was used as the DNA amplification matrix. The PCR products were obtained using the plasmid pQE6, cloned, and amplified in the Escherichia coli М15 strain. Chimere products containing mycobacterial genes and cellulose binding protein domain (CBD), were obtained using the plasmid treated with restriction endonucleases. CBD fragment obtained using similar treatment of the pttW plasmid. The plasmids containing merged sequences of mycobacterial genes-antigenes and CBD were selected. The 3 mycobacterial genes were expressed in the E. coli М15 cells resulting in biosynthesis of corresponding recombinant proteins of expected molecular weight. Concentration of CBD, CfpD-CBD, Ag85A-CBD, and ESAT6-CBD was 20%, 15%, and 15% total protein, respectively. The resulting chimere proteins provide high affinity for cellulose and high stability. Immobilization of CBD-containing recombinant proteins proceeds as one-stage process providing target protein purification and adsorption on cellulose. The vaccines produced using this technology are inexpensive because of low cost of cellulose sorbents as well as simultaneous use of cellulose for purification and immobilization of protein. Many cellulose preparations are not toxic, biocompatible, and widely used in medicine.

Key words: Tuberculosis, Mycobacteirum tuberculosis, antigens, cellulose

Поступила 08.06.11

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 577.21.08

Н. С. Щербакова, А. Н. Чикаев, Л. И. Карпенко, А. А. Ильичев

влияние биотинилирования антител 2f5 на отбор пептидов из комбинаторной фаговой библиотеки

ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора,

пос. Кольцово, Новосибирская область

В статье рассматривается влияние биотинилирования моно-клональных антител (МКА) в процедуре аффинной селекции на выход и репертуар отбираемых пептидов. Был проведен сравнительный анализ пептидов, отобранных из фаговой би-

блиотеки с помощью биотинилированных и небиотинилиро-ванных МКА 2F5. Показано, что выход пептидов, имеющих гомологию с нативным эпитопом, в 1,7 раза выше для биотинилированных антител, при этом связывание отобранных бак-