CC BY
15
УДК 577.112.856:579.252.5:616-006.441
ИЗУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АПОЛИПОПРОТЕИНА А-I КАК ПЕРЕНОСЧИКА ПЛАЗМИДНЫХ ДНК НА МОДЕЛИ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫС
Александр Владимирович РЯБЧЕНКО, Мария Владимировна КОТОВА, Наталия Викторовна ТРИФОНОВА, Роман Александрович КНЯЗЕВ, Лев Михайлович ПОЛЯКОВ
НИИ биохимии
630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Цель исследования - получение модифицированного варианта аполипопротеина А-I и изучение его способности переносить плазмидные ДНК в гепатоциты крыс в сравнении с нативной формой белка. Материал и методы: клонирование генов и получение рекомбинантных белков в E. coli, инкубирование белков в комплексе с плазмидой pTagGFP2-C in vitro на гепатоцитах крыс с последующим анализом клеток методом проточной цитометрии. Результаты и обсуждение. Модифицированный вариант апо А-I (на С-конце белка добавлены 10 аминокислотных остатков лизина) проникал в гепатоциты, специфически связывался с плазмидной ДНК, но не трансфицировал плазмиду в клетки.
Ключевые слова: аполипопротеин А-I, трансфекция, плазмида, гепатоциты.
В настоящее время внимание исследователей привлекает проблема конструирования переносчиков нуклеиновых кислот, которые безопасно можно было бы использовать в области генной терапии. Одним из направлений в этой области является конструирование полипептидов, несущих различные функциональные модули: сигналы ядерной локализации; лиганды для распознавания полипептидом определенного типа клеток; домены, конденсирующие нуклеиновые кислоты; пептиды, способствующие высвобождению комплексов «полипептид - нуклеиновая кислота» из эндосом, и другие [3, 7]. В настоящем исследовании мы предположили, что основой для такого полипептида-переносчика может быть белковый компонент липопротеинов высокой плотности -аполипопротеин А-1 (апо А). Многие клетки организма имеют на мембранах специфические рецепторы к апо А [9], особенно большое их количество обнаружено в клетках печени и опухолей. Это свойство может быть использовано в качестве одной из функций полипептида на осно-
ве апо А при доставке плазмидных ДНК (пДНК) в клетки путем рецептор-опосредованного эн-доцитоза. Другой особенностью апо А является его свойство взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Так, ранее в НИИ биохимии было показано, что апо А связывается с эукариотической ДНК [1]. Эти предпосылки - специфическое (или слабоспецифическое) взаимодействие апо А с ДНК и рецептор-опосредованный перенос апо А в клетку - позволили нам предположить возможность использования данного белка в качестве переносчика пДНК в клети млекопитающих. Мы также предположили, что можем увеличить аффинность апо А к ДНК путем введения в структуру белка небольшого фрагмента, состоящего из повтора аминокислотных остатков лизина, положительно заряженных при нейтральном рН. Известно, что богатые лизином фрагменты гистоно-вых белков способны связываться с ДНК [6].
В связи с этим целью настоящего исследования явилось получение модифицированного апо А человека, введение в его структуру кон-
Рябченко А.В. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, e-mail: borrelia@mail.ru
Котова М.В. - младший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, e-mail: zerokiri@mail.ru
Трифонова Н.В. - младший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, e-mail: nataliya-tverdohleb@yandex.ru
Князев Р.А. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, e-mail: Knjazev_roman@mail.ru
Поляков Л.М. - д.м.н., проф., зав. лабораторией медицинской биотехнологии, e-mail: plm@niibch.ru
денсирующего ДНК фрагмента, а также изучение способности рекомбинантного белка апо ApK10 переносить пДНК в гепатоциты крыс в сравнении с белком нативной формы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для амплификации гена апо А была использована плазмида, полученная ранее в нашей лаборатории, несущая ген апо А человека [5]. Для амплификации использовали прайме -ры, представленные в таблице. ПЦР проводили на амплификаторе МС-2 («ДНК-технология», Москва) с помощью набора реагентов с Taq ДНК-полимеразой («Евроген», Россия). Состав реакционной смеси использовали согласно инструкции к набору. Для клонирования гена использовали модифицированный нами ранее вектор pET36b(+) («Novagen», США) [4]. Для модификации гена в составе плазмиды pET36b(+) по сайту XhoI на 3'-конце гена апо А был встроен дуплекс, кодирующий 16 аминокислотных остатков (а. о.), в том числе 10 а. о. лизина. Для получения дуплекса использовались олигонуклеотиды №12 и № 13 (см. таблицу). Олигонуклеотиды синтезированы ЗАО «Биосан» (Россия).
Плазмиды гидролизовали эндонуклеазами рестрикции FauND I (прототип Nde I) и Sfr274 I (прототип Xho I) согласно инструкции фирмы-производителя ферментов «СибЭнзим» (Россия). Фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле с последующим извлечением нужного фрагмента из геля набором «Cleanup Standard» («Евроген»). Фрагменты ДНК лигировали с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы согласно инструкции фирмы-производителя («СибЭнзим»). Трансформацию клеток E. coli плазмидными ДНК проводили с помощью электропорации согласно методике фирмы-производителя прибора («PeqLab», «Biotechnologie GmbH», Германия). Рекомбинантные клоны E. coli отбирали на селективной среде LB (lyso-geny broth), содержащей канамицин (30 мкг/мл).
Для трансфекции использовали плазмиду pTagGFP2-C (~4,7 тыс. пар нуклеотидов (п. н.)), содержащую ген gfp под контролем раннего промотора цитомегаловируса («Евроген»). Плазмиды нарабатывали в клетках E. coli штамм «NovaXGF» («Novagen», США) в среде LB в присутствии 30 мкг/мл канамицина, из клеток выделяли набором «PlasmidMidiprep» («Евроген»). Оценку качества плазмид, анализ фрагментов ДНК и продуктов ПЦР осуществляли методом электрофореза в 0,8-1,2%-м агарозном геле с последующим окрашиванием ДНК бромистым этидием.
Для наработки биомассы использовали клетки E. coli штамм BL21(DE3). Из отобранного клона E. coli выращивали ночную культуру в среде LB объемом 5 мл при 37 °С. На следующий день ночную культуру переносили в двухлитровую колбу с 500 мл свежей среды LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина. Клетки выращивали при активном перемешивании и 37 °С до оптической плотности D600 = 0,8-1,2 отн. ед. и добавляли индуктор изопропил^^-1-тиогалактопиранозид до 0,05 мМ. Далее клетки инкубировали 4 ч при аналогичных условиях либо 18 ч при 30 °С, после чего осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, осадок замораживали и хранили до выделения белка. Клеточные лизаты и белки анализировали в 12%-м полиа-криламидном геле (ПААГ) по Лэммли.
Рекомбинантные белки выделяли из клеток-продуцентов E. coli с помощью аффинной хроматографии на сорбенте «Ni-NTA Superflow» («Qiagen», США) в денатурирующих условиях, обессоливали методом диализа против фосфат-но-солевого буфера рН 7,4-7,5 и стерилизовали фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм («Syringe-DivenFilters», «JetBiofilm», Корея). Конъюгаты получали путем инкубирования белков с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) в течение ночи в карбонатном буфере рН 9,5 в соотношении 25 мкг ФИТЦ на 1 мг белка, от избытка метки отделяли с помощью
Таблица
Используемые в работе олигонуклеотиды
Название Структура (5'-3')
Прямой праймер № 3 Ба CTGGCAGCAAGATGATCCGCCGCAGAGC
Прямой праймер № 3 Fb TGCGCCATTTCTGGCAGCAAGATGATCC
Прямой праймер № 3 Fc TATCTTCATATGCGCCATTTCTGGCAGC
Обратный праймер № 6 R TACATCTCGAGCTGGGTGTTCAGCTTCTTAG
№ 12 (смысловой олигонуклеотид) TCGACGGCCCGGCGAAAAAGAAAAAGAAAT TAAAGAAAAAGAAAAAGC
№ 13 (антисмысловой олигонуклеотид) TCGAGCTTTTTCTTTTTCTTTAATTTCTTTTTC TTTTTCGCCGGGCCG
гель-фильтрации. Образование конъюгата подтверждали анализом на спектрофлуорофотоме-тре на наличие характерных для ФИТЦ пиков возбуждения (490 нм) и эмиссии (520 нм), а также в ПААГ. Концентрацию белков и пДНК измеряли спектрофотометрически (X = 280 и 260 нм соответственно) на спектрофотометре «Evolution 300» («Thermo Scientific», США), содержание конъюгата «апо А - ФИТЦ» - на спектрофлуо-рофотометре RF-5301PC («Shimadzu», Япония) в ЦКП «Спектрометрические измерения» на базе НИИ биохимии.
Гепатоциты крыс выделяли методом рецир-куляторной ферментативной перфузии печени с использованием 0,03%-го раствора коллагена-зы (активность > 125 ед/мг, «ICN Biomedicals, Inc», США), как описано в работе [2]. Инкубирование гепатоцитов проводили в среде RPMI-1640 («Биолот», Россия), содержащей 20 мМ HEPES, 10 % эмбриональной сыворотки коров, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл гентамицина, 5,6 мМ глюкозы, в СО2-инкубаторе («Cole-Parmer», США) в атмосфере, содержащей 5 % СО2 и 95 % воздуха, при температуре 37 °С, используя 24-луночные планшеты («Orange Scientific», США). Плотность клеток в первичной монослойной культуре составляла ~800 кл/мм2. Клетки инкубировали с комплексом «апо А - ФИТЦ» в течение 3 ч, его концентрация составляла 5, 10, 20, 40 и 80 мкг/мл. С комплексом «апо А - пДНК» клетки инкубировали в течение 4 ч, после чего меняли среду на свежую и инкубировали еще двое суток. На одну лунку наносили 1,5 мкг пДНК и различные количества апо А - 10, 20 и 40 мкг. По окончании инкубирования клетки снимали с планшетов, отмывали от среды, фиксировали 70%-м этанолом и анализировали с помощью проточной цитометрии на приборе CytoFLEX («Beckman Coulter Inc.», США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее в нашей лаборатории получен продуцент рекомбинантного белка апо А на основе клеток E. coli [5]. Эта конструкция была использована в качестве матрицы для последовательной амплификации гена с помощью пар праймеров № 3 Fа + № 6 R, № 3 Fb + № 6 R и № 3 Fс + № 6 R (см. таблицу). Это позволило ввести с 5'-конца гена фрагмент ДНК, кодирующий пептид проформы белка (Agr-His-Phe-Trp-Gln-Gln), поскольку известно, что без данного пептида уровень синтеза белка в клетках E. coli очень низок. Праймеры № 3 Fс и № 6 R в своей структуре несли сайты эндонуклеаз рестрикции Nde I
и Х^ I соответственно. Ампликон гена апо А был встроен в модифицированный нами вектор рЕТ36Ь(+) [4], при этом на 3'-конце гена апо А после сайта эндонуклеазы рестрикции Х^ I появлялась последовательность ДНК, кодирующая 8 а. о. гистидина, что позволяло в дальнейшем выделять белок с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии. При трансформации клеток было отобрано несколько клонов, положительных в ПЦР, несущих вставку гена апо А и способных синтезировать белок при индукции клеток-продуцентов 0,05 мМ изопропил-Р-О-1-тиогалактопиранозида. Последующее выделение белка апо А из этих клонов и анализ фракций в ПААГ подтвердило правильность выбора. Выход белка апо А составил около 50 мг/л культуры клеток продуцента. Один из клонов был применен для выделения пДНК, которая в дальнейшем использовалась для модификации гена апо А.
В полученную пДНК по сайту Х^ I между геном апо А и 8 а. о. гистидина был встроен дуплекс, кодирующий 16 а. о., десять из которых представляли полилизиновый фрагмент, поделенный на две части остатком лейцина (LDGPAKKKKKLKKKKK). Дуплекс был получен путем эквимолярной гибридизации оли-гонуклеотидов № 12 и № 13, при этом дуплекс образовывал «липкие концы» для встройки в плазмиду, гидролизованную по сайту рестрикции Х^ I. Клоны, несущие вставку полилизинового фрагмента в составе плазмиды, были отобраны методом ПЦР и проанализированы в ПААГ на способность синтезировать модифицированный белок апо АрК10. Часть положительных клонов была отобрана в музей и далее использовалась для наработки биомассы и выделения белка апо АрК10.
В качестве клеточной модели для проверки способности полученных рекомбинантных белков переносить пДНК использовали изолированные гепатоциты крыс. На первом этапе была изучена способность гепатоцитов поглощать апо А и апо АрК10 и оптимизированы условия реализации этого эффекта. Ранее нами продемонстрирована принципиальная способность конъюгата «апо А - ФИТЦ» проникать в гепатоциты [13]. Цитофлуориметрический анализ гепатоцитов, проинкубированных с конъюгатом «апо А - ФИТЦ», показал, что насыщение клеток конъюгатом происходило за 3 ч при концентрации конъюгата 20 мкг/мл. Доля клеток, поглотивших конъюгат, достоверно не различалась для обоих вариантов конъюгатов («апо А - ФИТЦ» и «апо АрК10 - ФИТЦ») и составляла в среднем около 80 %. При увеличении времени инкубиро-
a 6
control cells : All Events 20 mkg conjugate : All Events
FITC-A FITC-A
Рис. 1. Анализ на проточном цитофлуориметре гепатоцитов: а - инкубированных без конъюгата, б - инкубированных с 20 мкг/мл конъюгата «апо АрК10-ФИТЦ»
вания или концентрации конъюгатов доля клеток, поглощавших конъюгат, существенно не изменялась. Типичный пример цитофлуориметрическо-го анализа гепатоцитов, инкубированных с конъ-югатом и без него, представлен на рис. 1.
На втором этапе для проверки способности трансфицировать гепатоциты полученными белками клетки инкубировали с комплексами «апо А - пДНК». Инкубирование гепатоцитов с комплексами в течение 4 ч с последующим инкубированием клеток без комплексов в течение двух суток показало, что достоверного увеличения доли флуоресцирующих клеток в сравнении с контрольными клетками, инкубированными только с пДНК, не произошло. Вероятной причиной такого результата могло быть несколько факторов, в том числе недостаточно специфичное связывание белков с пДНК для формирования стабильных комплексов «апо А - пДНК».
Для проверки предположения о недостаточно специфическом связывании белков с пДНК мы исследовали взаимодействие плазмиды pTagGFP2-С с обоими вариантами апо А методом ретардации фрагментов ДНК в агарозном геле. Соотношение белок/пДНК по массе варьировало от 0,5 : 1 до 32 : 1; количество пДНК на дорожку составляло 0,5 мкг. Смеси белок/пДНК предварительно инкубировали 15-20 мин в фосфатно-со-левом буфере при комнатной температуре, затем к образцам добавляли —1/10 часть 100%-го глицерина и образцы сразу же вносили в карманы геля. В результате мы обнаружили отличия в подвижности исследуемых образцов пДНК только с модифицированным белком апо АрК10, причем
почти полная задержка пДНК в геле происходила при соотношении белок/ДНК, равном 16 : 1 (рис. 2).
Задержка пДНК в агарозном геле свидетельствует о том, что введение в структуру апо А фрагмента из 10 а. о. лизина увеличило его способность конденсировать на себе пДНК. Однако либо приобретенной аффинности к ДНК было недостаточно для переноса пДНК белком апо АрК10 в клетку, либо отрицательную роль в этом процессе играли другие факторы. В част-
123456789
Рис. 2. Анализ комплексов апо ApK10-pTagGFP2-С в 0,8%-м геле агарозы. Дорожки: 1 и 8 - контрольная пДНК pTagGFP2-С, инкубированная без апо АрК10; 2, 3, 4, 5, 6, 7 - пробы пДНК pTagGFP2-С, инкубированные с избытком апо АрК10 по массе в 1, 2, 4, 8, 16 и 32 раза соответственно; 9 - ДНК-маркер 100-1000 п. н., 2 и 3 тыс. п. н.
ности, при недостаточной защите ДНК белком нуклеиновая кислота может деградировать в инкубационной среде под воздействием нуклеаз сыворотки крови [3, 7]. Кроме того, в литературе описаны подобные результаты с пептидами, богатыми лизином или гистоновыми фрагментами размером от 30 а. о и более. Причем соотношения, при которых плазмиды полностью задерживались в карманах геля, варьировали от 1 : 0,5 до 1 : 2 [8, 10]. Поэтому вполне логично предположить, что увеличение в структуре белка апо ApK10 по-лилизинового фрагмента до 20-30 а. о. усилит его аффинность к пДНК и тем самым увеличит трансфицирующую способность.
Другими факторами низкого уровня транс-фекции клеток могли быть отсутствие в полипептиде апо ApK10 сигнала ядерной локализации, а также фрагмента, выполняющего роль фью-зогенного пептида. В литературе показано, что использование различных сигналов ядерной локализации в полипептидах-переносчиках пДНК увеличивает долю флуоресцирующих клеток в 3-5 раз [12, 14]. Кроме того, отсутствие фьюзо-генных фрагментов отрицательно сказывается на уровне трансфекции [11]. Таким образом, несмотря на то, что полученный белок апо ApK10 эффективно проникает в гепатоциты, он, как носитель нуклеиновых кислот, также должен влиять на высвобождение комплекса «белок-ДНК» из эндосом в цитоплазму, эффективно проникать в ядерный аппарат для дальнейшего запуска экспрессии генов в составе переносимых пДНК.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты в совокупности с полученными ранее данными говорят о том, что в нативной форме апо А человека не способен переносить пДНК в клетку. Однако при определенной модификации - введении полилизино-вого мотива (либо любого другого фрагмента, способного связывать нуклеиновые кислоты), сигнала ядерной локализации или фьюзогенного фрагмента - белок может быть использован как основа для конструирования переносчика нуклеиновых кислот в клетку.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Панин Л.Е., Гимаутдинова О.И., Кузнецов П.А., Величко Е.Ю., Базалук В.В. Структура сайтов взаимодействия ДНК эукариот с комплексами стероидный гормон-аполипопротеин A-I // Молекул. биология. 2007. 41. (4). 583-588.
2. Панин Л.Е. Князев Р.А., Суменкова Д.В., Гуща Р.С., Поляков Л.М. Роль аполипопротеина Е в
регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре гепатоцитов крыс // Сиб. науч. мед. журн. 2007. 27. (1). 63-66.
3. Розенкранц А.А., Уласов А.В., Сластнико-ва Т.А., Храмцов Ю.В., Соболев А.С. Использование процессов внутриклеточного транспорта для доставки лекарств в заданный компартмент клетки // Биохимия. 2014. 79. (9). 1148-1168.
4. Рябченко А.В., Караваев В.С., Беклемишев А.Б. Сравнительный структурный и иммунохи-мический анализ рекомбинантных антигенов OspC новосибирских изолятов спирохет Borrelia garinii и Borrelia afzelii // Сиб. науч. мед. журн. 2010. 30. (2). 6-12.
5. Рябченко А.В., Котова М.В., Поляков Л.М. Конструирование суперпродуцента рекомбинантного аполипопротеина А-I человека на основе клеток Escherichia coli // Сиб. науч. мед. журн. 2015. 35. (6). 16-21.
6. Соловьева В.В., Кудряшова Н.В., Ризва-нов А.А. Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки (трансфекция) с помощью гистонов и других ядерных белков // Гены и клетки. 2011. 6. (3). 29-40.
7. Canine B.F., Hatefi A. Development of recombinant cationic polymers for gene therapy research // Adv. Drug Deliv. Rev. 2010. 62. (15). 1524-1529.
8. Canine B.F., Wang Y., Hatefi A. Biosynthesis and characterization of a novel genetically engineered polymer for targeted gene transfer to cancer cells // J. Control. Release. 2009. 138. (3). 188-196.
9. Farve G., Tazi K., Le G., Bennis F., Hachem H., Soula G. High density lipoprotein3 bindings sites are related to DNA biosynthesis in the adenocarcinoma cell line A549 // J. Lipid. Res. 1993. 34. (7). 1093-1106.
10. Jung H.J., Hwang D.S., Wei Q.D., Cha H.J. Carassius auratus-originated recombinant histone H1 C-terminal peptide as gene delivery material // Biotechnol. Prog. // 2008. 24. (1). 17-22.
11. Nouri F., Wang X., Dorrani M., Karjoo Z., Hatefi A . A recombinant biopolymeric platform for reliable evaluation of the activity of pH-responsive amphiphile fusogenic peptides // Biomacromolecules. 2013. 14. (6). 2033-2040.
12. Ray M., Tang R., Jiang Z., Rotello V.M. Quantitative tracking of protein trafficking to the nucleus using cytosolic protein delivery by nanoparticle-stabilized nanocapsules // Bioconjug. Chem. 2015. 26. (6). 1004-1007.
13. RyabchenkoA.V., KotovaM.V., TverdohlebN.V., Knyazev R.A., Polyakov L.M. Production and analysis of biological properties of recombinant human apolipoprotein A-I // Bull. Exp. Biol. Med. 2015. 160. (1). 129-133.
14. Soltani F., Sankian M., Hatefi A., Ramezani M. Development of a novel histone H1-based recombinant fusion peptide for targeted non-viral gene delivery // Int. J. Prarm. 2013. 441. (1). 307-315.
STUDY OF RECOMBINANT APOLIPOPROTEIN A-I AS A CARRIER OF PLASMID DNA TO THE RAT HEPATOCYTES
Aleksandr Vladimirovich RYABCHENKO, Mariya Vladimirovna KOTOVA, Nataliya Viktorovna TRIFONOVA, Roman Aleksandrovich KNYAZEV, Lev Mikhaylovich POLYAKOV
Institute of Biochemistry 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
Purpose of the study was to obtain a modified variant of apolipoprotein A-I and studying its ability to transfer plasmid DNA into rat hepatocytes and comparison with the native form of the protein. Material and methods: gene cloning and production of recombinant proteins in E. coli, incubation of proteins in complex with plasmid pTagGFP2-C in vitro with rat hepatocytes, followed by cell analysis by flow cytometry. Results and discussion. A modified version of apo A-I (10 amino acid residue lysine added at the C-terminus of the protein) penetrated into the hepatocytes, specifically bound to the plasmid DNA, but did not transfect the plasmid into the cells.
Key words: apolipoprotein A-I, transfection, plasmid, hepatocyte.
Ryabchenko A.V. - candidate of biological sciences, senior researcher of laboratory of medical biotechnology, e-mail: borrelia@mail.ru
Kotova M.V. - junior researcher of laboratory of medical biotechnology, e-mail: zerokiri@mail.ru Trifonova N.V. - junior researcher of laboratory of medical biotechnology, e-mail: nataliya-tverdohleb@yandex.ru Knyazev R.A. - candidate of biological sciences, senior researcher of laboratory of medical biotechnology, e-mail: Knjazev_roman@mail.ru
Polyakov L.M. - doctor of medical sciences, professor, head of the laboratory of medical biotechnology, e-mail: plm@niibch.ru
