CC BY
16УДК 616.992:616-057
ИНДУКЦИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ В КЛЕТКАХ FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA WR. И ИХ СВОЙСТВА
Н.П. Журавлева, Н.П. Блинов, В.В. Семенов, А.К. Сироткин, Е.В. Зуева
НИИ Медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАП О, НИИ Гриппа РАМН, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2004
Изучены и предложены оптимальные условия, обеспечивающие выраженную репродукцию внутриклеточных вирусных частиц (ВЧ) в клетках гриба-хозяина Fusarium javankum var. radicicola. Наличие ВЧ доказано на двух штаммах гриба: «симптоматические — в виде негативных колоний (НК) или обширных зон лизиса воздушного мицелия (ВМ) на газоне гриба или поверхности гигантских колоний; электронно-микроскопически при негативном контрастировании — в виде икосаэдрических ВЧ; в уль-тратонких срезах мицелия — в виде электронноплотных частичек, локализованных в цитоплазме.
При оптимальных условиях для интенсификации репродукции ВЧ выявлены как патологические изменения морфологических свойств гриба в культуре, так и уль-траструктурные изменения клеток гриба-хозяина.
Показано также, что миковирус (MB), обладающий широким спектром литического действия (ЛА)> определен нами как полимиковирус.
Ключевые слова: лизис, миковирус (MB) гриба-хозяина Fusarium javanicum var. radicicola, негативные колонии, свойства грибных вирусных частиц (ВЧ), электронная микроскопия
THE INDUCTION OF VIRUS PARTICLES IN CELLS OF FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA WR. AND THEIR PROPERTIES
N. P. Zhuravleva, N. P. Yelinov, V. V. Semenov, A. C. Sirotcin, E. V.Zueva
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of SPb MAPE, Research Institute of influenze virus RAMS, Saint Petersburg, Russia
# Collective of authors, 2004.
I7ie optimal conditions for the virus reproduction in Fusarium javankum var. radicicola cells have been studied and offered. A presence of virus particles into fungal cells was proved with: symptomatically — in a form of negative colonies or ample zones of air mycelium’s lysis at fungal lawn or at surface of gigantic colonies; electronk-microscopically under negative contrasting in a form oficosahedral virus particles, and in ultrathin cuts of mycelium — in a form of electron-dense particles localized into cytoplasm and vacuoles of fungal cell.
Also it was shown that mycovirus possesses with broad spectrum of lytic action therefore we have determined it as the poly-mycovirus.
Key words: electronic microscopia, Fusarium javanicum var. radicicola, lysis, mycovirus, nagative colonies, properties of fungal virus particles
ВВЕДЕНИЕ
Вирусы грибов обнаружены сравнительно недавно. Интерес к ним возник в связи с их способностью индуцировать интерфероногенез, и, соответственно, защищать организм животных и человека от патогенных вирусов. Hollings впервые выделил грибной вирус из мицелия пластинчатого макромицета Agari-cus bisporus в 1962 г. [1]. Позже, в 1967-1970 гг. миковирус (MB) обнаружили у некоторых представителей микромицетов из родов Penicillium и Aspergillus, штаммы которых были фитопатогенными, а также у селекционированных производственных штаммов-продуцентов антибиотиков [2-7].
Вирусы грибов представляют собой организованные частицы величиной 20-50 нм, как правило, икосаэдрической формы (правильный двадцатигранник). Это — рибонуклеопротеиновые частицы, геном которых содержит двухспиральную РНК (дс-РНК), большей частью находящуюся внутри белкового капсида. Вирусные частицы (ВЧ) локализуются в цитоплазме и в вакуолях грибной клетки, иногда представляя собой агрегирущие частички, заключенные в мембрану.
Из немногочисленных данных в научной литературе следует, что изменение морфологии колоний микромицетов может быть обусловлено присутствием в них ВЧ [3, 8-10]. Культуры грибов, пораженные вирусом, отличаются замедленным ростом на ага-ризованных питательных средах, формой колоний с извилистым краем, измененной пигментацией ВМ при последующей его утрате. Так же показано, что у ряда грибов продукция некоторых вторичных метаболитов, включая антибиотики и токсины, зависит от присутствия в культуре ВЧ [9,11]. И тем не менее, нет однозначного ответа на вопрос — коррелируют ли определенные свойства гриба с присутствием в нем вируса?
Так, итальянские ученые отмечают, что дс-РНК ответственна за киллерную активность штаммов Saccharomyces cerevisiae, продуцирующих токсин [12]; английские исследователи доказывают обратное, что не наблюдается корреляции между содержанием дс-РНК и охратоксина у штаммов видов рода Aspergillus [13]. ‘ ' '
В 2002 г. корейские ученые при исследовании вируса у Fusarium graminearum установили, что присутствие и отсутствие дс-РНК коррелирует с изменением морфологии и развития гриба [14]. Ими же показано, что наличие дс-РНК в клетке гриба снижает вирулентность штамма и определяет низкую вирулентность микромицета.
Функции дс-РНК вирусов грибов и возможности ее использования неограниченны. Так, дс-РНК стимулирует образование антител и активирует другие механизмы иммунитета против опухолевых заболеваний [15]. дс-РНК может быть использована в качестве иммуномодулятора биологического происхождения для повышения иммуногенности антигенов [16]. В середине XX века впервые был получен препарат под названием статолон, обладающий антивирусной и интерферон-индуцирующей активностью (продуцент -Pénicillium stoloniferum) [17].
В конце XX и в начале XXI веков интерес к миковирусам «вспыхнул» вновь из-за поиска новых природных иммуномодуляторов. В настоящее время в медицинской практике широко применяют природный индуктор интерферона — ридостин — лекарственная форма дс-РНК, которая была выделена из киллерных штаммов дрожжей S. cerevisiae [18]. Ридостин обладает анти-ВИЧ активностью, аналогичной активности азидотимидина, но при значительно меньшей токсичности [19]. Он перспективен также в клинической практике при гриппе, ОРВИ, бешенстве, энцефалитах, герпесе [20].
Кроме того, ранее показано, что штаммы бактерий, актиномицетов и грибов изначально содержат вирусные частицы (без заражения извне) и способны в неблагоприятных условиях выделять вирус в окружающую среду. Это явление лизиса штаммов-проду-центов различных метаболитов опасно для производственных культур.
С учетом сказанного, изучение миковирусов и их взаимоотношений с организмами-хозяевами имеет большое научное и практическое значение.
Поскольку у большинства грибов-хозяев существование ВЧ — процесс скрытый, то большей частью миковирусные инфекции микромицетов симптоматически не выявляют, т. е. литический фактор визуально проявляется очень редко.
Ранее нами, при определенных условиях хранения селекционированных микромицетов — продуцентов аллергенов, выявлен у них литический фактор (ЛФ), способный к размножению — мы назвали его миковирусом [21].
Цель настоящих исследований — изучить свойства ВЧ гриба-хозяина Fusarium javanicum var. radici-cola ("далее — Fusarium j.v.r.), в том числе:
- выявить оптимальные условия, обеспечивающие выраженную репродукцию внутриклеточных ВЧ у гриба на агаризованной среде;
- выделить нативные ВЧ из мицелия гриба, изучить их морфологию;
- исследовать морфологию внутриклеточных ВЧ в ультратонких срезах мицелия;
- изучить влияние вируса на культурально-морфологические свойства гриба, выращенного на контрольной и опытной средах;
- исследовать ЛД MB на другие микромицеты.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования были выбраны два штамма Fusarium j.v.r.: селекционированный №69/9/6 и исходный №69, ранее изолированный с пораженной этим грибом кисти человека.
Для интенсификации репликации ВЧ и проявления их в виде НК или зон лизиса мицелия (ЛМ) на выросшем газоне и гигантских колониях микромицета на пептонно-кукурузном агаре (ПКА) подбирали подходящие для этого условия: концентрацию агара, pH среды, способы засева тест-культур, температуру и сроки выращивания штаммов.
Для выделения MB из гриба селекционированный штамм выращивали глубинным способом по стандартной методике, отфильтровывали от культуральной среды и промывали. Затем, после обработки мицелия, многократного дифференциального центрифугирования и центрифугирования осадка в градиенте сахарозы, отбирали микродозатором две четко сформировавшиеся зоны плотности 1,3 г/мл и 1,45 г/мл. Эти зоны исследовали на электронном микроскопе JEM-100SX. Образцы контрастировали по стандартной методике негативного контрастирования с использованием угольных пленок-подложек и 1,5% раствора Na соли фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) (pH — 6,7).
Для электронно-микроскопических исследований контрольные и опытные образцы мицелия обоих штаммов, выращенных на ПКА, обрабатывали по общепринятой методике: фиксация в «глутаральдегиде
— осмии» с последующей заливкой в аралдит. Срезы изготавливали на ультрамикротоме типа LKB-4, контрастировали по Рейнольдсу [22]. Материал анализировали в электронном микроскопе JEM-100 SX.
Литический спектр вируса Fusarium j.v.r. определяли методом нанесения стерильных зон лизиса на свежезасеянные газоны 10 тест-культур микромицетов, которые выращивали при оптимальных условиях для индуцирования MB на питательной среде ПКА в термостате при 28 °С в течение 5суток и 2 суток на свету при комнатной температуре. Контролем служили газоны культур, выросших в тех же условиях (без нанесения материала со стерильных зон лизиса).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенных исследований были определены сравнительно оп тимальные условия для интенсивной репликации ВЧ и их выявления. Это ПКА с 1,4% агара; pH — 4,5; засев среды — взвесью спор тест-культуры.
На рис.1 показано различное проявление АД ВЧ на рост гигантских колоний двух штаммов на ПКА в зависимости от концентрации агара. Так, колония контрольного штамма № 69/9/6 при содержании агара 2% и pH 6,5 обильно покрыта ВМ, НК отсутствуют, лизис мицелия не наблюдали, край колонии ворсистый, что характерно для штаммов грибов, содержащих ВЧ (Рис. 1а.). В опыте с селекционированным штаммом на среде с 1,4% агара и pH 6,5 ВМ большей частью лизирован по всей поверхности колонии, край колонии неровный с зонами лизиса ВМ и НК (Рис. 16). *
В контроле с исходным штаммом № 69 на среде с 2% агара и pH 6,5 колония гриба обильно покрыта ВМ, по краю колонии наблюдали слившиеся НК, образующие зоны лизиса в виде кружева, край колонии звездчатый (Рис. 1в).
В опыте с тем же штаммом на среде с 1,4% агара и pH 6,5 — рост ВМ ослабленный по сравнению с контролем (Рис.1в). Слившиеся НК в центре образуют зоны ЛМ, край колонии неровный с обилием НК (Рис. 1г).
На рис.2 показан рост газонов мицелия штаммов № 69/9/6 и № 69 и проявление АД ВЧ в зависимости от концентрации агара и pH среды.
В контроле у селекционированного штамма при концентрации агара в среде 2% и pH 6,5 газон обильно покрыт ВМ, НК отсутствуют (Рис. 2а).
В опыте с тем же штаммом № 69/9/6, но при концентрации агара 1,4% и pH 4,5, газон покрыт более рыхлым ВМ, по всей поверхности отмечены НК в основном слившиеся, образующие зоны лизиса (Рис. 26).
В контроле с исходным штаммом № 69 на среде с 2% агара и pH 6,5, в сравнении с контролем штамма № 69/9/6, газон первого покрыт ослабленным тонким ВМ; проявляются слабые зоны лизиса мицелия (Рис. 2в). В опыте со штаммом № 69 в присутствии в среде 1,4% агара и pH 4,5 газон ВМ почти полностью лизирован (Рис. 2г).
На рис. 3 продемонстрирован рост гигантских колоний штамма № 69 и проявление АД ВЧ при пассировании мицелия на среде ПКА с разными pH.
В контроле (агара — 1,4%, pH — 4,5) рост колонии гриба угнетен, по краю широкой полосой лизис ВМ, в центре — мелкие НК, слившиеся НК, образующие зоны лизиса (Рис. За).
В опыте (концентрация агара — 1,4%, pH — 4,5) при пассировании мицелия со среды, имеющей pH
4.5, на среду с тем же pH, в сравнении с контролем (Рис. За), лизис ВМ заметно усиливался. Очевидно, происходит значительная интенсификация репродукции ВЧ (Рис. Зб).
В опыте (концентрация агара — 1,4%, pH — 4,5) при пассировании мицелия со среды, имеющей pH
4.5, на питательный агар с pH 9,0, в сравнении с контролем (Рис. За), характер роста колоний гриба значительно изменялся: они имели ворсисто-звездчатый край, ВМ располагался концентрическими кругами
и был поражен многочисленными точечными НК (Рис. Зв).
В результате мы разработали оптимальные условия, обеспечивающие выраженную репродукцию внутриклеточных ВЧ на двух штаммах исследуемого гриба — в виде НК или обширных зон лизиса ВМ на поверхности гигантских колоний.
После выращивания мицелия селекционированного штамма глубинным способом образцы исследовали в электронном микроскопе. Во фракции плотностью 1,3 г/мл выявлены единичные ВЧ икосаэдри-ческой формы двух типов: I-й тип диаметром до 25 нм и 11-й тип — 53 нм (Рис. 4).
В ультратонких срезах мицелия, выращенного на агаризованных средах (Рис. 2а, б, в, г), ВЧ в виде электронноплотных частичек локализованы в цитоплазме клеток гриба. Размеры ВЧ внутриклеточных и изолированных в нативном виде, как правило, 2 типов: 23-28 нм и 40-55 нм (Рис. 5а, б).
При оптимальных условиях для репликации ВЧ выявлены изменения культурально-морфологических свойств гриба, выражающиеся в замедленном росте колоний, их малом размере, в состоянии полу-лизированности или вырастающим с неровным краем; ВМ — ослабленный с наличием НК или с пятнами зон лизиса, с измененной пигментацией, в сравнении с ростом колоний в контрольных условиях (Рис. 3 а,
б, в и Рис. 1а, в).
Культурально-морфологические свойства при росте штаммов гриба в оптимальных условиях значительно изменены — у штамма № 69 происходит почти полный лизис ВМ в сравнении с контролем (Рис. 2в, г). Размер микроспор при оптимальных условиях снижался в 1,5-1,8 раза. При этом на срезах мицелия выявлены два типа клеток: «темные» с электронноплотным содержимым и «светлые» с низкой электронной плотностью (Рис. 6). В контрольных вариантах преобладали «темные» клетки, в опытных
— «светлые». В «темных» клетках нарушений морфологии не было выявлено, ВЧ в умеренном количестве были локализованы в цитоплазме. Митохондрии немногочисленны, их структура не изменена (Рис. 7).
Для «светлых клеток» характерно снижение электронной плотности цитоплазмы; изменялась также структура митохондрий — в них уменьшалось количество крист и они были слабо выражены.
Нами изучен также спектр АД МВ на другие мик-ромицеты, составляющие банк селекционированных штаммов — продуцентов аллергенов, представленный 10 видами микромицетов (табл.).
Литический эффект выявлен в отношении 5 видов грибов из 10: Alternaría tenuis, Aspergillus clava-tus, A.fumigatus, F. javanicum, Penicillium sp. (табл.). Помимо зон AM, на газоне чувствительных к МВ культур отмечен ослабленный рост ВМ и изменение его пигментации в сравнении с контрольными газонами тест-культур без воздействия МВ (Рис. 8 а-г).
Известно, что проявление АД МВ зависит от ряда особенностей самого вируса, чувствительности к
Таблица
Спектр литического действия миковируса Fusarium javanicum var. radicicola на некоторые штаммы микромицетов-продуцентов аллергенов на пептонно-кукурузном агаре
Название тест-культур микромицетов № штамма Пептонно-кукурузный агар
без воздействия MB с воздействием МВ
контрольные условия опытные условия опытные условия
Alternarla tenuis 887/38/30 - + ++
A davatus 275/72/31 - + ++++
A. nlger 967/10 - + +
Aspergillus fumigatus 157/32/30 - + +++
Fusarium javanicum v. radicicola 69/9/6 - ++ ++++
Pénicillium notatum 1043/2/2 - - -
P. verrucosum var. cyclopium 176/1/1 - + +
P. species 1061/58/15 - - +++
Rhizopus nigricans 154/47 - + +
Rhizomucor pusillus 158/13 - + +
Условные обозначения:
контрольные условия — концентрация агара — 2,0% и pH среды - 6,0 опытные условия — концентрация агара — 1,4% и pH среды - 4,5 ++++ крупные зоны литического действия МВ +++ слившиеся негативные колонии МВ + + много негативных колоний МВ + единичные негативные колонии МВ - негативные колонии МВ отсутствуют
нему микробной культуры, состава среды и условий выращивания (температуры, аэрации).
Вирус, проявляющий АД только в отношении культуры-хозяина в адекватных условиях (состав среды, определенная концентрация агара в ней, соответствующий pH и температурные условия), является специфическим. МВ, обладающий широким спектром ЛД на другие культуры, как в наших исследованиях, можно обозначить полимиковирусом.
ВЫВОДЫ
1. Разработаны оптимальные условия, обеспечивающие выраженную репродукцию внутриклеточных ВЧ в клетках двух штаммов нитчатого гриба Fusarium javanicum var. radicicola.
2. Наличие ВЧ, или миковируса, у двух штаммов гриба впервые доказано:
- симптоматически — в виде НК или обширных зон лизиса ВМ на газоне выросшего гриба или поверхности гигантских колоний;
- электронно-микроскопически при негативном контрастировании — в виде икосаэдрических ВЧ, а также в ультратонких срезах мицелия — в виде электронноплотных частичек, локализованных в цитоплазме.
3. ВЧ в нативном виде (внутриклеточно и изолированно) представлены двумя типами и по размерам
— 23-28 нм и 40-55 нм.
4. Под влиянием внутриклеточного МВ, при оптимальных условиях для интенсификации репродукции ВЧ, выявлены патологические изменения культуральных свойств гриба и морфологических особенностей ВЧ.
5. На ряде штаммов микромицетов установлен логический спектр МВ гриба-хозяина Fusarium javanicum var. radicicola. Исследуемый MB определен нами полимиковирусом.
РЕКЛАМА ШЕРИНГ
Рис. 1. Гигантские колонии двух штаммов гриба Fusarium javanicum var. radicicola на пептонно-кукурузном агаре (ПКА) и проявление литического действия (Л.Д.) вирусных частиц (ВЧ) в зависимости от концентрации агара (к.а.) а — контроль, селекционированный штамм (с.ш,) — к.а. 2,0%; pH 6,5 б — опыт, с.ш. — к.а, 1,4%; pH 6,5
в — контроль, исходный штамм (и.ш.) — к.а. 2,0%; pH 6,5 г — опыт, и.ш. — к.а. 1,4%; pH 6,5 (фото уменьшены в 1,4 раза).
Рис. 2. Рост двух штаммов Е|,иг. на ПКА, засеянных газоном, и проявление л.д. ВЧ в зависимости от к.а. и pH среды, а — контроль, с.ш. — к.а. 2,0%;рН 6,5 б — опыт, с.ш. — к.а. 1,4%; pH 4,5 в — контроль, и.ш. — к.а. 2,0%; pH 6,5
г— опыт, и.ш. — к.а. 1,4%; pH 4,5 (фото уменьшены в 1,4 раза).
Рис. 3. Гигантские колонии исходного штамма Е}.у.п
и проявление Л.Д. при перекрестном пассировании мицелия на ПКАс разными pH
а — контроль; рост £/у.г. на ПКА — к.а. 1,4%; pH 4,5 б — опыт, перекрестное пассирование Щш. с ПКА — к.а. 1,4%, pH 4,5 на ПКА с такими же показателями для агара и pH, в — опыт, перекрестное пассирование Я/у.г. с ПКА — к.а. 1,4%, pH 4,5 на такую же среду, но с pH 9,0
Рис. 4. Изолированные ВЧ гриба-хозяина Р,}м,г, икосаэдрической формы (при негативном контрастировании в электронном микроскопе) (Х200000).
Рис. 5. Внутриклеточные В.Ч. К}м.г. в ультратонких срезах мицелия, а — в виде электронноплотных частиц (х14400), б — то же (х58000).
Рис. 6. Морфологические изменения в ультраструктуре Рис. 7. «Темные» клетки в ультратонких срезах мицелия,
«светлых» и «темных» клеток гриба-хозяина Клетки без патоморфологических изменений структуры
(обзорный снимок) (х14400). (х22700).
jf ■
X
Рис. 8. Литическое действие миковируса Fusarium javanicum v. radicicola на мицелиальные газоны некоторых микромицетов на пептонно-кукурузном агаре (ПКА) (уменьшено в 1,4 раза), а — контроль — газон штамма Aspergillus fumigatus на ПКА, к.а, 1,4%, pH среды 4,5, без воздействия MB, б — опыт — газон штамма A. fumigatus на ПКА, к.а. 1,4%, pH среды 4,5, с воздействием MB, в — контроль — газон штамма Pénicillium sp. на ПКА, к.а. 1,4%, pH среды 4,5 , без воздействия MB, г — опыт — газон штамма Pénicillium, sp. на ПКА, к.а. 1,4%, pH среды 4,5 , с воздействием MB.
ЛИТЕРАТУРА
1. Hollings М. Viruses associated with a die-back disease of cultivated mushroom // Nature.-1962.-Vol.196, №4858.-P. 962-965,
2. Ellis L.E., Kleinschmidt W.J. Virus -like particles of fraction of statolon a mould product 7/ Nature.- 1967.-Vol.215, №5101,-P. 649 — 650.
3. Banks G.T., Buck КЖ, Chain E.B. Viruses in fungi and interferon stimulation // Nature. — 1968.-Vol. 218, №5141,-P. 542545.
4. Banks G.T., Buck КW., Chain E.B. Virus — like particles in Penicillin producing strains of Pénicillium chrysogenum // Nature.-1969a.-Vol.222, №5189.-P. 89-95;.
5. Banks G.T., Buck K.W., Chain E.B. Penicillum cyaneofulvum virus and interferon stimulation // Nature.-1969b.-Vol.223, №5202.-P. 155-158.
6. Banks G.T,et al. Agents from Aspergillus foetidus // Nature.- 1970a.-Vol.227, №5257,-P- 505-507.
7. Banks G.T. et al. Antiviral activity of double-stranded RNA from a virus isolated from Aspergillus foetidus 11 Nature.-1970.-Vol.227, №5257.-P. 507-509.
8. Гаузе Г.Ф., Максимова T.C., Дудник Ю.В. и др. Новые штаммы вирусов, выделенные из плесневых грибов рода Pénicillium II Микробиология.-1971.-Т.ХЬ, Вып.З.-С. 540-543,
9. Hollngs М., Stone О.М. Viruses in fungi 11 Sci. Progr.-1969.-Vol.57, №4.-P. 371-377.
10. Гребенюк H.B., Грама Д.П. Морфологш Pénicillium funkulosum Thom., ураженного BipycoM II Мпсробюл. журн.-1971,-Г.ЗЗ, ВИП.ЗНС, 364-368.
11. Adler J. P., Mackenzie D.W. Fungal viruses: intrahyphal localization of Pénicillium stoloniferum viruses by fluozescent antibody // Abstrs. inn. Meet, Amer. Soc. Microbiol.- 1972.-Vol.72, №1.-P. 68-73.
12. Walter Magliani Stefania Conti, Mara Gerloni, Daniela Bertolotti etal. Yeast Killer System// Clin. Microbiol. Rev. -1997,-P. 369-400.
JÜ Varcga J., Rinyu E., Kevei E., Toth B., Kozakiewkz Z. Double -stranded RNA mycoviruses in species of Aspergillus sections Circumdati and Fumigati // Can-J-Microbiol.-1998.-Vol.44.-P. 569-574.
14. Chu Y.M., Jeon J.J., Yea S.J. et al. Double-stranded RNA Mycovirus from Fusarium graminearum // Appl Environ Microbiol.-2002. - Vol.68,№5.-P. 2529-2534,
15. Braun W., Nakano M. Influense of oligodeoxyribonucleotides on early events in antibody formation ,// Proc. Sog. Exp. Biol, and Med.-1965.-Vol.119, №6.-P. 701-708.
16. Елинов Н.П. Микология — на рубеже веков, на рубеже тысячелетий // Микология и фитопатология.-1995,-Т.29, №1,-С. 3-10.
17. Powell Н.М., Walcher D.M., Mast М. Antiviral action of statolon against koxaacte A 21/col virus // Antibiot. and Cheomther.-1962.-Vol.12, №5.-P. 337-341.
18. Булычев A.E., Сергеев A.H., Рыжиков А.Б. и др. Изучение динамики интерферонообрадования в организме у белых мышей при разных путях введения индуктора интерферона ридостина //Антибиотики и химиотерапия.-1998,-Т.43, №4.-С, 20-23.
19. Носик Н.Н., Носик Н.И., Кузнецов Н.В. Ингибирующее действие индукторов интерферона на размножение вируса иммунодефицита человека /,/ Вопросы вирусологии.-1992.-Т.37, №2.-С. 92-94.
20. Булычев А.Е., Гончарова Е.П., Пъянкова О.Г. и др. Некоторые аспекты интерферонообразования в организме белых мышей // Вестник Российской Академии медицинских наук. — 1998. — №4. — С, 34-37.
21. Журавлева Н.П., Зуева Е.В., Бегаева Н.Н. Спонтанное освобождение вирусных частиц при хранении селекционированных микромицетов — продуцентов аллергенов //Проблемы медицинской микологии,- 1999.-Т.1, №2.-С, 45-50.
22. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in microscopy // J. of Cell Biology.-1963.-Vol.17,-P. 208-212.
Поступила в редакцию журнала 14.09.04 Рецензент: А. А. Степанова
