CC BY
5
вполне соответствует таковой бензиднновой пробы и явно выше, чем амидопириновой, как стандартной, с 5 % реактивом, так н пробы с 20 % амндопнрнном. Яркость окрашивания быстро нарастает и в ближайшие минуты превосходит даже яркость при бензиднновой пробе. Различия интенсивности окрашивания между реакциями с азопира-Л~мом и стандартным амидопириновым реактивом статистически достоверны для исследованных концентраций гемоглобина в течение всего времени наблюдения.
Представленный реактив обладает следующими преимуществами:
— не содержит канцерогенных нли высокотоксичпых веществ, не загрязняет окружающую среду вредными продуктами, не представляет никакой опасности для работающих с ним людей;
— по чувствительности реакция с азопирамом соответствует наиболее чувствительной бензидиновой пробе и зна-читсльно-превосходит другие известные химические реакции
/на кровь^З
-—— новый хромоген не содержит труднодоступных, сложных или дорогих компонентов. Он прост в приготовлении и устойчивее при хранении, чем известный бензидиновый реактив;
— методика работы с азопирамом не отличается от общепринятой и не может вызвать затруднения у медицинского персонала.
Таким образец, предложенный реактив с двухкомпонент-ным хромогеном йожет быть использован для санитарного контроля вместо высококанцерогенного бензиднна.
В настоящее время реактив проходит испытания в ряде медицинских учреждений Ленинграда. Полученные результаты полностью подтверждают высокие рабочие качества азопирама.
Литература
1 I. Лнаненко А. А.. Гасанов М. Д., Калинина А. А.
и др. — Лаб. дело, 1984. № I. с. 19—21.
2. Бокуняеаа Н. И.— В кн.: Справочник по клиническим
лабораторным методам исследования. / Под ред.
Е. А. Кост. М., 1975, с. 276—277.
3. Вредные вещества в промышленности./ Под ред. Н. В. Лазарева, Э. П. Левиной. Л., 1976. т. 2.
с. 316—318.
4. Генин В. А. — В кн.: Профилактика профессиональных опухолей. / Под ред. Л. М. Шабада. М., 1976,
с. 57—96.
5. Иоганнсен М. Г. Реактив для определения скрытой крови. А. с. 885881 (СССР).
6. Иоганнсен М. Г —Лаб. дело, 1982. № 10, с. 21(597) — 24(600).
7. Иоганнсен М. Г., Плисс Г. Б. Определение скрытой крови с помощью высокочувствительного неканцерогенного реактива. (Метод, рекомендации). Л., 1983.
8. Линдсей Дж.— В кн.: Общая органическая химия. М.. 1982, т. 3. с. 196.
9. Липкин И. Л. — В кн.: Некоторые итоги изучения загрязнения внешней среды канцерогенными веществами/Под ред. Л. М. Шабада. М., 1972, с. 107—111.
10. Методические рекомендации по профилактике сывороточного гепатита и организации стернлизационных отделений. М„ 1979.
11. Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилении мероприятий по борьбе с внутрибольничной инфекцией. (Приказ Минздрава СССР № 720). М.. 1979.
12. Тайкманн Б.. Шрамм Т. Канцерогенные вещества. Берлин, 1976, с. 32, 81.
13. Фельдман Ю. М.. Лейбман Е. Т. — Лаб. дело, 1981, № I.e. 45.
14. Шабад Л. М. — В кн.: Профессиональный рак. М, 1981, вып. 2, с. 5—1 в.
15. Шабад Л. М.. Генин В. А. — В кн.: Профилактика профессиональных опухолей. / Под ред. Л. М. Шабада. М„ 1976, с. 9—16.
16. Boehrunger М. — Пат. 1186668, 1970 (Великобритания).
17. Holland V. R.. Saunders В. С.. Rose F. L. et al. —Tetrahedron. 1974, v. 30. p. 3299—3302.
18. IARC Working Group on Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans. Lyon, 1982, p. 57—58.
19. Rey H. G.. Wiellinger N.. Rieckmann P. — Пат. 1648840, 1970 (ФРГ).
Поступила 08.08.84
УДК $16-018.1-02:615.277.4:665.441 -092.9
Ю. В. Пашин, Л. М. Бахитова
ИНДУКЦИЯ МИКРОЯДЕР В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ ДЕЙСТВИИ БЕНЗ(А)ПИРЕНА И ГЕКСАХЛОРЦИКЛОГЕКСАНА
Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова АН СССР, Москва
Химические соединения, поступающие в окружающую среду в связи с промышленным нли сельскохозяйственным производством, образуют комплексы, мутагенное действие ^которых практически мало изучено. Имеются немногочисленные данные о том, что отдельные компоненты сложных смесей могут аддитивно или синергическн усиливать их мутагенные эффекты и, наоборот, ослаблять нли делать их генетически неактивными. Проблема таких взаимодействий особенно важна п отношении смесей, содержащих высокостабильные соединения, которые в окружающей среде мало подвержены химической и биологической деградации, в частности полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), выделиемы.х с дымом и выхлопами отработанных газов, и хлорорганическнх соединений, применяемых в сельском хозяйстве. Последние, кроме высокой устойчивости, отличаются способностью кумулироватьсп в различных объектах окружающей среды, тканях и органах животных [9]. Цитогенетнческая активность представителя этого класса соединений — гексахлорциклогсксана (ГХЦГ) — была выявлена на клетках растений [2, 6], в клетках костного мозга
[31; ГХЦГ также индуцировал прямые генные мутации по сцепленному с Х-хромосомой локусу гипоксанти«-гуанин фосфорибозилтрансферазы в культивируемых in vitro клетках китайского хомячка (I].
У многих ПАУ, типичным представителем которых является 3,4-бенз(а)пирен (БП), выявлены канцерогенные н мутагенные свойства. Осадки из воздуха загрязняют почву и водные источники БГ1, содержание которого может достигать 10 мкг/кг при фоновом уровне 1—3 мкг/кг [12].
В настоящей работе изучено in vitro и in vivo влияние ГХЦГ на уровень микроядер в соматических клетках млекопитающих, in vitro и in vivo индуцированных БП.
Для исследования индукции мнкроядер in vitro использована линия клеток китайского хомячка V-79. полученная нз Лейденского университета (Нидерланды). Препарат, содержащий 12 % ГХЦГ и БП фирмы «Флюка», растворяли в этаноле, затем разводили средой до необходимых концентраций. Взяты концентрации ГХЦГ 100 и 200 мкг/мл и БП 10, 20 и 25 мкг/мл. Обработку клеток проводили во флаконах Повнцкого в течение 2 ч в условиях метаболической
Таблица 1
Изменение числа микроядер (в "/„,) ■ культивируемых in vitro клетках китайского хомячка после введения БП, ГХЦГ или их смесей в условиях метаболической активации
Вещество Концентрация. мкг/мл Число подсчитанных клеток Число макроядер
Растворитель 5,0±0,57
(контроль) БП — 11 000
10 8 000 5,9±0,64
20 6 000 12,0±1,11*
ГХЦГ 100 2 000 9,5±0,33*
200 6 000 11,1±1,30*
БП + ГХЦГ 10+100 3 000 15±1,87*
10+200 4 000 16,5±0,64»
20+100 1 000 17±1,19»
20+ 200 2 000 17,5±1,06*
* Р<0,01 по сравнению с контролем.
активации микросомами печени мыши [4]. Обработанные клетки высевали во флаконы с предметными стеклами и после прохождения примерно 2 циклов деления фиксировали в жидкости Карнуа, окрашивали 7 % раствором Гим-зы при рН 6,8 и оценивали по критериям, предложенным для учета микроядер в лимфоцитах человека [7].
Мутагенную активность в системе in vivo определяли по числу индуцированных микроядер в энуклеированных полнхроматофильных эритроцитах костного мозга мыши [8, 11]. Учитывали микроядра, образующиеся в цитоплазме клеток из фрагментов хромосом и хроматид после действия химических мутагенов. Эксперименты выполнены на гибридных мышах (CBAXC57BL/6I)F| в возрасте 60— 80 дней с массой тела 23—25 г. Мазки костного мозга фиксировали через I, 2, 3, 4 и 7 сут. Химические вещества в подсолнечном масле вводили внутрибрюшинно: БП — в постоянной концентрации 150 мкг/мл, составляющей '/s наименьшей летальной лозы (LD0) [13], ГХЦГ в возрастающих концентрациях — 50, 100 и 200 мг/кг (1/го, '/ю н '/s LDso соответственно) в расчете на активное действующее начало. Мазки фиксировали в метаноле, промывали в бидистнлли-рованной воде, окрашивали в 7 % растворе Гимзы при рН 6,8 [5, 10].
Статистическую обработку данных проводили с применением t-критерия Стьюдента.
Как показали исследования, в системе in vitro средняя токсическая доза (ТДМ) ГХЦГ, определяемая по критерию выживаемости культивируемых клеток китайского хомячка при 2-часовой обработке, составила 200 мкг/мл, для БП — 20 мкг/мл. В результате обработки клеток ГХЦГ в дозе, равной ТДм, количество микроядер было в 2 раза выше, чем в контроле. Метаболическая активация монооксигена-
зами печени мыши существенно не меняла мутагенную активность ГХЦГ. БП в концентрации, равной Чг ТДм, индуцировал количество микроядер, незначительно превышающее контрольный уровень, а в концентрации, равной ТД$о, был превышен в 2,5 раза. При совместном действии БП и ГХЦГ выявлен аддитивный мутагенный эффект » (табл. 1). 'р
В отличие от этих экспериментов в опытах in vivo суммарный эффект двух химических веществ не превышал уровня микроядер, индуцированных одним БП (табл. 2). Однако анализ числа микроядер во времени показал, что в случае применения смесей происходят удлинение интервала, в течение которого содержание микроядер в клетках костного мозга превышает контрольный уровень, и смещение пика числа микроядер. Так, последний при действии ГХЦГ приходится на 24 ч, БП — на 48 ч и к 96 ч в обоих случаях их уровень возвращался к контрольному. При совместном действии двух химических веществ ник индукции микроядер был наибольшим к 96 ч. Через неделю после начала эксперимента он соответствовал контролю.
Таким образом, чувствительность клеток к БП на фоне действия пестицидов в дозах, при которых их собственный мутагенныл эффект не был выражен или проявился слабо, возрастала in vitro в 3 раза, a in vivo он выразился более тяжелыми повреждениями хромосом в эритробластах костного мозга, что сопровождалось увеличением числа микроядер в полнхроматофильных эритроцитах. В условиях загрязнений окружающей среды химическими веществами разных классов в концентрациях, при которых в отдельности взятые соединения не проявляют мутагенной активности или она выражена незначительно, совместное действие этих соединений может представлять определенную генетическую опасность.
Литература
1. Бахитова Л. М.. Пашин Ю В. — Гиг. и сан., 1984, № 5, с. 82.
2. Куринный А И., Пилинская М. А. — Цитол. и генет., 1974, № 4, с. 342.
3. Маркарян Д. С. — Генетика,
4. Пашин Ю. В.. Бахитова Л. М. — Бюл. 1931, № 9, с. 327.
5. Пашии Ю. В., Торопцев С. Н. — Там же, 1983, с. 72.
6. Чеботарь А. А., Суржу А. И. — В кн.: Теоретические и практические подходы к проблеме мутагенеза и канцерогенеза окружающей среды. М., 1976, с. 33.
7. Countryman Р. /., Heddle I. А, — Ниш. Genet., 1977, Bd 35, S. 197.
8. Heddle 1. А. — Mutat. Res., 1973, v. 18, p. 187.
9. Kaphalia B. S„ Husain M. M., Seth T. D. et al. — Pes-ticid. Monitoring J„ 1981, v. 15, p. 9.
10. Salamone M„ Heddle J.. Stuart E. et al. — Ibid., 1980, v. 74, p. 347.
Таблица 2
1966, № 1, с. 132.
экспер. биол.,
№ 1.
Изменение числа микроядер (в °/00) в эритроцитах костного мозга мыши после введения БП, ГХЦГ или их смесей
Вещество Доза, доли LD„ Число подсчитанных клеток Срок исследования. сут
1 2 3 7
Растворитель (контроль) _ 10 000 3,8±0,28 3,7±0,26 3,8±0,25 _
ГХЦГ V« 12 000 5,3±0,88 3,3±0,33 3±0,18 — —
Vio 12 000 5,3±0,39 2,7±0,63 2±0,3 _ —
% 12 ООО 4,3±0,28 2,2±0,41 1,7±0,3 2 ±0,31 2 ±0,28
БП 1/, лд. 12 000 6,4 ±0,88* 8,3±0,34** 5 ±0,26 5,3±0,27 3,8±0,3
1Ло LDm ГХЦГ + 1/,
ЛД„БП 20 000 2,5±0,29 5,8±0,91 6,1 ±0,99*» 7,8±0,94** 3±0,82
•Я<0,05 по сравнению с контролем, **/><0,01 по сравнению с контролем; — не определяли.
11. Schmid W. — Mutat. Res., 1975, v. 31, p. 9. 13. The Toxic Substances List 1974./Eds H. E. Christen-
12. Shabad L. M.. Cohan Y. L„ llnitsky A. P. et al. — sen, Т. T. Luginbuhl, Rockville, Maryl., 1974, p. 1—906. J. nat. Cancer Inst. (Wash.), 1971, v. 47, p. 1179. — Поступила ог.оам
УДК «14.7:615Л77.4]-07
В. А. Чудин, 3. А. Гафиева, Н. А. Кошурникова, А. П. Нифатов, В. С. Ревина
ОЦЕНКА МУТАГЕННОСТИ И КАНЦЕРОГЕННОСТИ ГЕКСАХЛОРБУТАДИЕНА
В связи с широким применением гексахлорбутадкена (ГХБД) в сельском хозяйстве и различных отраслях промышленности [1] необходима проверка этого соединения по тестам, характеризующим его мутагенность и канцероген-ность.
Имеющаяся по этому вопросу литература весьма ограничена. Известно что ГлБД в тесте Эймса при использовании штамма Salmonella typhimurium ТА-1530 не проявил мутагенности [3]. R. Kosiba и соавт. [4] установлено, что при длительном (в течение 2 лет) введении крысам ГХБД с пищей учащается развитие злокачественных опухолей почек. Недостаток указанной работы в том, что ГХБД растворяли в ацетоне, который сам по себе может быть небезразличен для организма, а проверка канцерогенности ацетона не проводилась.
Нашей задачей являлась оценка мутагенности и канце-рогенности ГХБД, для чего была исследована мутагенность ГХБД в опытах на нескольких штаммах Salmonella typhimurium, а оценка канцерогенности в опытах на крысах проведена с учетом действия вещества, в котором растворяли -f- ГХБД.
К данной работе мутагенную активность ГХБД изучали методом учета генных мутаций у микроорганизмов, используя методическое указание Института общей генетики АН СССР и НИИ по биологическим испытаниям химических соединений Министерства медицинской промышленности СССР [2].
В качестве организмов-тестеров применяли высокочувствительные штаммы ТА-1535, ТА-100 и ТА-1538 Salmonella typhimurium, в которых возникают обратные мутации от ауксотрофности по гистндину к прототрофности. Штаммы ТА-1535 и ТА-100 ревертируют к прототрофности путем замены пар оснований, а штамм ТА-1538 — по типу сдвига рамки считывания. Кроме того, штаммы имеют дополнительную мутацию, увеличивающую проницаемость клеточной мембраны, и неспособны к эксцизионной репарации. Штамм ТА-100 содержит плазмиду, которая еще более по-
Таблица 1
Результаты оценки мутагенной активности ГХБД на Salmonella tuphimurium (среднее число колоний на чашку)
Количество ГХБД
Bei метаболической Активации
на чашку, мкг I ; II ill I II III
100 10 7 39 4 18 6
10 13 6 42 _. 16 _
1 15 7 40 6 21 6
0,1 8 6 41 — 14 —
Контроль (спонтанный фон мутаций) 13 7 43 4 14 13
С метаболической активацией
вышает чувствительность объекта к действию химического вещества.
Изучено мутагенное действие как самого ГХБД, так и продуктов его возможного метаболизма. Для метаболической активации ГХБД использовали постмитохондриальный супернатант, который получали после центрифугирования в течение 15 мин при 12 000 об/мин на центрифуге ЦВР-1 при температуре 2—4 °С гомогената печени крыс-самцов Вистар, предварительно активированных фенобарбиталом.
Определяли мутагенность ГХБД в концентрациях 100, 10, I и 0,1 мкг на чашку. При выборе этих величин исходили из того, что ГХБД в данных концентрациях не проявляет бактерицидной активности. Результаты эксперимента учитывали путем сравнения среднего числа колоний-ре-вертантов на опытных и контрольных (без внесения ГХБД) чашках. На каждую дозу брали по 2—3 чашки.
Канцерогенную эффективность ГХБД исследовали на крысах-самцах Вистар с начальной массой 160—170. ГХБД, растворенный в подсолнечном масле, вводили перорально с помощью зонда по 0,2 мл на крысу через день на протя-
Таблица 2
Средняя продолжительность жизни (СПЖ) и частота опухолей у крыс при длительном пероральном введении ГХБД
Примечание. I, II, III — соответственно штаммы ТА-1535, ТА-1538 н ТА-100; — опыт с данной дозой не ставили.
Контроль ГХБД. мг/кг в день
«о • . л 5 о о о я -а ;
Показатель 1 2 О -1 а Q шЛ
В Н S х 4» з-= й> СО N > 00 3
Я о х х с; СО V uiZ* О —»
Число крыс СПЖ 90 46 41 45 43
(дни, М±ш) 675±16 721,2 609,1 642,9 691,6
±12,6 ±22,9* ±24,8 ±21,7
Число крыс с опу-
холями 80 78,2 60,9 64,4 79,1
Из них со злока-
чественными опу-
холями 17,7 28,2 17.1 24,4 34,9
Суммарная частота 109,8 141,8
опухолей 143,3 158,5 109,7
То же злокачест-
венных опухо-
лей 17,7 32,6 21,9 26,7 37,2
Частота отдельных
видов опухолей 5,5 4,3 4.6
Лейкоз 0 4,4
Лимфоретикуло- 6,6 11.6
саркома 6.6 4,3 5,0
Доброкачествен и ые
опухоли:
печени 1.1 0 0 0 7
почек 0 0 0 2,2 0
* Достоверные различия с контролем.
