CC BY
136
до 80 часов после потребления). Данный факт позволяет использовать этил глюкуронид в качестве биохимического маркера для подтверждения факта употребления алкоголя, даже если это отрицается обследуемым и когда сам этанол уже не определяется. Определению этил глюкуро-нида и этил сульфата в биологических образцах посвящен данный доклад.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В данном исследовании для приготовления калибровочных образцов и контролей качества были использованы сертифицированные стандарты анализируемых веществ с чистотой более 98%.
Иммунохроматрафический метод использовался в качестве предварительного анализа (анализатор для химико-токсикологических исследований IK 200609). Прибор калибровался по тем же модельным растворам, которые использовались при валидации метода ВЭЖХ/МС/МС. Хроматомасспектрометрический анализ выполнялся на масс-спектрометре QTRAP 4500 (AB Sciex) с хроматографом Flexar FX10 (Perkin Elmer). Было проанализировано более 30 образцов мочи от добровольцев и пациентов наркологической больницы. На основании данных исследований были получены результаты о точности измерения концентрации этил глюкуронида иммунохроматографи-ческим методом, была исследована специфичность метода.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В ходе работы была разработана и валидирована методика количественного определения этил глюкуронида в биологических образцах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спекто-метрии. Коэффициент вариации не превышает 15%, точность измерений находится в пределах 100±15% во всем диапазоне концентраций.
ВЫВОДЫ
Этил глюкуронид является чувствительным и специфичным метаболитом для определения факта потребления алкоголя. Методика определения этого метаболита имеет большие перспективы по внедрению в клиническую и экспертную практику. Сфера применения теста на этил глюкуронид обширна: тестирование пациентов, проходящих лечение от алкоголизма, или которым запрещено употребление алкоголя во время лечения, детский мониторинг употребления алкоголя, тестирование водителей и пилотов, обследование работников режимных объектов и так далее.
I Иммунные методы анализа в практике судебно-химического отдела ГБУЗ МО «БЮРО СМЭ»: 14 летний опыт применения, и есть ли у них будущее в рутинном анализе?
• В. И. Изотова, Р. Р. Краснова, О. Г. Заторкина, Н. А. Крупина
ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» МЗ МО (нач.— д.м.н., проф. В. А. Клевно) Аннотация: Доклад посвящен вопросу многолетнего применения иммунных методов анализа в практике судебно-химического отдела (СХО) ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» для обнаружения наркотических средств и психотропных веществ в моче. Рассмотрена возможность применения этих методов в рутинном анализе. Отмечено широкое использование иммуноанализа
во всех подразделениях отдела, дана положительная оценка включению его в схему судеб-но-химического анализа как предварительной стадии, с обязательным подтверждением полученных при этом результатов инструментальными, селективными хроматографическими методами анализа.
Ключевые слова: иммунные методы анализа, наркотические средства и психотропные вещества
Immunoassay methods of analysis in the forensic chemistry department of Bureau of Forensic Medicine of Moscow Region: 14 years of practical experience and whether they have a future in the routine analysis? • V. I. Izotova, R. R. Krasnova, O. G. Zatorkina, N. A. Krupina Abstract: The report focuses on the issue of long-term application of immune methods of the analysis for detection of drugs of abuse in urine in the practice of forensic chemistry department of Bureau of Forensic Medicine of Moscow Region. The possibility of application of these methods in the routine analysis is considered. Use of immunoassay in all regional divisions of the department gave a positive assessment of its inclusion in the scheme of forensic toxicology analysis as a preliminary step to mandatory confirmation of the results received thus by instrumental, selective chromatographic methods. Keywords: immune methods of analysis, addictive and psychotropic substances
ВВЕДЕНИЕ
15 лет назад судебно-химические (химико-токсикологические) исследования биологических сред человека на присутствие наркотических и психотропных веществ, проводимые в СХО ГБУЗ МО «Бюро СМЭ», стали серийными. В качестве хороших помощников в проведении серий таких исследований стали применяться иммунные методы, которые были включены в схему судебно-хими-ческого (химико-токсикологического) анализа биологических жидкостей человека как предварительные. Отмечено преимущество этих методов: их высокая чувствительность, отсутствие пробоподготовки, быстрота получения результатов, простота выполнения. Иммуноанализы охарактеризованы в отношении пороговых концентраций, которые позволяют считать пробы содержащими или не содержащими психоактивные вещества. Это важно для интерпретации результатов и соотнесения их с результатами подтверждающих инструментальных методов, более чувствительных и селективных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В нашем отделе иммуноанализ используется более 14 лет. Апробированный в центральном отделе, он был распространен во все районные судебно-химические отделения, расположенные на территории Московской области. Изначально был внедрен в практику отдела иммунофер-ментный анализ (ИФА) для проведения исследований мочи на наличие наркотических веществ группы опия (морфина, кодеина, их метаболитов и основного метаболита героина - 6-моноацетилморфина). Наборы реагентов для этого метода - отечественного производства -ДИАНАРК-О (регистрационное удостоверение № ФСР 2012/12987) рассчитаны на проведение анализа в дубликатах 46 неизвестных проб, 1 положительного и 1 отрицательного контрольного образца. Учет результатов проводится на анализаторе иммуноферментных реакций
отечественного производства «УНИПЛАН» (рег. удостов. № ФСР 2010/08123). Пороговая концентрация - 300 нг/мл. Автор характеризует используемые поликлональные кроличьи антитела к морфину как обеспечивающие специфическое взаимодействие с опиатами, не дающими перекрестных реакций с соединениями других групп наркотиков. На практике подтверждающим хроматомасс-спектрометрическим методом выявлялись как ложно-положительные, так и ложноотрицательные результаты. Процент их был невелик. К сожалению, отечественные производители предлагают ограниченный спектр тестов на другие наркотики и психотропные вещества для ИФА-метода и он не автоматизирован, т.е. преобладает ручной труд.
Наряду с иммуноферментным анализом, 12 летний стаж использования в работе имеет поляризационно-флюоресцентный иммуноанализ (ПФИА), относящийся к гомогенному типу. Этот метод, не требующий ручного труда и стадии разделения, выполнялся в центральном су-дебно-химическом отделе (ЦСХО) на анализаторе фирмы Эббот «AxSYM», снабженном автоматизированной системой анализа. На нем можно исследовать одновременно более 100 проб мочи как на отдельные вещества (опиаты, производные амфетамина, кокаин, каннабиноиды, мета-дон, призводные бензодиазепина, барбитуровой кислоты), так и на комплекс наркотических и лекарственных веществ. Компьютерная обработка в ПФИА-анализаторе обеспечивает калибровку и предотвращает ошибки оператора и системы. Использование готовых калибраторов и контролей мочи устраняет проблемы, могущие возникнуть при проведении исследований оператором. Калибровочный и контрольный материал в жидком виде на биологической матрице - моче упакован в виалы, готовые к употреблению. Калибровочная кривая строится по показаниям 6 калибраторов различных концентраций. Цифровые результаты оцениваются как полуколичественные, т.к. являются суммой концентрации вещества, его метаболита и веществ, дающих перекрестную реакцию. Список перекрестных реакций публикуется в описаниях реагентов и периодически обновляются с появлением новых веществ. ПФИА имеет ряд существенных преимуществ перед вышеуказанным методом ИФА: автоматизацию системы анализа, большую точность, стабильность метки, меньшую подверженность влиянию температуры и рН среды, характерному для фермент-субстратных отношений, а также быстроту и простоту проведения анализа. Объект исследования - моча.
В 2011 году в СХО апробирован метод иммунохро-матографического анализа (ИХА) на анализаторах для химико-токсикологических исследований «IK» 200609» с использованием диагностических реагентов (in vitro) -иммунохроматографических тестов R1 IK 200609 для химико-токсикологических исследований на вещества, вызывающие интоксикацию, наркотическое опьянение (наркотические вещества группы опия, метадон, амфетамин, метамфетамин, МДМА, кокаин, каннабиноиды, производные бензодиазепина и барбитуровой кислоты). В диагностических реагентах R1 IK 200609 (биосенсорах) для обнаружения наркотических и психотропных веществ используется технология иммунохроматографиче-ского анализа, выполняемого на синтетических мембранах. Эти токсические соединения выявляются в процессе конкурентного взаимодействия меченых антител со свободным и иммобилизованным аналитом.
Для подтверждения обоснованности полученных результатов на всех биосенсорах имеется специальный детектирующий участок (зона контроля). Отсутствие окрашивания зоны контроля свидетельствует о том, что
в данной биожидкости невозможно иммунохимическое взаимодействие и полученные результаты являются непредставительными или была нарушена процедура проведения анализа.
Обнаружение обеспечивается сравнением результата анализа исследуемого объекта с результатами международного, сертифицированного стандарта, параметры которого записаны на магнитном чипе, закрепленном на контейнере биосенсоров (сравниваются интенсивности окрашенных зон детекции).
Перед каждым измерением происходит самоконтроль анализатора за счет блока управления (процессора). Объект исследования - моча.
Одной из проблем определения токсикантов метом ИХА является кросс-реактивность, т.е возможность обнаружения в результате анализа структурно родственных соединений (при наличии их в анализируемом объекте в определенных концентрациях) и как следствие этого -получение ложноположительных результатов. Очень высоко число ложноположительных исследований мочи на наличие МДМА. Также ручной метод измерений и конструктивные особенности анализатора могут влиять на надежность результатов измерений.
ИХА-тесты обладают высокой чувствительностью, до нескольких нанограмм в мл объекта. Однако следует учитывать, что эти тесты обладают низкой селективностью и требуют обязательного подтверждения положительного результата другими высокочувствительными и селективными аналитическими методами, такими как газовая хроматография с масс-селективным детектором. Анализ выполняется быстро, но отсутствуют положительные калибраторы, сообщены только пределы обнаружения, не сообщена величина пороговой концентрации, не указано время контакта исследуемой пробы с тестовой полоской.
ВЫВОДЫ
Иммунные методы дают возможность быстро и серийно провести анализ большого количества исследуемых проб, зарегистрировать положительный или отрицательный результат и быстро передать положительные объекты на подтверждение инструментальными селективными, высокочувствительными методами. Использование этих методов в начале судебно-химического (химико-токсикологического) анализа помогает эксперту получить представление о присутствии или отсутствии психоактивных веществ в серии исследуемых объектов, правильно спланировать исследования, сократить время их проведения. Отмеченные ранее преимущества иммуноанализа: высокая чувствительность, возможность провести его непосредственно в моче без предварительной подготовки и очистки проб, использование малого количества объекта, быстрота и простота проведения, несомненно, облегчают и ускоряют работу эксперта.
С использованием иммунных методов анализа появилась возможность без применения методов изолирования токсических веществ из проб биологического происхождения исключать наркотические и психотропные вещества, а в положительных объектах проводить подтверждение и идентификацию высокоспецифическими методами. Это значительно снижает и даже исключает в случае получения отрицательного результата применение других методов анализа на определённый спектр веществ, что упрощает его проведение, исключает использование токсических растворителей, удешевляет анализ. Однако отмечена недостаточная надежность отечественных реагентов: поликлональных антител в ИФА; погрешности калибровки, отсутствие контроля положительного, отсут-
ствие информации о величинах пороговой концентрации для анализируемых веществ в ИХА.
В итоге следует отметить, что использование иммунных методов в практике судебно-химического отдела на протяжении 14 лет себя оправдало, но выявились некоторые потребности: проводить иммуноанализ не только в моче, но и в других биосредах, расширить спектр анализируемых веществ, автоматизировать системы анализа, что даст возможность получать сходимые результаты и ограничит контакт с инфицированными пробами. Для этих целей в мировой практике используются различные системы иммуноанализа, основанные на различных принципах детекции. Среди них: Architect (Abbott Diagnostics): Viva-E System, Viva-Jr System, Viva-ProE System, Viva-Twin System (Siemens); Evidence (Randox). Из преимуществ последнего - возможность работать с такими биологическими матрицами, как постмортальная кровь, печень; а также с нетрадиционным пока в России биологическим объектом - слюной лиц, находящихся в состоянии наркотического опьянения. Кроме того, этот производитель предлагает широкий набор реагентов, в том числе, на новые «синтетические каннабиноиды» и «дизайнерские наркотики».
I Определение психоактивных веществ в образцах печени и крови методом тандемной масс-спектрометрии
• А. Н. Кирюшин
ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России, Центральная химико-токсикологическая лаборатория НИИ Фармации
Аннотация: Доклад посвящен вопросам количественного определения психоактивных веществ в образцах печени и трупной крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектроме-трии. Разработана методика пробоподготовки образцов печени и крови, оптимизированы хроматографические и масспектрометрические условия анализа. Выполнена валидация методики количественного определения. Ключевые слова: печень, кровь, ВЭЖХ/МС/ МС, количественное определение
Determination of psychoactive substances in the blood and liver samples by tandem mass spectrometry
• A. N. Kiryushin
Abstract: Report focuses on quantifying psychoactive substances in the liver and blood samples using high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Sample preparation method for liver and blood samples was developed, chromatographic and mass-spectrometric assay conditions were optimized. Method of quantification analysis was validated. Keywords: liver, blood, HPLC / MS / MS quantification
ВВЕДЕНИЕ
В клинической практике для лечения различных заболеваний широко применяются лекарственные средства, обладающие психической активностью. Среди них наиболее распространены антидепрессанты, нейролептики, противосудорожные средства, антигистаминные препараты, кардиотропные и гипотензивные средства. Несмотря на то, что многие из этих препаратов отпускаются по
рецепту врача и находятся на предметно-количественном учете, они часто используются в немедицинских целях, могут являться причинами отравлений, как случайных, так и злоумышленных.
Для обнаружения лекарственных веществ в физиологических жидкостях и тканях человека требуются селективные, чувствительные методы анализа, способные обеспечить идентификацию веществ и их метаболитов с возможностью их количественного определения. Методы исследования должны обладать достаточно большим диапазоном определяемых концентраций при постоянной чувствительности. Требуются также надежные, производительные методы приготовления проб, применение которых исключало бы возможность потери целевого ана-лита и обеспечивало при этом получение воспроизводимых результатов.
Были выбраны наиболее распространенные представители целевых групп лекарственных соединений. Для них была разработана и валидированна методика идентификации и количественного определения.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В данном исследовании для приготовления калибровочных образцов и контролей качества были использованы сертифицированные стандарты анализируемых веществ с чистотой более 98%: амитиптилин, кофеин, хлорпрамазин, хлорпротиксен, циталопрам, кломипра-мин, клозапин, папаверин, верапамил, дифенгидрамин, доксиламин, десметиклозапин, норверапамил, окскарба-зепин, пропранолол, метопролол, карбазепин-10,11-эпок-сид, 4-гидроксимидазолам, мидазолам, карведилол, нортриптилин, хинин. Образцы бланковой печени для приготовления модельных смесей.
Пробоподготовка выполнялась с использованием наборов Quechers(Интерлаб), планшетов Ostro (Waters). Хроматомасспектрометрический анализ выполнялся на QTRAP 4500 (AB Sciex) с хроматографом Flexar FX10 (Perkin Elmer). Для апробации валидированной методики были использованы образцы печени и крови человека, полученные от Бюро судебно-медицинской экспертизы г. Ярославль.
ВЫВОДЫ
При выполнении экспериментальных исследований выбран наиболее эффективный метод приготовления образцов печени, основанный на модифицированном методе Quechers, степень извлечения для анализируемых веществ составила от 55% до 95% в зависимости от ана-лита. Для приготовления образцов крови была выбрана методика с использованием планшетов Ostro, со степенью извлечения от 45 до 90% и вариабельностью не более 5%. Колебания выхода веществ не превышают 6%.
Разработана и валидирована методика для количественного анализа веществ с помощью LC/MS/MS. Диапазон измеряемых концентраций составил 1-1000 нг/г для объектов печени и 1-1000 нг/мл для объектов крови. Вариабельность результатов, полученных во время валида-ции, не превышает 15% для всех анализируемых веществ, точность измерений находится в пределах 100±15% во всем диапазоне концентраций. Методика была успешно испытана на реальных образцах печени и крови человека.
