CC BY
33
• Твердофазная экстракция на обращенно-фазовых патронах AccuBond ODS C18, Agilent. (метод не содержит ограничений по концентрации аналитов, хотя содержание соэлюирующихся соединений в получаемых растворах подобно их содержанию при экстракции этилацетатом; степень экстрагируемости > 95% даже для наиболее гидрофильных аналитов).
Следует отметить, что все перечисленные способы ориентированы на упрощение пробоподготовки. Наиболее низкие пределы обнаружения могут быть получены только посредством минимизации числа метаболических форм, для чего необходима стадия деконъюгирования. Тем не менее, корректность решения аналитических задач определяется верным соотношением необходимых затрат и получаемых результатов.
Дополнительным способом увеличения количеств аналитов, попадающих в хромато-масс-спектрометриче-скую систему, может быть повышение объема вводимой пробы от обычных 1-5 до 50 мкл при условии малого содержания органических модификаторов в образцах и градиентного элюирования. Данный подход минимизирует общее время анализа, но требует обязательного наличия линии сброса элюата и предколонки, а также приводит к снижению времени жизни основной колонки.
Основные направления ионизации аналитов определяются составом элюента, а фрагментации - типом масс-фильтра. При использовании элюентов, содержащих муравьиную кислоту и не содержащих ионов аммония, наблюдали образование значительной доли натриевых ионов-аддуктов, причем для аналитов, имеющих в структуре карбоксильные группы, связанные с алифатическими остатками, их интенсивность была сравнима с интенсивностью протонированных молекул. В случае присутствия в элюенте формиата аммония доля натриевых ионов-ад-дуктов была невелика. Регистрация положительных ионов была найдена более предпочтительной даже для элюентов, в которых определяемые аналиты находятся в анионных формах (при pH водной фазы > 2.5-3). MC/MC спектры, получаемые с применением ионной ловушки, характеризуются значительным содержанием пиков ионов с высокими m/z по сравнению со спектрами, получаемыми на квадрупольных масс-фильтрах. Спектры, получаемые на масс-фильтрах одного типа, но разных производителей (Agilent и Shimadzu, тройной квадруполь) различаются незначительно при условии подбора режимов столкнови-тельной диссоциации.
Доля метаболитов фазы II по сравнению с формами фазы I в целом, определяется гидрофильностью структур последних. Так, для соединений, получивших в результате метаболических трансформаций несколько гидрофильных групп (обычно карбоксильную и гидроксильную или две гидроксильных) интенсивность хроматографических пиков конъюгатов (измеряемых с применением диодно-матричного детектора) составляла менее 10%, а для соединений с одной приобретенной гидрофильной группой (обычно карбоксильной) - более 90% от пиков форм фазы I. Данное наблюдение имеет исключения.
Дополнительным следствием представленной работы является формирование поисковых библиотек для автоматизированного обнаружения метаболитов СК в разных условиях.
ВЫВОДЫ
Обнаружение метаболитов фазы II синтетических каннабимиметиков позволяет значительно снизить время подготовки проб, и - при необходимости - добиваться весьма низких пределов обнаружения. Прямой ввод мочи приемлем для образцов со средним и высоким содержа-
нием аналитов; при необходимости получения низких порогов обнаружения необходимо концентрирование. Для увеличения чувствительности обнаружения карбок-силированных форм рекомендуется применение элюентов, содержащих соли аммония при режиме регистрации положительных ионов.
Определение этил глюкуронида методом иммунохроматографии и ВЭЖХ/ МС/МС в биологических объектах
• Н. Н. Ерощенко
ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России, кафедра аналитической токсикологии, фармацевтической химии и фармакогнозии Аннотация: Доклад посвящен рассмотрению проблемы подтверждения потребления алкоголя и определению концентрации этил глюку-ронида в биологических образцах иммунохро-матографическим методом с подтверждением методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектометрии. В докладе рассмотрена валидация аналитической методики определения этил глюкуронида методом ВЭЖХ/МС/МС в биологических образцах, а также приводится сравнение точности измерения концентрации методом иммунохро-матографии и ВЭЖХ/МС/МС. Ключевые слова: потребление алкоголя, метаболизм этанола, этил глюкуронид, этил сульфат, ВЭЖХ/МС/МС
Determination of ethyl âliicuronide in biological samples by hniminochroinatoâraphic method and HPLC/MS/MS
• N. N. Eroshchenko
Abstract: This report is devoted to the problem of confirmation of alcohol consumption and determining the concentration of ethyl glucuronide in biological samples by immunochromatographic method with confirmation by high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry. This report presents the validation of analytical methods for determining ethyl glucuronide in biological samples by HPLC/MS/MS and comparison of the accuracy of measuring the concentration by immunochromatographic method and HPLC/MS/MS. Keywords: alcohol consumption, metabolism of ethanol, ethyl glucuronide, ethyl sulfate, HPLC/ MS/MS
ВВЕДЕНИЕ
Установление факта употребления алкоголя ограничивается главным образом измерением концентрации этанола в крови, моче и его паров в выдыхаемом воздухе. Данный метод дает отрицательные результаты уже спустя сутки, лишь в отельных случаях чуть больше.
Для решения этой проблемы в течение многих лет были проведены различные лабораторные испытания и предложены биохимические маркеры (метаболиты) употребления алкоголя.
Такие метаболиты, как этил глюкуронид и этил сульфат, интересны своим длительным периодом распада (по сравнению с исходным соединением), что позволяет обнаруживать их на протяжении длительного периода времени (этил глюкуронид обнаруживается в моче вплоть
до 80 часов после потребления). Данный факт позволяет использовать этил глюкуронид в качестве биохимического маркера для подтверждения факта употребления алкоголя, даже если это отрицается обследуемым и когда сам этанол уже не определяется. Определению этил глюкуро-нида и этил сульфата в биологических образцах посвящен данный доклад.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В данном исследовании для приготовления калибровочных образцов и контролей качества были использованы сертифицированные стандарты анализируемых веществ с чистотой более 98%.
Иммунохроматрафический метод использовался в качестве предварительного анализа (анализатор для химико-токсикологических исследований IK 200609). Прибор калибровался по тем же модельным растворам, которые использовались при валидации метода ВЭЖХ/МС/МС. Хроматомасспектрометрический анализ выполнялся на масс-спектрометре QTRAP 4500 (AB Sciex) с хроматографом Flexar FX10 (Perkin Elmer). Было проанализировано более 30 образцов мочи от добровольцев и пациентов наркологической больницы. На основании данных исследований были получены результаты о точности измерения концентрации этил глюкуронида иммунохроматографи-ческим методом, была исследована специфичность метода.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В ходе работы была разработана и валидирована методика количественного определения этил глюкуронида в биологических образцах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спекто-метрии. Коэффициент вариации не превышает 15%, точность измерений находится в пределах 100±15% во всем диапазоне концентраций.
ВЫВОДЫ
Этил глюкуронид является чувствительным и специфичным метаболитом для определения факта потребления алкоголя. Методика определения этого метаболита имеет большие перспективы по внедрению в клиническую и экспертную практику. Сфера применения теста на этил глюкуронид обширна: тестирование пациентов, проходящих лечение от алкоголизма, или которым запрещено употребление алкоголя во время лечения, детский мониторинг употребления алкоголя, тестирование водителей и пилотов, обследование работников режимных объектов и так далее.
I Иммунные методы анализа в практике судебно-химического отдела ГБУЗ МО «БЮРО СМЭ»: 14 летний опыт применения, и есть ли у них будущее в рутинном анализе?
• В. И. Изотова, Р. Р. Краснова, О. Г. Заторкина, Н. А. Крупина
ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» МЗ МО (нач.— д.м.н., проф. В. А. Клевно) Аннотация: Доклад посвящен вопросу многолетнего применения иммунных методов анализа в практике судебно-химического отдела (СХО) ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» для обнаружения наркотических средств и психотропных веществ в моче. Рассмотрена возможность применения этих методов в рутинном анализе. Отмечено широкое использование иммуноанализа
во всех подразделениях отдела, дана положительная оценка включению его в схему судеб-но-химического анализа как предварительной стадии, с обязательным подтверждением полученных при этом результатов инструментальными, селективными хроматографическими методами анализа.
Ключевые слова: иммунные методы анализа, наркотические средства и психотропные вещества
Immunoassay methods of analysis in the forensic chemistry department of Bureau of Forensic Medicine of Moscow Region: 14 years of practical experience and whether they have a future in the routine analysis? • V. I. Izotova, R. R. Krasnova, O. G. Zatorkina, N. A. Krupina Abstract: The report focuses on the issue of long-term application of immune methods of the analysis for detection of drugs of abuse in urine in the practice of forensic chemistry department of Bureau of Forensic Medicine of Moscow Region. The possibility of application of these methods in the routine analysis is considered. Use of immunoassay in all regional divisions of the department gave a positive assessment of its inclusion in the scheme of forensic toxicology analysis as a preliminary step to mandatory confirmation of the results received thus by instrumental, selective chromatographic methods. Keywords: immune methods of analysis, addictive and psychotropic substances
ВВЕДЕНИЕ
15 лет назад судебно-химические (химико-токсикологические) исследования биологических сред человека на присутствие наркотических и психотропных веществ, проводимые в СХО ГБУЗ МО «Бюро СМЭ», стали серийными. В качестве хороших помощников в проведении серий таких исследований стали применяться иммунные методы, которые были включены в схему судебно-хими-ческого (химико-токсикологического) анализа биологических жидкостей человека как предварительные. Отмечено преимущество этих методов: их высокая чувствительность, отсутствие пробоподготовки, быстрота получения результатов, простота выполнения. Иммуноанализы охарактеризованы в отношении пороговых концентраций, которые позволяют считать пробы содержащими или не содержащими психоактивные вещества. Это важно для интерпретации результатов и соотнесения их с результатами подтверждающих инструментальных методов, более чувствительных и селективных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В нашем отделе иммуноанализ используется более 14 лет. Апробированный в центральном отделе, он был распространен во все районные судебно-химические отделения, расположенные на территории Московской области. Изначально был внедрен в практику отдела иммунофер-ментный анализ (ИФА) для проведения исследований мочи на наличие наркотических веществ группы опия (морфина, кодеина, их метаболитов и основного метаболита героина - 6-моноацетилморфина). Наборы реагентов для этого метода - отечественного производства -ДИАНАРК-О (регистрационное удостоверение № ФСР 2012/12987) рассчитаны на проведение анализа в дубликатах 46 неизвестных проб, 1 положительного и 1 отрицательного контрольного образца. Учет результатов проводится на анализаторе иммуноферментных реакций
