CC BY
72
e
Генетические детерминанты устойчивости к антибактериальным средствам в нозокомиальных штаммах Escherichia coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., выделенных в России в 2003—2007 гг.
С. Д. ПРЯМЧУК1, Н. К. ФУРСОВА1, И. В. АБАЕВ1, Ю. Н. КОВАЛЕВ1, Н. А. ШИШКОВА1, Э. И. ПЕЧЕРСКИХ1,
О. В. КОРОБОВА1, Е. И. АСТАШКИН1, Д. М. ПАЧКУНОВ1, А. Н. КРУГЛОВ2, Д. В. ИВАНОВ3,
С. В. СИДОРЕНКО4, Э. А. СВЕТОЧ1, И. А. ДЯТЛОВ1
1 Государственный научный центр Прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, Оболенск
2 Национальное агентство клинической фармакологии и фармации, Москва
3 Институт доклинической и клинической экспертизы лекарственных средств Росздравнадзора, Москва
4 Научно-исследовательский институт детских инфекций ФМБА, Санкт-Петербург
Genetic Determinants of Antibacterial Resistance Among Nosocomial Escherichia coli Klebsiella spp., and Enterobacter spp. Isolates Collected in Russia within 2003—2007
S. D. PRYAMCHUK, N. K. FURSOVA, I. V. ABAEV, YU. N. KOVALEV, N. A. SHISHKOVA,
E. I. PECHERSKIKH, O. V. KOROBOVA, E. I. ASTASHKIN, D. M. PACHKUNOV, A. N. KRUGLOV,
D. V. IVANOV, S. V. SIDORENKO, E. A. SVETOCH, I. A. DYATLOV
State Research Centre for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk;
National Agency for Clinical Pharmacology and Pharmacy, Moscow;
Institute for Preclinical and Clinical Drug Expertise, Moscow
Scientific Research Institute for Pediatric Infections, FMBA, St.Petersburg
Клинические изоляты энтеробактерий, выделенные в 2003—2004 гг. (n=411) и в 2005—2007 гг. (n=422), имеют высокие уровни устойчивости к цефалоспоринам III—IV поколений, а также к антибактериальным средствам других групп (аминог-ликозидам, фторхинолонам, хлорамфениколу, ко-тримоксазолу). С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) показано наличие в изолятах E.coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp. генов, кодирующих бета-лактамазы (БЛ) типов TEM, SHV, CTX-M, OXA и AmpC. Преобладающими ферментами являются БЛ CTX-M-типа, которые определены у 85% E.coli, 87% Klebsiella spp. и 38% Enterobacter spp. в первой коллекции; а также у 94% E.coli, 91% Klebsiella spp. и 38% Enterobacter spp. — во второй. Среди них идентифицированы гены, принадлежащие к трём подтипам: blaCTX-M_1 (228 blaCTX-M_15 и шесть Ь1йстХ-М-3 — в первой коллекции; 275 blaCTX-M-15, три blaCTX-M-3 и один blOCTX-M-22 — во второй), blaCTX-M-2 (один blaCTX-M-5 в первой коллекции; один blaCTX-M-2 — во второй), blaCTX-M-9 (17 blaCTX-M-14 и один blaCTX-M-9 в первой коллекции; семь blaCTX-M-14 и один blaCTX-M-9 — во второй). Три изолята в первой коллекции и один изолят во второй имели два гена разных кластеров — blaCTX-M-15 и blaCTX-M-14 — одновременно. Высокие уровни ассоциативной устойчивости изученных изолятов к ципрофлоксацину, ко-тримоксазолу, гентамицину, амикацину и хлорамфениколу связаны с наличием кассет устойчивости aadAl, aadA2, aadA5, aadB, aacA4, aac(6)Ib; dfrAl, dfrA5, dfrA12, dfrA17, cmlAl, ereA2 и catB8в составе интегронов
1 класса, а также кассет устойчивости dfrAl, satl и aadAl — в составе интегронов 2 класса.
Ключевые слова: нозокомиальные изоляты, устойчивость к антибиотикам, гены ЫаСТХ_м, интегроны, генные кассеты.
Nosocomial bacterial Isolates collected within 2003—2004 (n=411) and 2005—2007 (n=422) were highly resistant to cephalosporins III—IV and antibacterials of other groups (aminoglycosides, fluoroquinolons, chloramphenicol, and co-tri-moxazole). Genes encoding TEM, SHV, CTX-M, OXA-2, and AmpC types of beta-lactamases (BLs) in the E.coli, Klebsiella spp., and Enterobacter spp. isolates were detected using polymerase chain reaction (PCR). Prevalent CTX-M-type BLs were detected in 85% of the E.coli, 87% of the Klebsiella spp., and 38% of the Enterobacter spp. isolates of the first strain collection and in 94% of the E.coli, 91% of the Klebsiella spp., and 38% of the Enterobacter spp. isolates of the second one. Genes belonging to three subtypes of blaCTX_M genes were identified: blaCTX_M-1 (228 blaCTX_M_15 and six blaCTX-M-3 of the first strain collection; 275 blaCTX_M_15, three blaCTX_M_3, and one blaCTX_M_22 of the second one), blaCTX_M_2 (one blaCTX_M_5 of the first strain collection and one blaCTX_M_2 of the second one), blaCTX_M_9 (17 blaCTX_M_14 and one blaCTX_M_9 of the first strain collection; seven blaCTX_M_14 and one blaCTX_M_9 of the second one). Three isolates of the first strain collection and one isolate of the second one carried two genes belonging to two different subtypes i. e. blaCTX_M_15 and blaCTX_M_14 simultaneously. The bacterial isolates had high levels of associative resistance to ciprofloxacin, co-tri-moxazole, gentamicin, amikacin, and chloramphenicol associated with the resistance gene cassettes aadAl, aadA2, aadA5, aadB, aacA4, aac(6')Ib; dfrAl, dfrA5, dfrA12, dfrA17, cmlAl, ereA2, and catB8 in the class 1 integrons and the resistance gene cassettes dfrAl, satl, and aadAl in the class 2 integrons.
© Коллектив авторов, 2010 Key words: nosocomial isolates, antibacterial resistance,
blaCIX_Mgenes, integrons, gene cassettes.
Адрес для корресповденции: 142279 Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ГНЦ ПМБ
О
Є
Проблема лекарственной устойчивости (ЛУ) микроорганизмов, являющихся возбудителями нозокомиальных инфекций, к основным антибактериальным средствам, применяемым для лечения инфекционных осложнений в стационарах, является актуальной во всём мире [1]. Бактерии семейства БпІегоЬасІегіасеае составляют значительную часть в этиологической структуре нозокомиальных инфекций. Одним из наиболее распространённых механизмов приобретения ЛУ у них является продукция бе-та-лактамаз расширенного спектра (БЛРС). В последнее десятилетие наиболее часто встречающимся, эпидемически распространившимся по всему миру, стал СТХ-М тип БЛРС, включающий в себя ферменты, обеспечивающие микроорганизмам устойчивость к цефалоспоринам расширенного спектра действия [2]. Эти ферменты — яркий пример эволюции белков за счёт накопления точечных мутаций, отбора наиболее удачных форм на фоне селективного давления антибиотиков, с последующим глобальным распространением среди бактериальных патогенов, благодаря локализации генетических детерминант на плазмидах [3]. Интересно, что в разных географических регионах преимущественное распространение получили разные ферменты СТХ-М, относящиеся к одному из пяти известных подтипов (СТХ-М-1, -2, -8, -9 и -25). Например, в Польше распространился СТХ-М-3 [4]; в Испании — СТХ-М-9 и СТХ-М-14 [5]; в Аргентине — СТХ-М-2 [6]. Наиболее важным в эпидемическом плане ферментом, преобладающим во многих странах мира, общепризнанна бета-лактамаза СТХ-М-15 [7].
В России нозокомиальные штаммы энтеробактерий — продуценты БЛРС впервые были описаны в 1997—1998 гг. Эйдельштейном М. В. с соавт. [8]. По данным авторов, доля БЛРС-про-дуцентов составляла в среднем 15,8% среди штаммов E.coli и 60,8% — среди штаммов К.рпеи-moniae, сильно варьируя в разных стационарах. При этом гены Ь1аСТХ.М были определены в геномах 35,9% БЛРС-позитивных E.coli и 34,9% БЛРС-позитивных К.рпеитотае. Подавляющее большинство генов принадлежало кластеру Ь1аСТХ_ш_1, в том числе более 70% генов идентифицированы как ЬЮ-ст^.^, а остальные — как Ь1юстх.ш.3. Был также обнаружен ген Ь1юстх.м.5, принадлежащий кластеру Ь1юстх.м.2; однако генов из кластеров Ь1юстх.м.8 и Ь1юстх.м.9 обнаружено не было.
В более поздней работе Сидоренко С. В. с соавт. [9] были охарактеризованы госпитальные штаммы продуцентов БЛРС семейства БпІегоЬасІегіасеае, выделенные в РФ в 2002—2003 гг. Авторами отмечена более высокая доля штаммов, несущих гены Ь1юстх.м, чем в предыдущей работе, а именно 51,2%. Кроме того, было показано, что зачастую в одном
штамме содержатся одновременно бета-лактамазы разных типов (CTX-M, TEM и SHV) в различных сочетаниях.
Целью настоящего исследования являлось изучение молекулярно-генетических механизмов формирования ЛУ в нозокомиальных изолятах энтеробактерий, выщеленных в стационарах РФ в период 2003—2007 годов. Ранее нами было показано, что бактерии семейства Enterobacteriaceae составляли в эти годы около 20% от общего количества инфекционных агентов, выделяемых в разнопрофильныж клиниках. Доля продуцентов БЛРС среди них составляла от 17 до 20% в разные годы данного периода времени [10].
Материал и методы
Изоляты бактерий. Две коллекции независимо полученный нозокомиальных изолятов Enterobacteriaceae собраны в 2003—2004 гг. (n=411) из разнопрофильных стационаров 15 городов РФ: Владивосток (n=9), Воронеж (n=10), Екатеринбург (n=16), Иркутск (n=68), Казань (n=8), Краснодар (n=31), Магнитогорск (n=3), Москва (n=73), Омск (n=33), Ростов-на-Дону (n=5), Санкт-Петербург (n=65), Саратов (n=14), Томск (n=25), Уфа (n=6), Ярославль (n=45); а также в 2005—2007 гг. (n=422) из 12 разнопрофильных клиник Московской медицинской академии (ММА) им. И. М. Сеченова. Видовую принадлежность изолятов проводили с помощью идентификационной системы BBL Crystal™ E/NF (Becton, Dickinson, США) и коммерческих панелей в автоматической системе идентификации Micro Scan (DadeBehring, США). Бактериальные культуры хранили в 20% глицерине при -70°C.
Определение чувствительности к антибиотикам. Минимальные подавляющие концентрации (МПК) антибактериальных субстанций ампициллина, цефуроксима, цефоксити-на, цефотаксима, цефтазидима, цефепима, азтреонама, меропенема, гентамицина, амикацина, доксициклина, ци-профлоксацина, хлорамфеникола и ко-тримоксазола (Merck, США) определяли методом микроразведений в бульоне Mueller-Hinton (Difco, США) на 96-луночныгх планшетах производства инновационно-технологического института (Москва, РФ), в соответствии с указаниями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [11], рекомендациями European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing [12] и с методическими указаниями Роспотребнадзора РФ [13]. Тест на БЛРС проводили с помощью метода двойных дисков [13]. В качестве внутренних стандартов использовали чувствительный штамм E.coli ATCC 25922 и высокоустойчивый штамм E.coli ATCC 35218.
Определение генов устойчивости методом ПЦР проводили, используя специфические праймеры на гены Watem [15],
blaOXA-2 [16L blaCTX-M [8L blaDHA, h^MIR blaLAT, blaMOX [17L aac(6')-Ib, qnrA, qnrB, qnrS [18]. Кроме того, ген blaSHv определяли по наличию продукта размером 721 п. н. с помощью прямого праймера (5'-TTATCTCCCTGTTAGCCACC-3') и обратного праймера (5'-TGCTTTGTTATTCGGGCCAA-3'). Интегроны определяли по наличию генов интеграз классов 1 и 2 [19, 20] и интегронных вставок [21]. В качестве матрицы ДНК использовали бактериальные лизаты, которые готовили из ночной культуры прогревом при 95°C, как описано J. K. Rasheed и соавт. [15]. Реакцию ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 5 дМ каждого праймера, 0,7 ед. Taq-полимеразы (Fermentas, Литва) и 2 мкл лизата — на приборе GradientPalmCycler (Corbert Research, Австралия) при следующих условиях: начальная денатурация при 95°C в течение
2 мин; 30 циклов, состоящих из денатурации при 95°C (30 с), отжига при 51—60°C (в зависимости от праймеров) в тече-
e
ние 30 с, элонгации при 72°C в течение 30—40 с (в зависимости от ожидаемого размера ПЦР-продукта); завершающая элонгация при 72°C в течение 7 мин.
Результаты и обсуждение
Две коллекции независимо полученных нозокомиальных изолятов бактерий семейства Enterobacteriaceae, выделенных в 2003—2004 гг. («=411) и в 2005—2007 гг. (n=422), отобраны по фенотипу устойчивости к одному или нескольким цефалоспоринам III—IV поколений, либо по наличию позитивного теста на БЛРС, поскольку именно беталактамные антибиотики являются наиболее часто используемыми препаратами при лечении инфекций, вызванных данными бактериями. Преобладающими видами в обеих коллекциях были Klebsiella spp. (32 и 35% соответственно), Escherichia coli (32 и 30%) и Enterobacter spp. (19 и 23%); остальные виды в сумме составляли 17 и 12% соответственно (табл. 1). Основными источниками выделения изолятов E.coli были моча (49%), органы дыхания (18%) и хирургические раны (17%); изоляты Klebsiella spp. преимущественно выделены из мочи (38%), органов дыхания (19%), хирургических ран (14%) и жёлчи (11%), а изоляты Enterobacter spp. — из мочи (40%), органов дыхания (18%), хирургических ран (18%), жёлчи (5%) и внешней среды (5%). Анализ уровней устойчивости изолятов к цефалоспоринам III—IV поколений с учётом новых пограничных
концентраций цефотаксима (МПК>2 мг/л), цеф-тазидима (МПК>8 мг/л) и цефепима (МПК>8 мг/л), опубликованных на сайте EUCAST [12], показал, что к цефотаксиму устойчивы 100% E.coli и Klebsiella spp. и более 92% Enterobacter spp.; к цефтазидиму — более 70% изолятов всех трёх видов энтеробактерий; к цефепиму — около 75% E.coli и Klebsiella spp. и более 50% Enterobacter spp. Отмечена тенденция к увеличению доли устойчивых изолятов за данный период времени по отношению к цефтазидиму и цефепиму. При этом доля изолятов, имеющих наивысший уровень устойчивости (МПК>256 мг/л), значительно возросла для всех трёх цефалоспоринов III—IV (рис. 1). Отмечено, что многие изоляты проявляли устойчивость к двум и даже трём цефалоспоринам одновременно. Доля именно таких изоля-тов значительно увеличилась в течение 2003—2007 гг. Например, устойчивыми одновременно к цефотаксиму, цефтазидиму и цефепиму (МПК>2/8/8 мг/л) в 2003—2004 гг. были 64% E.coli, 56% Klebsiella spp. и 35% Enterobacter spp., а в 2005—2007 гг. — 80, 87 и 66% соответственно (рис. 1А). Аналогичная тенденция отмечена для изолятов, имеющих наивысший уровень устойчивости (МПК>256 мг/л) к двум и трём цефалоспоринам одновременно. Например, высокоустойчивыми одновременно к цефотаксиму и цефепиму в 2003—2004 гг. были 12% E.coli, 27%
Рис. 1. Доля клинических изолятов E.coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., устойчивых (МПК>2/8/8 мг/л) и высокоустойчивых (МПК>256 мг/л) к цефотаксиму (CTX), цефтазидиму (CAZ) и цефепиму (CEP), среди изолятов, выделенных в 2003—2003 гг. и в 2005—2007 гг.
CTX* - включая CTX+CAZ, CTX+CEP и CTX+CAZ+CEP; CAZ* - включая CTX+CAZ, CAZ+CEP и CTX+CAZ+CEP; CEP* - включая CTX+CEP, CAZ+CEP и CTX+CAZ+CEP.
Рис. 2. Доля клинических изолятов E.coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., устойчивых (МПК>16/>64/>4/ >32/>4/76 мг/л) и высокоустойчивых (МПК>256/>256/>256/>256/>16/34 мг/л) к гентамицину (Gen), амикацину (AMI) ципрофлоксацину (CIP), хлорамфениколу (CM) и ко-тримоксазолу (CTZ).
МЛУ-3* - устойчивость к трём классам антибиотиков (цефалоспоринам, амикацину и ципрофлоксацину); МЛУ-5* -устойчивость к пяти классам антибиотиков (цефалоспоринам, амикацину, ципрофлоксацину, хлорамфениколу и ко-
тримоксазолу).
Klebsiella spp. и 10% Enterobacter spp., а в 2005—2007 гг. — 53, 38 и 44% соответственно (рис. 1Б).
Значительная часть изучаемых изолятов проявляла ассоциативную устойчивость к антимикробным препаратам других классов (не беталактамам): гентамицину, амикацину, ципрофлоксацину, ко-тримоксазолу и хлорамфениколу. Cравнение фенотипов E.coli, выделенных в 2003—2004 гг. и в 2005—2007 гг., показало, что доля изолятов, устойчивых к ци-профлоксацину (МПК>4 мг/л) и ко-тримокса-золу (МПК>4/7б мг/л), в обеих коллекциях одинакова, а изолятов, устойчивых к гентамицину (МПКМб мг/л), амикацину (МПК>б4 мг/л) и хлорамфениколу (МПК>32 мг/л), — несколько выше в первой коллекции (рис. 2А). Но при этом доля изолятов, высокоустойчивых (МПК>25б мг/л) к гентамицину и ципрофлоксацину, напротив, во второй коллекции выше, чем в первой (рис. 2Б). Cравнение фенотипов Klebsiella spp. показало, что доли устойчивых изолятов несколько выше в первой коллекции, чем во второй: к гентамицину, амикацину и ко-тримоксазолу, но ниже к ципрофлоксацину, и одинаковы — к хлорамфениколу. Доли изоля-
тов Klebsiella spp., высокоустойчивых к хлорамфениколу и к ципрофлоксацину, в первой коллекции ниже, чем во второй (рис. 2). Доли изолятов Enterobacter spp., устойчивых к ряду антибиотиков, во второй коллекции выше, чем в первой: к гентамицину, амикацину и ципрофлоксацину, в то время как для других антибиотиков (хлорамфениколу и ко-три-моксазолу) соотношение обратное. Доля высокоустойчивых изолятов Enterobacter spp. в первой коллекции ниже, чем во второй, для всех маркеров ассоциативной устойчивости, кроме хлорамфеникола (рис. 2). Таким образом, для E.coli и Klebsiella spp. отмечена тенденция к снижению ассоциативной устойчивости, а для Enterobacter spp. — к её повышению. Аналогично, доля изолятов, одновременно устойчивых к трём классам антибиотиков — цефалоспоринам, амикацину и ципрофлоксацину — (МЛУ-3), а также к пяти классам антибиотиков — цефалоспоринам, амикацину, ципрофлоксацину, хлорамфени-колу и ко-тримоксазолу — (МЛУ-5), уменьшилась для E.coli и Klebsiella spp. и увеличилась для Enterobacter spp (рис. 2).
-е-
e
Таблица 1. Видовой состав возбудителей нозокомиальных инфекций, выделенных в 2003—2004 гг. и 2005-2007 гг.
Виды микроорганизмов Количество изолятов. %
2003-2004 гг. 2005-2007 гг. всего
Klebsiella spp. 131(32) 146 (35) 277 (33)
Escherichia coli 133(32) 126 (30) 259 (31)
Enterobacter spp. 77 (19) 97 (23) 174 (21)
Proteus spp. 33 (8) 16 (4) 49 (6)
Citrobacter spp. 11 (3) 18 (4) 29 (3)
Serratia spp. 15 (4) 6 (1) 21 (3)
Morganella spp. 8 (2) 9 (2) 17 (2)
Salmonella enterica 3(0,7) 0 3(0,4)
Providencia stuartii 0 2 (0,5) 2 (0,2)
Hafnia alvei 0 1 (0,2) 1 (0,1)
Kluyvera ascorbata 0 1 (0,2) 1 (0,1)
Итого 411 422 833
Методом ПЦР в геномах изучаемых клинических изолятов показано наличие генов бета-лак-тамаз, принадлежащих к разным структурным классам ферментов [22]: TEM, SHV, CTX-M, OXA и AmpC. Гены blaTEM обнаружены в 60% E.coli, 45% Klebsiella spp. и 60% Enterobacter spp.; гены blaSHV — в 80% изолятов Klebsiella spp. и 20— 30% изолятов E.coli и Enterobacter spp. Наибольшее распространение получили гены blaCTX-M, присутствующие в 90% изолятов E.coli и Klebsiella spp., а также в 40% Enterobacter spp. Гены, кодирующие бета-лактамазы AmpC-типа, обнаружены в изолятах Enterobacter spp. и Klebsiella spp.: blaMIR
(n=13), blaDHA (n=11), blaLAT (n=1), blaMox (n=1). Гены blaOXA-2 обнаружены в двух изолятах — E.coli и Klebsiella spp. (табл. 2). Некоторые изоляты несут по одному из тестируемых генов бета-лакта-маз, но большинство имеют одновременно два или три гена в разных сочетаниях: 68% E.coli, 83% Klebsiella spp. и 44% Enterobacter spp. Доля штаммов, имеющих не один, а несколько генов БЛРС разных типов, в работе Сидоренко С. В. с соавт. [9] составляла около 40%, т. е. с течением времени произошло существенное увеличение данного показателя. Самыми распространёнными комбинациями генов в нашем исследовании оказались
Таблица 2. Гены бета-лактамаз, присутствующие в геномах нозокомиальных изолятов E.coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., выделенных в 2003—2004 гг. и 2005—2007 гг.
Гены бета-лактамаз
Количество изолятов. %
E.coli Klebsiella spp. Enterobacter spp.
2003-2004 n=133 2005-2007 n=126 2003-2004 n=131 2005-2007 n=146 2003-2004 n=77 2005-2007 n=97
TEM 5 (4) 3 (2) 1 (1) 1 (1) 12 (16) 22 (23)
SHV 0 1 (1) 5 (4) 2 (1) 6 (8) 3 (3)
CTX M 35 (26) 42 (33) 14 (11) 16 (11) 7 (9) 5 (5)
TEM+SHV 9 (7) 0 9 (7) 7 (5) 10 (13) 11 (11)
TEM+CTX-M 70 (53) 63(50)# 10 (8) 2 (1) 20 (26) 13 (13)
SHV+CTX-M 8 (6) 3 (2) 44 (34) 65 (45)# 2 (3) 5 (5)
TEM+SHV+CTX-M 11 (8) 11 (9) 43 (33) 50 (34) 2 (3) 14 (14)
Нет генов 6 (5) 3 (2) 0 3 (2) 20 (26) 24 (25)
Всего TEM 84 (63) 77 (61) 66 (50) 60 (41) 44 (57) 60 (62)
Всего SHV 28 (21) 15 (12) 104 (79) 124 (85) 18 (23) 33 (34)
Всего CTX-M 113 (85) 119 (94) 114(87) 133 (91) 29 (38) 37 (38)
CTX-M-15* 94 (71) 109 (87) 107 (82) 130 (89) 11(14) 36 (37)
CTX-M-3* 2 (2) 0 4 (3) 3 (2) 16 (21) 0
CTX-M-22* 0 0 0 0 0 1 (1)
CTX-M-2** 0 1 (1) 0 0 0 0
CTX-M-5** 0 0 0 0 1 (1) 0
CTX-M-9*** 0 1 (1) 0 0 1 (1) 0
CTX-M-14*** 15 (11) 7 (6) 2 (2) 0 0 0
CTX-M-15&14 2 (2) 1 (1) 1 (1) 0 0 0
Всего AmpC 0 0 13 0 0 13
DHA 0 0 11 0 0 0
MIR 0 0 2 0 0 11
MOX 0 0 0 0 0 1
LAT 0 0 0 0 0 1
Примечание. . # - один изолят из данной группы дополнительно содержит ген Ь1а0
* - фермент относится к
подтипу СТХ-М-1; ** - фермент относится к подтипу СТХ-М-2, *** - фермент относится к подтипу СТХ-М-9. АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2010, 55: 9-10
e
Таблица 3. Интегроны 1 и 2 классов и интегронные вставки, обнаруженные в геномах нозокомиальных изо-лятов E.coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., выделенных в 2003—2007 гг.
Гены интеграз Размер ПЦР- Количество изолятов, % Номер в GeneBank
и интегронные продукта, E.coli Klebsiella spp. Enterobacter spp.
вставки п. н. 2003-2004 2005-2007 n=133 n=126 2003-2004 2005-2007 2003-2004 2005-2007 n=131 n=146 n=77 n=97
inti 483 45 64 9 58 47 65
aadAl 1009 52 — 5 1 3 GQ924774; GQ924775; GQ924776; GQ924777
aadA2 1009 — 1 — — * — GU001948
aadB 745 — 1 1 4 * 4 GQ924772; GQ924773
aacA4-cmlA1 2360 12 — — * — HM043570; HM043571
aac(6')Ib-orfD 1173 —— 6 3 —* 1 GQ924771
dfrAl-aadAl 1586 1— — 1 —* 1 GQ924770
dfrA5-ereA2 2097 —2 — 2 —* — GQ924768
dfrA17-aadA5 1664 20 11 1 11 —* 4 GQ896490; GQ896491; GQ896492; GQ896493; GQ896494; GQ896495; GQ896496; GQ896497; GQ896498; GQ896499; GQ896500; GQ896501; GU055937
dfrA12-orß-aadA2 1913 7 13 1 1 —* 3 GQ924762; GQ924763; GQ924764; GQ924765; GQ924766; GQ924767; GU001949; HM043572; HM043573; HM043574
orfD-aacA4-catB8 2100 —1 — — —* —
int2 788 2 13 7 10 7 11
dfrAl-satl-aadAl 2216 2 13 7 8 7 3 HM043575; HM043576; HM043577
Примечание. «—» - данная интегронная вставка не обнаружена; «—*» - нет данных.
blaTEM+bla ctx-m для E.coli (n 133; 51%) и blaSHV+blaCTX-M — для Klebsiella spp. (n=109; 39%), что также значительно превышает аналогичные оценки в исследовании Сидоренко С. В. с соавт. [9]. Именно в этих категориях изолятов выявлены два изолята, продуцирующие дополнительно бе-та-лактамазу OXA-2. Наиболее распространёнными комбинациями генов для Enterobacter spp. были blaTEM и blaTEM+bla ctx-m (n 24; 14% и n 23; 13% соответственно). Таким образом, можно констатировать, что доля CTX-M-продуцирую-щих штаммов среди общего количества БЛРС-продуцентов в клиниках России в 2003—2007 гг. (табл. 2) значительно возросла по сравнению таковой в 1997—1998 гг. (35,9% E.coli и 34,9% K.pneumoniae [8]) и с таковой в 2002—2003 гг. (51,2% [9]).
Интересно отметить, что ни одного из тестируемых генов БЛ не выявлено в 26 изолятах первой коллекции (6%) и в 30 изолятах второй коллекции (7%), большинство из которых являются изолятами Enterobacter spp. Очевидно, что устойчивость данных микроорганизмов к антибиотикам обеспечивается какими-то другими молекулярными механизмами, чем у большинства E.coli (n=232; 90%) и для Klebsiella spp. (n=247; 89%), у которых основным механизмом является наличие БЛРС CTX-M-типа (табл. 2). Хотя часть изолятов Enterobacter spp. также имеет ферменты
CTX M-типа (n=66; 38%), для бактерий данного вида в большей степени характерно наличие эф-флюксных систем, нарушение проницаемости мембран за счёт мутаций в генах пориновых белков, а также наличие индуцибельных ферментов AmpC-типа [23].
Методом ПЦР-ПДРФ анализа, а также с помощью секвенирования генов blaCTX-M в изолятах
E.coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp. показано, что данные гены принадлежат к трём подтипам (кластерам): blaCTX_M_1 (234 изолята в первой коллекции и 279 изолятов — во второй), blaCTX-M-2 (по одному изоляту в первой и во второй коллекциях), blaCTX-M-9 (18 изолятов в первой коллекции и восемь изолятов — во второй). Кроме того, три изолята в первой коллекции и один изолят во второй имели два гена разных кластеров — blaCTX-M-1 и blaCTX_M_9 — одновременно. Внутри кластера blaCTX-M-1 наиболее распространённым оказался ген blaCTX-M-15 (228 изолятов в первой коллекции и 275 изолятов — во второй); реже идентифицирован ген — blaCTX-M-3 (шесть изолятов в первой коллекции и три — во второй). В кластере blaCTX-M-2 определены blaCTX-M-5 в первой коллекции и blaCTX-M-2 — во второй. В кластере blaCTX-M-9 идентифицированы 17 генов blaCTX-M-14 в первой коллекции и семь — во второй, а также по одному гену blaCTX-M-9 в первой и во второй коллекциях. В случае одновременного присутствия в изоляте генов двух раз-
ных кластеров эти гены соответствовали blaCTX_M_15
И blaCTX-M-14 (табл. 2).
Отмеченная выше ассоциативная устойчивость изучаемых клинических изолятов к нескольким классам антибактериальных средств одновременно объясняется наличием в их геномах детерминант устойчивости к аминогликози-дам (гены аденилилтрансфераз aadAl, aadA2, aadA5, aadB; аминогликозидацетилтрансфераз aacA4, aac(6')-Ib); сульфаниламидам (гены дигид-рофолатредуктаз dfrAl, dfrA5, dfrA12, dfrA17), к хлорамфениколу (ген протонного эффлюксного насоса cmlAl и хлорамфениколацетилтрансфера-зы catB8), к эритромицину (ген эритромицинэс-теразы ereA2), к стрептотрицину (ген стрептотри-цинацетилазы satl) — в виде генетических кассет в составе интегронных вставок. Показано значительное увеличение за период 2003—2007 гг. показателя распространённости интегронов 1 класса среди изолятов E.coli (с 34 до 51%), Klebsiella spp. (с 7 до 40%) и Enterobacter spp. (с 62 до 67%) (табл. 3). Присутствие интегронов 2 класса находится на значительно меньшем уровне, но тенденция к нарастанию также имеет место: с 2 до 10% у E.coli, с 5 до 7% у Klebsiella spp. и с 9 до 11% у Enterobacter spp. Интересно, что все обнаруженные интегроны 2 класса имели идентичные инте-гронные вставки (табл. 3). Отмечено, что часть интегронов класса 1 (около 50% от общего числа) и интегронов класса 2 (около 20%) интегронных вставок не имели, что может быть расценено как еще не использованный мобилизующий потенциал этих структур. Таким образом, полученные данные показывают важную роль интегронов в формировании и распространении резистентности среди этиологических агентов нозокомиальных инфекций.
Кроме того, в изолятах Enterobacter spp., выделенных в 2005—2007 гг., выявлено присутствие плазмидных детерминант устойчивости к хино-лонам и фторхинолонам — генов, кодирующих QNR-белки, которые экранируют мишени, на которые действуют антибиотики данного класса. Сами по себе они не определяют высокого уровня устойчивости, но значительно ускоряют появление точечных мутаций в генах gyrA и parC, обеспечивающих высокую устойчивость к фторхиноло-нам [24]. Нами определены аллели генов,
ЛИТЕРАТУРА
1. Paterson D. L., Bonomo R. A. Extended-spectrum ß-lactamases: a clinical update. Clin Microbiol Rew 2005; 18: 4: 657-686.
2. Canton R., Novais A., Valverde A. et al. Prevalence and spread of extend-
ed-spectrum в-lactamase-producing Enterobacteriaceae in Europe.
Clin Microbiol Infect 2008; 14: 1: 144—153.
3. Rossolini G. M., D'Andrea M. M., Mugnaioli C. The spread of CTX-M-
type extended-spectrum ß-lactamases. Ibid 2008; 14: 1: 33—41.
4. Baraniak A., Fiett J., Sulikowska A., Hryniewicz W., Gniadkowski M.
Countrywide spread of CTX-M-3 extended-spectrum beta-lactamase-
кодирующих QNR-белки, qnrB2 (n=18), qnrB4 (n=1) и qnrSl (n=3). Данное наблюдение указывает на начавшееся распространение нового механизма формирования устойчивости к хинолонам и фторхинолонам среди российских штаммов энтеробактерий, отмечаемое в течение последнего десятилетия в разных регионах мира [17].
Таким образом, полученные нами данные указывают на большую эпидемиологическую значимость широко распространившихся нозокомиальных штаммов, несущих одновременно генетические детерминанты устойчивости к беталактамным антибиотикам и к антибиотикам других функциональных групп. Ситуация в будущем может ещё больше осложниться тем, что во всем мире отмечается тенденция к распространению аналогичных генов устойчивости за пределы госпитальных микробных сообществ, обнаружение их в изолятах, выделенных от амбулаторных больных [3].
Заключение
Материалы, представленные в работе, показывают, что основным молекулярно-генетическим механизмом формирования и распространения устойчивости к беталактамным антибиотикам у клинических штаммов семейства Enterobacteriaceae, циркулирующих в российских клиниках, является наличие генов blacjx^-типа, среди которых самым распространённым является ген blaCYX.M_.15. Ассоциативная устойчивость к антибиотикам других групп связана с наличием генетических кассет устойчивости в составе интегронов 1 класса, а также с распространением новых генетических детерминант, таких как плазмидные гены qnr.
Исследование проводилось при поддержке фонда программы развития биотехнологий США, в рамках международного партнерского проекта ISTC#2913/BTEP#62P. Мы благодарны Dr. Linda M. Weigel и Dr. J. Kamile Rasheed (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA) за участие в обсуждении результатов работы.
Секвенирование ДНК проводили в Межинсти-тутском Центре коллективного пользования «ГЕНоМ» ИМБ РАН (http://www.genome-centre. narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ (грант №00-04-55000).
producing microorganisms of the family Enterobacteriaceae in Poland. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 151—159.
5. Novais A., Canton R., Valverde A. et al. Dissemination and persistence of blaCTX-M-9 are linked to class 1 integrons containing CR1 associated with defective transposon derivatives from Tn402 located in early antibiotic resistance plasmids of IncH12, IncP1-a, and IncFI groups. Ibid 2006; 50: 2741—2750.
6. Quinteros M., Radice M., Gardella N. et al. Extended-spectrum в-lacta-mases in Enterobacteriaceae in Buenos Aires, Argentina, public hospitals. Ibid 2003; 47: 9: 2864—2867.
7. Canton R., Coque T. M. The CTX-M в-lactamase pandemic. Curr Opinion Microbiol 2006; 9: 466—475.
О
e
8. Edelstein M., Pimkin M., Palagin I. et al. Prevalence and molecular epi- 17.
demiology of CTX-M extended-spectrum ß-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 3724—3732. 18
9. Сидоренко С. В., Березин А. Г., Иванов Д. В. Молекулярные механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae к цефалоспориновым антибиотикам. Антибио- 19 тики и химиотер 2004; 49: 3: 3—13.
10. Fursova N. K., Kruglov A. N., Abaev I. V. et al. Spreading of beta-lacta-
mase genes among nosocomial isolates collected from Moscow clinics. 20
Clin Microbiol Infect 2006; 12: 4: 1351.
11. NCCLS/CLSI. 2006. Methods for dilution antimicrobial susceptibility
tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. Document M7-A5. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 21
12. http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/ Disk_test_documents/EUCAST_breakpoints_v1.0_20091221.pdf
13. Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувстви- 22.
тельности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ 23
Г.Г. Онищенко 04.03.2004 г.
14. Эйделъштейн М. В. Выявление бета-лактамаз расширенного спектра у грамотрицательных бактерий с помощью фенотипических методов. Клин микробиол антимикроб химиотер 2001; 3: 2: 183—189.
15. Rasheed J. K., Jay C., Metchock B., Berkowitz F. et al. Evolution of 24.
extended-spectrum beta-lactam resistance (SHV-8) in a strain of Escherichia coli during multiple episodes of bacteremia. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 3: 647—653.
16. Oliver A., Weigel L. M., Rasheed J. K. et al. Mechanisms of decreased susceptibility to cefpodoxime in Escherichia coli. Antibiotics and Chemother 2002; 46(12): 3829—3836.
Pérez-Pérez F. J., Hanson N. D. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol 2002; 40: 2153-2162.
Robicsek A., Strahilevitz J., Sahm D. F. et al. qnr Prevalence in ceftazidime-resistant Enterobacteriaceae isolates from the United States. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50: 8: 2872—2874.
Machado E., Cantón R., Baquero F. et al. Integron content of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli strains over 12 years in a single hospital in Madrid, Spain. Ibid 2005; 49: 5: 1823—1829. Skurnik D., Le Menac'h A., Zurakowski D. et al. Integron-associated antibiotic resistance and phylogenetic grouping of Escherichia coli isolates from healthy subjects free of recent antibiotic exposure. Ibid 2005; 49: 7: 3062—3065.
Jiang X., Ni Y., Jiang Y., Yuan F. et al. Outbreak of infection caused by Enterobacter cloacae producing the novel VEB-3 beta-lactamase in China. J Clin Microbiol 2005; 43: 2: 826-831.
Amber R. P. The structure of ^-lactamases. Philos Trans R Soc Lond (Biol.) 1980; 289: 321—331.
Fernández-Cuenca F., Rodríguez-Martínez J. M., Martínez-Martínez L., Pascual A. In vivo selection of Enterobacter aerogenes with reduced susceptibility to cefepime and carbapenems associated with decreased expression of a 40 kDa outer membrane protein and hyperproduction of AmpC beta-lactamase. Int J Antimicrob Agents 2006; 27: 6: 549—552. Rodríguez-Martínez J. M., Velasco C., García I et al. Mutant prevention concentrations of fluoroquinolones for Enterobacteriaceae expressing the plasmid-carried quinolone resistance determinant qnrA1. Antimicrob Agents Chemother. 2007; 51: 6: 2236—2239.
-Q-
АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2010, 55; 9-10 é—
