CC BY
41
УДК 616.981.49-036.2+576.851.49
КЛОНАЛЬНОЕ РАСПРОСТРАНЕНИЕ CTX-M-5-ПРОДУЦИРУЮЩИХ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ SALMONELLA TYPHIMURIUM В РОССИИ, БЕЛАРУСИ И КАЗАХСТАНЕ В.К. Козырева1, М.В. Эйдельштейн1, Д.В. Тапальский2, И.С. Азизов3, A.B. Романов1, P.C. Козлов1
1Смоленская государственная медицинская академия, НИИ антимикробной химиотерапии, Россия, 214019, Смоленск, ул. Кирова, 46а
2Гомельский государственный медицинский университет, Респ. Беларусь, 246000, Гомель, ул. Ланге, 5 3Карагандинский государственный медицинский университет, Респ. Казахстан, 100008, Караганда, ул. Гоголя, 40
В настоящей работе представлены данные, свидетельствующие о широком географическом распространении штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium, принадлежащих к одной генетической линии и проявляющих резистентность к оксииминоцефалоспоринам в результате продукции ß-лактамазы расширенного спектра действия CTX-M-5. Родственность штаммов, которые выделялись в ходе многочисленных вспышек нозокомиального сальмонеллеза на территории России, Беларуси и Казахстана, была установлена с помощью методов электрофореза в пульсирующем поле (PFGE) и мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA). Циркуляция клона была впервые зафиксирована в 1994 году и, согласно представленным нами данным, продолжается в настоящее время. Исследованные штаммы характеризуются полирезистентностью, в том числе, к ингибиторозащищенным пенициллинам и не^-лактамным антибиотикам, детерминанты резистентности к которым располагаются на больших конъюгативных плазмидах, в то время как ген blaCTX-M-5 находится в сцеплении с мобильным элементом ISEcp1 на небольшой неконъюгативной плазмиде. Часть штаммов проявляет резистентность к налидиксовой кислоте, которая связана с мутациями в QRDR области гена gyrA.
Ключевыле слова: Salmonella, Typhimurium, нозокомиальные инфекции, клональное распространение, антибиотикорезистентность
CLONAL DISSEMINATION OF CTX-M-5-PRODUCING NOSOCOMIAL STRAINS OF SALMONELLA TYPHIMURIUM IN RUSSIA, BELARUS, AND KAZAKHSTAN
V.K. Kozireva1, M.V. Edelstein1, D.V. Tapalsky2,1.S. Azizov3, A.V. Romanov1, R.S. Kozlov1
1 Smolensk State Medical Academy, Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Russia, 214019, Smolensk, Kirov St., 46a
2Gomel State Medical Academy, Belarus, 246000, Gomel, Lange St., 5 3Karaganda State Medical Academy, Kazakhstan, 246000, Karaganda, Gogol St., 40
In this paper, the evidence of broad geographic dissemination of Salmonella enterica serovar Typhimurium strains belonging to a single genetic lineage is presented. The isolates described possess resistance to oxiimino-cephalosporines due to production of CTX-M-5 extended-spectrum p-lactamase. The genetic relatedness of the strains isolated during multiple outbreaks of nosocomial salmonellosis in various parts of Russia, Belarus and Kazakhstan was established be pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multi-locus tandem repeat analysis (MLVA). Circulation of the clone was first noticed in 1994 and is currently ongoing according to the data presented. The resistance to multiple antibiotics including penicillin-inhibitor combinations and various non-p-lactam drugs is mediated by large conjugative plasmids, while blaCTX-M-5 gene is associated with ISEcp1 element and carried by small non-conjugative plasmid. Some isolates express resistance to nalidixic acid owing to mutations in QRDR of gyrA gene.
Ключевыеслова: Salmonella, Typhimurium, nosocomial infection, clonal dissemination, antimicrobial resistance
Сальмонеллы нетифоидной группы, относящиеся к различным сероварам S. enterica, прежде всего, Enteritidis и Typhimurium (S.Typhimurium), являются одними из главных возбудителей острого гастроэнтерита [1]. Серовар Typhimurium в течение многих лет являлся наиболее часто выделяемым, по сравнению с другими сероварами сальмонелл. Значительный вклад в увеличение частоты встречаемости S. Typhimurium внесло быстрое всемирное распространение
полирезистеных штаммов фаготипа БТ104, которое было признано угрозой мировому здравоохранению [2].
В 2001 г. приблизительно 22,1% случаев сальмоннелеза, зафиксированных в США, были вызваны серотипом ТурЫшигшш [3, 4]. Доминирование данного серотипа было еще более явно выраженным во Франции, где >32% случаев были вызваны 8. ТурЫшигшш [3]. Несмотря на то, что в странах Евросоюза и других странах, в том числе и России [5], в последние годы штаммы серовара Ешегш^ выделялись с большей частотой [2], клиническое значение серовара ТурЫшигшш по-прежнему велико.
Чаще всего сальмонеллез у людей связан с употреблением в пищу зараженных продуктов, таких как мясо, птица, яйца, молоко, морепродукты и овощи. Другим источником инфицирования может являться прямой контакт с зараженным животным [4]. Помимо пищевых инфекций существует проблема сальмонеллеза как нозокомиальной инфекции. В отличии от пищевых инфекций, вызванных 8. еШепса, источником которых являются продукты питания, основными способом распространения нозокомиального сальмонеллеза является контактный путь, который связан с прямой передачей возбудителя от человека к человеку. Высокая частота носительства отдельных штаммов 8. ТурЫшипиш у пациентов стационаров и медицинских работников является важным фактором, способствующим клональному распространению данных штаммов в нозокомиальной среде [5].
Несмотря на то, что в большинстве случаев инфекция, вызванная 8. ТурЫшипиш, протекает как гастроэнтерит средней и легкой тяжести, в некоторых случаях бактерии могут вызвать тяжелые инвазивные формы заболевания, с сепсисом и даже летальным исходом. Большая доля таких осложнений приходится на долю нозокомиальных инфекций. Штаммы сальмонелл, распространяющиеся в госпитальной среде, как правило, отличаются от внебольничных изолятов множественной лекарственной устойчивостью (полирезистентностью) [5, 6].
В ряде отечественных [5, 7, 8] и зарубежных публикаций [9, 10, 11] отмечается увеличение частоты нозокомиальных сальмонеллезов, вызванных 8. ТурЫшигшш, с преобладанием инвазивной формы инфекции, при которой назначение антимикробных препаратов является необходимым.
Для выбора адекватной антимикробной химиотерапии рекомендуется отпределять чувствительность сальмонелл при неинвазивной инфекции к следующим препаратам: ампициллину, фторхинолонам, ко-тримоксазолу; а в случае инвазивного сальмонеллеза-хлорамфениколу и цефалоспоринам III поколения [12]. Вместе с тем, глобальное распространение в последние годы получили полирезистентные штаммы 8. ТурЫшипиш, устойчивые к ампициллину, ко-тримоксазолу, хлорамфениколу, тетрациклину, стрептомицину, сульфаниламидам и ряду других антимикробных препаратов [11, 13, 14, 15]. Данные молекулярного типирования свидетельствуют о преимущественно клональном распространении таких штаммов [16]. Наибольшую опасность в настоящее время представляет появление и распространение штаммов 8. ТурЫшигшш, устойчивых к цефалоспоринам III поколения (цефотаксиму, цефтриаксону) и фторхинолонам - препаратам выбора для лечения инвазивных сальмонеллезов [16, 17].
Резистентность к цефалоспоринам III поколения у сальмонелл может быть обусловлена продукцией плазмидно-кодируемых р-лактамаз расширенного спектра действия (БЛРС) молекулярного класса А или цефалоспориназ (АшрС) класса С. Экспрессия БЛРС, относящихся к группам ТЕМ, 8ИУ и, особенно часто, СТХ-М, является наиболее распространенным механизмом устойчивости к современным цефалоспоринам у сальмонелл [18].
Устойчивость к хинолонам, как правило, связана с мутациями хромосомных генов ДНК-гиразы и/или топоизомеразы IV. У сальмонелл, как и большинства других грамотрицательных бактерий, резистентность к налидиксовой кислоте и пониженная чувствительность к фторхинолонам формируется в результате появления единичных аминокислотных замен в основном сайте связывания хинолонов - QRDR области А-субъединицы ДНК-гиразы (ОугА), обычно в позициях 83 и 87. Наличие нескольких мутаций в QRDR области обеспечивает высокий уровень устойчивости к ципрофлоксацину [19]. Известно, что даже резистентность низкого уровня к ципрофлоксацину, обусловленная единичными мутациями в QRDR ОугА, зачастую приводит к клинической неэффективности фторхинолонов или же требует продления курса терапии ципрофлоксацином [20]. Устойчивость низкого уровня к хинолонам у сальмонелл может быть связана также с иными механизмами: снижением проницаемости наружной мембраны, активным выведение антибиотика из клетки (эффлюксом) [21], продукцией плазмидно-кодируемых протективных Qnr-белков [22, 23] или ципрофлоксацин-модифицирующего фермента, кодируемого геном аас(6')!Ь-сг [24].
В свете вышесказанного становится очевидно, что распространение антибиотико-резистентности у сальмонелл должно находится под тщательным эпидемиологическим контролем. Немаловажным при этом является использование современных молекулярно-генетических методов субтипирования сальмонелл, позволяющих адекватно оценить степень родственности, источники появления и распространения полирезистентных штаммов [25]. Ранее использовавшийся с этой целью метод фаготипирования, согласно современным данным, далеко не всегда позволяет оценить родственность штаммов сальмонелл, вследствие возможности изменения фаготипа в результате потери или приобретения мобильного элемента - профага [2]. То же самое касается метода плазмидного типирования, который, как дополнительный метод, по-прежнему является ценным для описания свойств штаммов и понимания природы распространения антибиотико-резистентности, но, тем не менее, не может использоваться в качестве самостоятельного подхода для оценки родственности изолятов ввиду высокой вариабельности плазмид, их способности к горизонтальному переносу и возможности спонтанной элиминации [26].
Метод электрофореза в пульсирующем поле (PFGE), позволяющий проводить сравнение макрорестрикционных профилей ДНК микроорганизмов, на протяжении ряда лет считался «золотым стандартом» типирования изолятов рода Salmonella [27]. Однако, основными недостатками данного подходя являются высокая трудоемкость и сложность интерпретации данных для оценки филогенетических связей между штаммами.
Метод мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA), который основан на амплификации участков ДНК с переменным числом тандемных повторов (VNTR локусов) по данным многих работ превосходит по своей дискриминирующей способности метод пульс-электрофореза. Поэтому метод MLVA был предложен как альтернатива для генетического типирования микроорганизмов, обладающих преимущественно клональной популяционной структурой, в частности, S.enterica [25, 27, 28, 29]. Другим преимуществом MLVA является высокая стандартизация анализа, которая позволяет сравнивать полученные результаты между лабораториями [30].
Эпидемиология, популяционная структура и механизмы антибиотикорезистентности штаммов S. Typhimurium, циркулирующих в госпиталях на территории Российской Федерации и сопредельных государств остаются недостаточно изученными. В связи с этим целью нашего исследования явилось определение механизмов резистентности к ß-лактамам и хинолонам, а также оценка генетической родственности нозокомиальных цефотаксим-резистентных штаммов S. Typhimurium, выделенных в различных регионах России, Беларуси и Казахстана.
Методика
Клинические штаммы Salmonella Typhimurium. Всего исследовано 88 цефотаксим-резистентных изолятов Salmonella enterica подвид enterica серовар Typhimurium, выделеных у госпитализированных пациентов в 15 населенных пунктах 10 регионов России, Беларуси и Казахстана в 1994-2009 гг. (табл. 1).
Таблица 1. Источники выделения цефотаксим-резистентных изолятов S. Typhimurium
Регион Количество изолятов Даты выделения
Смоленск, Россия 26 1994-2009
С.-Петербург, Россия 6 1996-1997
Гомель, Беларусь 22 1997-2007
Москва, Россия 1 1998
Витебск, Беларусь 13 1999-2000
Иркутск, Россия 1 2003
Воронеж, Россия 5 2004
Ярославль, Россия 2 2004
Караганда, Казахстан 9 2006-2007
Томск, Россия 3 2007-2008
Все изоляты были неповторяющимися (по одному от каждого пациента), пятнадцать из них были выделены у детей в возрасте до 3 лет. Дополнительно в исследование были включены два чувствительных эпидемиологически неродственных изолята 8Е054/8ш-1878 и SE086/Mz-1910 из тех же стационаров, откуда были получены резистентные штаммы S. ТурЫшигшш, и цефотаксим-резистентый штамм CAS5 из Аргентины, продуцирующий БЛРС СТХ-М-2 [31], которые были
использованы в качестве контролей при оценке клональности изолятов. Первичная видовая и серологическая идентификация проводилась в локальных микробиологических лабораториях в соответствии с принятыми стандартами. Повторно все штаммы были индетифицированы в НИИ антимикробной химиотерапии, ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ с помощью биохимических идентификационных систем API20E (bioMerieux, Франция) и наборов сывороток к О- и Н-антигенам Salmonella (BioRad, Франция).
Определение чувствительности к антибиотикам
Значения минимальной подавляющей концентрации антибиотиков были определены с помощью метода последовательных разведений в агаре Мюллера-Хинтон [12] для следующих препаратов: ампициллин, амоксициллин-клавулановая кислота (2:1), азтреонам, цефотаксим, цефотаксим-клавулановая кислота (4 мг/л), цефтазидим, цефтазидим-клавулановая кислота (4 мг/л), цефепим, цефоперазон, цефоперазон-сульбактам (1:1), пиперациллин, пиперациллин-тазобактам (4 мг/л), гентамицин, левофлоксацин, ко-тримоксазол, имипенем, меропенем, эртапенем, налидиксовая кислота, ципрофлоксацин. Чувствительность к тетрациклину и хлорамфениколу была определена с помощью диск-диффузионного метода [12]. Для контроля качества определения чувствительности были использованы штаммы E. coli ATCC®25922 и E. coli ATCC®35218. Интерпретация результатов определения чувствительности проводилась с использованием критериев Европейского комитета по оценке антибиотикочувствительности (EUCAST) 2012 г. [32]. Для оценки чувствительности к амоксициллину-клавулановой кислоте и налидиксовой кислоте использовались критерии Института клинических лабораторных стандартов (CLSI) 2011 г. [12].
Продукция БЛРС оценивалась с помощью метода двойных дисков [12], а также по снижению МПК цефотаксима или цефтазидима в присутствии клавулановой кислоты (4 мг/л) не менее чем в 8 раз.
Детекция генов ß-лактамаз и их генетического окружения
Гены ß-лактамаз, принадлежащих к группам OXA-1, TEM, SHV и CTX-M определяли с помощью ПЦР с праймерами, перечисленными в таблице 2, как описано ранее [7, 33, 34].
Таблица 2. Использованные праймеры
№ Наименование праймера ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (5'-3') Назначение Литературный источник
1 TEM fwd GCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACC blaTEM [7]
2 TEM rev GACAGTTACCAATGCTTAATCA
3 SHV fwd CGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGC blaSHV [33]
4 SHV rev TCTTTCCGATGCCGCCGCCAGTCA
5 OXA-1 fwd ATGAAAAACACAATACATATCAAC blaOXA-1 [7]
6 OXA-1 rev AAAGGACATTCACGCCTGTG
7 CTX-M-Fext TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA blaCTX-M [34]
8 CTX-M-R1c CCGCTGCCGGTCTTATC
9 CTX-M(1-2)RNest TGATCTCAACGCGCTGATTTA
10 CTX-M-Rext CGATATCGTTGGTGGTGCCATA Генетическое окружение blaCTX-M [7]
11 ISEcp1-F TGTCTGGTATAATAAGAATATCATC
12 ORF513 ATCCATCACAGAGTCGTCTC
13 STGYRA1 TGTCCGAGATGGCCTGAAGC QRDR GyrA [1]
14 STGYRA12-GT CGTTGATGACTTCCGTCAGGT
Для выявления ассоциации генов Ыастх-м с известными мобильными элементами: КЕср1 или КСЮ (ранее описанным как ог1513) использовали ПЦР-картирование с праймерами СТХ-М-Иех1, КЕср1-Е и ой513 [7].
Секвенирование полученных ПЦР-продуктов проводилось с помощью амплификационных праймеров, наборов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и генетического анализатора ABI Prism® 310 (Applied Biosystems, США).
Определение мутаций в QRDR области гена gyrA
Амплификацию и прямое секвенирование внутреннего фрагмента гена gyrA проводили с помощью праймеров STGYRA1 и STGYRA12-GT, как описано ранее [1].
Анализ плазмид, несущих blaCTX-M гены
Конъюгационный перенос плазмид от исследуемых штаммов в реципиентный штамм E.coli AB1456 (RifR) [35] проводился при совместном культивировании клеток донора и реципиента в бульоне Мюллера-Хинтон с последующим рассевом на плотные среды, содержащие рифампицин (100 мг/л)в комбинации с ампициллином (100 мг/л) или цефотаксимом (1 мг/л).
CTX-M-кодирующие плазмиды были выделены у исследованных штаммов и их трансконъюгантов с помощью наборов Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Германия). Полученной плазмидной ДНК был трансформирован компетентный лабораторный штамм E. coli EPI300.
Рестрикционный анализ плазмид повторно выделенных от трансформантов проводили с помощью эндонуклеаз PstI (Promega, США) и PvuII (Amersham, США) в соответствии с методикой, описанной ранее [7].
^пирование изолятов с помощью пульс-электрофореза макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК (PFGE)
PFGE-типирование выполнено в соответствии с методом, описанным Struelens и др. [36] . Геномная ДНК была подвергнута рестрикции эндонуклеазой XbaI (MBI Fermentas, Литва). Разделение фрагментов ДНК проводили на приборе CHEF DRIII (Bio-Rad, США). Для интерпретации результатов анализа использовали критерии, предложенные Tenover и соавт. [37].
^пирование изолятов с помощью мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA)
MLVA-типирование выполнено по методике Lindstedt, 2004 [25] с детекцией по пяти VNTR локусам (STTR3, STTR5, STTR6, STTR9, STTR10). Анализ соответствующих флуоресцентно -меченых ПЦР-продуктов был проведен с помощью генетического анализатора ABI Prism® 310 и программного обеспечения Peak Scanner Software v.1.0 (Applied Biosystems). Кластерный анализ MLVA-профилей выполнен с помощью программного пакета BioNumerics Software v.6.1 (Applied Maths, Бельгия) с использованием алгоритма минимального остовного дерева (minimum spanning tree, MST) и метода невзвешенных попарных арифметических средних (unweighted pair-group method using arithmetic averages, UPGMA) для категориальных значений.
Результаты исследования Чувствительность к антибиотикам
Результаты определения чувствительности исследованных нозокомиальных изолятов S. Typhimurium представлены в таблице 3. Все изоляты обладали высоким уровнем устойчивости к цефоперазону, цефотаксиму, цефепиму, и азтреонаму (МПК >256, >256, >128 и >64 мг/л, соответственно) и пониженной по сравнению с чувствительными в норме штаммами чувствительностью к цефтазидиму (МПК 0,5-16 мг/л). Тем не менее, 6,4% изолятов оставались чувствительными к цефтазидиму согласно критериям EUCAST. При определении МПК и методом «двойных дисков» у всех изолятов был выявлен синергизм между оксииминоцефалоспоринами и клавулановой кислотой, свидетельствующий о продукции БЛРС.
Устойчивость к ингибиторозащищенным пенициллинам была вариабельной: 88,5% и 75,7% изолятов были нечувствительны, соответственно, к амоксициллину-клавулановой кислоте и пиперациллину-тазобактаму. Все изоляты проявляли чувствительность к карбапенемам.
Ассоциированная устойчивость к одному и более не^-лактамным антибиотикам была отмечена у всех изолятов. Резистентностью одновременно к пяти не^-лактамным антибиотикам обладало 30,8% изолятов (профиль резистентности Tet-Chl-Gm-Sxt-Nal), к четырем - 34,6% (профили Tet-Chl-Gm-Sxt (30,8%) или Tet-Chl-Gm-Nal (3,8%)), к трем препаратам - 7,7% (профили Tet-Chl-Gm (6,4%) или Gm-Sxt-Nal (1,3%)), к двум - 24,4% (профили Gm-Sxt (21,8%) или Gm-Nal (2,6%)).
Таблица 3. Чувствительность изолятов к антибиотикам
АНТИБИОТИК МПК, мг/л Категория чувствительности
Диапазон 50% 90% Ч, % УР, % Р, %
Ампициллин >256 >256 >256 0 0 100,0
Амоксициллин-клавулановая к-та. 8-32 32 32 11,5 15,4 73,1
Пиперациллин >256 >256 >256 0 0 100,0
Пиперациллин-тазобактам 2->256 >256 >256 24,4 1,3 74,4
Цефоперазон 4->256 >256 >256 - - -
Цефоперазон-сульбактам 2-128 16 32 - - -
Цефотаксим 2->256 >256 >256 0 1,3 98,7
Цефотаксим-клавулановая к-та. 0,06-1 0,25 0,5 - - -
Цефтазидим 0,25-16 8 16 6,4 1,3 92,3
Цефтазидим-клавулановая к-та. 0,25-1 0,5 0,5 - - -
Цефепим 4->256 128 128 0 1,3 98,7
Азтреонам 0,006->256 64 64 3,8 0 96,2
Имипенем 0,06-0,5 0,25 0,25 100,0 0 0
Дорипенем 0,06 0,06 0,06 100,0 0 0
Меропенем 0,06-0,125 0,06 0,125 100,0 0 0
Эртапенем 0,06-0,5 0,06 0,06 100,0 0 0
Гентамицин 2->256 16 16 10,3 1,3 88,5
Ко-тримоксазол 0,125->256 >256 >256 33,3 0 66,7
Налидиксовая кислота. 4->512 8 >512 56,4 0 43,6
Ципрофлоксацин 0,03-0,5 0,03 0,5 100,0 0 0
Левофлоксацин 0,03-1 0,06 0,5 100,0 0 0
Хлорамфеникол - - - 26,9 0 73,1
Тетрациклин - - - 26,9 0 73,1
Только 2,6% изолятов проявляли резистентность к одному не-р-лактамному антибиотику -гентамицину.
Среди исследованных изолятов не было выявлено ни одного резистентного к ципрофлоксацину и левофлоксацину. Значения МПК фторхинолонов не превышали 0,5 мг/л, однако 43,6% изолятов проявляли устойчивость к налидиксовой кислоте.
Молекулярная характеристика детерминант резистентности к ß-лактамам и хинолонам
У всех исследованных изолятов методом ПЦР в реальном времени были выявлены гены БЛРС, принадлежащих к кластеру CTX-M-2. Анализ нуклеотидной последовательности ORF blaCTX-M у 10 произвольно выбранных изолятов из разных регионов показал их идентичность гену blaCTX.M.5 (GenBank Acc. № U95364), кодирующему ранее описанный у S. Typhimurium вариант БЛРС -CTX-M-5.
При амплификации с праймерами к внутренним последовательностям генов ШрА КЕср1 и Ь1астх-м-5, у всех изолятов был получен характерный ПЦР-фрагмент длиной около 470 пн. ПЦР тест на наличие сцепления гена Ь1астх-М с КСЮ не дал положительных результатов ни для одного из исследованных изолятов, кроме СТХ-М-2-продуцирующего штамма СА8-5 из Аргентины, взятого для сравнения. Таким образом, результаты ПЦР картирования свидетельствуют о наличии характерной для Ь1аСТХ-М-5 ассоциации с инсерционной последовательностью КЕср1 [38].
ПЦР-анализ на наличие генов других распространенных р-лактамаз молекулярных классов А и Б выявил присутствие Ь1аТЕМ у 8,8% и Ь1аоХА-1-подобных генов у 75,6% изолятов (рис. 4). Гены 8ИУ р-лактамаз не были обнаружены. Наличие ОХА-1-подобных р-лактамаз, которые проявляют устойчивость к ингибированию клавулановой кислотой и тазобактамом [39], ожидаемо коррелировало с резистентностью к пиперациллину-тазобактаму.
Методом ПЦР и последующего секвенирования у изолятов, резистентных к налидиксовой кислоте, были выявлены различные точечные мутации приводящие к аминокислотным заменам в дИБИ области А субъединицы ДНК-гиразы (ОугА): Аэп-87, 01у-87, Туг-87 и РЪе-83 (рис. 4). Во всех случаях точечные мутации в дИБИ были единичными и приводили к значительному повышению МПК только налидиксовой кислоты, но не фторхинолонов.
Анализ CTX-M-кодирующих плазмид
При конъюгативном переносе плазмид выявлено 2 типа трансконъюгантов, отличающихся по фенотипу резистентности. Трансконъюганты первого типа были получены от большинства исследованных изолятов при культивировании на среде с рифампицином и ампициллином с высокой частотой (10"3-10"4) и обладали резистентностью к пенициллинам, комбинациям пенициллинов с ингибиторами, тетрациклину, хлорамфениколу, а в некоторых случаях также к генамицину и ко-тримоксазолу, но проявляли чувствительность к оксиимино^-лактамам. С помощью ПЦР у трансконъюгантов данного типа были выявлены только гены OXA-1-подобных пенициллиназ. Трансконъюганты второго типа были получены всего от двух цефотаксим-резистенстных изолятов S. T-y7phi-m8 urium на среде, содержащей рифампицин и цефотаксим, с гораздо меньшей частотой (10-7-10-8) и проявляли БЛРС фенотип (резистентность к пенициллинам и оксиимино^-лактамам), обусловленный наличием гена blacTX-M, оставаясь при этом чувствительными к пиперациллину-тазобактаму и не^-лактамным антибиотикам.
Плазмиды, кодирующие CTX-M БЛРС, были также выделены от 26 изолятов из разных стационаров и перенесены в реципиетнтый штамм E. coli EPI300 с помощью трансформации. Полученные цефотаксим-резистентные трансформанты обладали единственной низкомолекулярной плазмидой (размером около 7-8 тпн). Рестрикционный анализ плазмид, выделенных от трансформантов, показал, что все они могут быть отнесены к одному из двух сходных между собой типов (рис. 1).
Наиболее распространенный рестрикционный профиль A был характерен для 21 изолятов, 11 из которых были выделены в стационарах Беларуси, 9 - в России и 1 - в Казахстане. Плазмиды с профилем B, выявленные у 4 изолятов из Беларуси и одного - из России, отличались наличием дополнительного сайта рестрикции для эндонуклеазы PstI и большим (приблизительно на 750 пн) размером.
У одного изолята из Иркутска (SE081/Ir-1732) и трех из Томска (SE100/Tm-27714, SE101/Tm-27715, SE102/Tm-27716) не удалось осуществить выделение и перенос CTX-M-плазмид путем трансформации или конъюгации. Тем не менее, присутствие у этих изолятов гена blaCTX-M-5, сцепленного с ISEcp1, было подтверждено с помощью ПЦР.
Типирование изолятов
Типирование с помощью метода РЕОЕ было проведено для 14 изолятов, выделенных в России и Беларуси до 2003 г. Эпидемиологически неродственный штамм 8. ТурЫшигшш из Аргентины, продуцирующий СТХ-М-2, был использован для сравнения.
Метод позволил отнести исследованные изоляты к одному из восьми макрорестрикционных паттернов (рис. 2). При этом 7 из 8 паттернов проявляли выраженное сходство. Семь изолятов из Витебска, Москвы и Санкт-Петербурга имели одинаковый паттерн (А1). Остальные 7 изолятов из России и Беларуси имели макрорестрикционные паттерны (А2-А7), отличающиеся от первого паттерна, максимум по трем полосам, что, согласно критериям предложенным Тепоуег и соавт. [26], свидетельствует о вероятной родственности соответствующих изолятов. Аргентинский штамм СА85 обладал уникальным паттерном (В1), который отличался от паттернов А1-А7 четырьмя полосами. Таким образом, результаты РЕОЕ анализа свидетельствуют о наличие
31
генетического родства между всеми СТХ-М-5-продуцирующими изолятами 8. ТурЫтигшт, выделенными во время нозокомиальных вспышек в различных стационарах на территории России и Беларуси.
Профиль: А А А А М 1 2 3 4
А)
В В А А АААААА
9 10 11 12 М 13 14 15 16 17 18
Рис. 1. Рестрикционный анализ СТХ-М-кодирующих плазмид, полученных от разных изолятов. А) рестрикция эндонуклеазой РвА, Б) рестрикция эндонуклеазой Руи11. Изоляты: 1) 8Е007/Ке-27; 2) 8Е009/У1-6570; 3) 8Е010/У1-3078; 4) 8Е015/УМ3526; 5) 8Е046/Уо-516; 6) 8Е008/УМ603; 7) 8Е014/У1-14533; 8) 8Е019/У1-700; 9) 8Е018/№-16753; 10) 8Е013/Ш-1845; 11) 8Е011/№-13205; 12) 8Е012/0г-13935; 13) 8Е057/Оо-16; 14) 8Е058/00-302; 15) 8Е072/Ка-1124; 16) 8Е084/Оо-735; 17) 8Е087/Ие-401; 18) 8Е089/8т-527; М- маркермолекулярноймассыШвШП+риСШИаеШ
Паттерны РРСЕ: А2 А5 А1 А1 А1 А6 А4 АЗ А4 А1 А1 А7 А1 А1 В1
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 М
Рис. 2. Генетическое родство СТХ-М-продуцирующих штаммов 8. ТурЫтигшт на основании сравнения паттернов РЁОЕ.
Белорусскиештаммы: 1) 8Е006/УМ358; 2) 8Е007/Ие-27; 3) 8Е008/УМ603; 4) 8Е009/У1-6570; 5) 8Е010/У1-3078; 6) 8Е011/№-13205; 7) 8Е012/0г-13935; 8) 8Е013/Ш-1845; 9) 8Е014/УМ4533; 10) 8Е015т-13526; 11) 8Е019/У1-700; 12) 8Е018/№-16753.Российскиештаммы: 13) 8Е004/8р-891; 14) 8Е020/Мо-20.Аргентинскийштамм- 15) 8Е021/Аг-СА85.М- маркер молекулярной массы бактериофаг X
Все CTX-M-продуцирующие изоляты, включая более «поздние» по времени выделения культуры из России, Беларуси и Казахстана, были также типированы с помощью мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA). Для сравнения в исследование были также включены чувствительные к цефалоспоринам штаммы S. Typhimurium SE054/Sm-1878 и SE086/Mz-1910, выделенные в тех же стационарах, где и резистентные изоляты. MLVA типирование позволило отнести все изоляты к 17 типам. Несмотря на большое количество выявленных MLVA-типов, все CTX-M-продуцирующие изоляты были отнесены к одной клональной группе в результате кластеризации MLVA профилей с использованием алгоритма минимального остовного дерева (MST) (рис. 3), соответствующие MLVA-профили отличались друг от друга на 1-2 VNTR-локуса. Чувствительные к цефалоспоринам штаммы SE054/Sm-1878 и SE086/Mz-1910 предсказуемо отличались между собой и от наиболее близких изолятов из описанной клональной группы по 3 и более VNTR-локусам.
Изоляты, принадлежащие к 7 MLVA-типам были получены как минимум из двух разных регионов, что отражает легкость распространения клонов, принадлежащих указанной клональной группе. Интересно отметить, что 3 наиболее ранних изолята из данной группы, выделенные в Санкт-Петербурге в 1994 г. (SE002/ Sp-832, SE003/ Sp-838, SE004/ Sp-891), были отнесены к MLVA-типу A, который является «центральным» для всей клональной группы, что позволяет предположить их близость к исходному штамму, потомки которого распространились на территории трех стран.
Рис. 3. Кластеризация МЬУА-профилей на основании алгоритма Минимального остовного дерева. Пояснение: каждому МЬУА-типу соответствует круг, обозначенный буквой латинского алфавита; названия городов, где были выделены изоляты, указаны рядом с соответствующими типами. Размер круга отражает количество изолятов, принадлежащих данному МЬУА-типу. Длина и тип соединительных отрезков отражает генетическое расстояние (число отличающихся УКТИ локусов) между двумя ближайшими типами: короткая непрерывная линия соединяет два МЬУА-типа, отличающихся друг от друга единственным УКТИ локусом, длинная пунктирная линия соединяет двухлокусные варианты. МЬУА-типы, отличающиеся не более чем на 2 локуса, объединены в клональные группы (выделены серым фоновым цветом). Различия на 3 локуса и более на диаграмме не отражены. Круги черного цвета соответствуют изолятам, не продуцирующим БЛРС
Обсуждение результатов исследования
Клональное распространение полирезистентных штаммов 8. ТурЫтигшт в разных странах и регионах мира широко описано в литературе [11, 16, 40], однако, популяционная структура и эпидемиология нозокомиального сальмонеллеза, вызванного штаммами с множественной резистентностью, в России и соседних странах мало изучена.
Проблема нозокомиального сальмонеллеза в России обозначилась в 70-е годы ХХ века, пик заболеваемости в России пришелся на 1992 г. При этом, более чем в 80% случаев нозокомиальная
форма сальмонеллеза вызвана штаммами серотипа Typhimurium [5, 41]. В 1999 г. в России было зарегистрировано 32 вспышки нозокомиального сальмонеллеза, в которые в общей сложности было вовлечено 472 человека [5]. До недавнего времени было всего несколько сообщений о распространении резистентных к цефалоспоринам S. Typhimurium в России и Беларуси. Крупные вспышки нозокомиального сальмонеллеза, вызванного полирезистентными штаммами, были зарегистрированы в 1994-2003 гг. в Москве, Санкт-Петербурге, Смоленской, Минской, Гомельской, Гродненской и Витебской областях [7]. Выделение цефотаксим-резистентных штаммов, продуцирующих БЛРС CTX-M-5, было описано в Гомельской области и позднее, в 2007 г. [8]. Помимо этого CTX-M-5-продуцирующие штаммы S. Typhimurium выделялись в Греции, Венгрии, Латвии и США [38, 42, 43].
Проведенное нами исследование показало, что у всех нозокомиальных изолятов S. Typhimurium, выделенных в России, Беларуси и Казахстане, резистентность к оксииминоцефалоспоринам обусловлена продукцией БЛРС CTX-M-5. У всех изолятов ген blaCTX_M_5 одинаковым образом связан с инсерционным элементом ISEcpl и находится в большинстве случаев на небольших плазмидах с идентичными или близкими рестрикционными профилями. Данные плазмиды не несут дополнительные детерминанты резистентности и являются неконъюгативными. Тем не менее перенос CTX-M-5-кодирующих плазмид от двух изолятов при конъюгации с низкой частотой свидетельствует о возможности их ко-мобилизации другими плазмидами. У четырех изолятов отсутствие соответсвующих плазмид может быть связано с транслокацией гена blaCTX-M, опосредованной ISEcpl, которая была описана в ряде публикаций [44, 45, 46, 47].
Аналогичный характер ассоциации гена blaCTX_M_5 с ISEcpl с разницей в 3 точечные мутации, локализованные в некодирующей области перед геном р-лактамазы (GenBank #AF286l92) был описан у эпидемического штамма S. Typhimurium из Латвии [38]. Так же как и у исследованных нами изолятов, у латвийского штамма ген blaCTX_M_5 был выявлен в составе небольшой (~10 тпн) плазмиды, что указывает на возможную общность их происхождения.
Следует отметить, что близкий по структуре ген blaCTX-M-2 у штамма S. Typhimurium из Аргентины имеет иное генетическое окружение, связан с ISCR1 элементом и находится в составе так называемого «модифицированного интегрона 1 класса» на большой конъюгативной плазмиде [31].
Дополнительная устойчивость к ингибиторорезистентным пенициллинам, выявленная у большинства исследованных нами изолятов S. Typhimurium была связана с ко-продукцией OXA-пенициллиназ, для которых характерна нечувствительность к ингибированию клавуланатом, тазобактамом и сульбактамом. Гены OXA-1-подобных р-лактамаз были выявлены в составе дополнительных конъюгативных плазмид, которые несли также детерминанты устойчивости к не-р-лактамным антибиотикам: тетрациклину, хлорамфениколу, гентамицину и ко-тримоксазолу в различных сочетаниях.
Учитывая полирезистеность CTX-M-5-продуцирующих штаммов S. Typhimurium особое значение имеет факт выявления у них устойчивости к хинолонам. Несмотря на то, что все исследованные изоляты проявляли чувствительность к ципрофлоксацину согласно критериям EUCAST, 43,6% из них были резистентны к налидиксовой кислоте вследствие наличия характерных аминокислотных замен в позициях 83 или 87 A-субъединицы ДНК-гиразы (GyrA). Согласно рекомендациям CLSI устойчивость к налидиксовой кислоте, опосредованная мутациями в QRDR GyrA, должна рассматриваться как предиктор возможной клинической неэффективности терапии фторхинолонами при инвазивном сальмонеллезе [12]. Известно также, что наличие единичных мутации в QRDR GyrA увеличивает риск селекции дополнительных (кооперативных) мутаций и формирования резистентности высокого уровня к фторхинолонам [3].
Оба использованных нами метода субтипирования штаммов S. Typhimurium: пульс-электрофорез XbaI макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК (PFGE) и мультилокусный анализ тандемных повторов (MLVA), показали, что все CTX-M-5-продуцирующие нозокомиальные изоляты сальмонелл, выделенные на территории России, Беларуси и Казахстана в период с 1994 г. по 2009 г., представляют одну клональную группу, и существенно отличаются по совокупности молекулярно-генетических характеристик от чувствительных штаммов S. Typhimurium, выделенных в тех же стационарах.
Наибольшей дифференцирующей способностью в отношении клинических штаммов S. Typhimurium обладал метод MLVA. Анализ данных MLVA-типирования с помощью алгоритма минимального остовного дерева (minimum spanning tree) позволяет выявить достоверные связи между исследуемыми изолятами и является более информативным по сравнению с анализом результатов PFGE-типирования. Полученные нами результаты подтверждают вывод ряда исследователей о том, что в сочетании с должным математическим анализом метод MLVA является удобным и точным средством изучения эпидемиологии сальмонеллезов [25, 30].
Клональность пятнадцати CTX-M-5-продуцирующих клинических изолятов S. Typhimurium, выделенных в Смоленске, была установлена также на основании результатов независимого исследования с использованием метода PFGE, проведенного в рамках международной программы по мониторингу антибиотикорезистентности SENTRY [48]. В другом исследовании с использованием методов PFGE и MLVA была доказана родственность 31 CTX-M-5-продуцирующих изолятов S. Typhimurium, выделенных в Гомельской области [8].Таким образом, имеющиеся в настоящее время данные подтверждают наши наблюдения о клональном характере распространения госпитальных штаммов S. Typhimurium экспрессирующих CTX-M-5.
Несмотря на установленный с помощью молекулярно-генетических методов факт клональности полирезистентных штаммов S. Typhimurium, недостаточность имеющихся эпидемиологических данных не позволяет однозначно установить пути их распростанения между стационарами в разных городах на территории России, Беларуси и Казахстана. Опираясь на документированные наблюдения, можно предположить, что основным путем распространения инфекции внутри стационара является передача цефотаксим-резистентных штаммов контактным путем от человека к человеку, в частности, между пациентами или посредством бессимптомного носительства у медицинского персонала и далее между стационарами - в результате перевода пациентов [5].
Так, например, в ходе данного исследования нами был выявлен случай распространения CTX-M-5-продуцирующего штамма S. Typhimurium из районной больницы, где на протяжении 2 лет отмечалась его циркуляция среди пациентов, в один из стационаров города Смоленска, куда были переведены инфицированные мать и ее ребенок с тяжелой формой гастроэнтерита.
Другими авторами были описаны случаи распространения нозокомиального клона S. enterica между стационарами разных городов на юге США [49] и разных стран (из Филлипин в США) [50], связанные с переводом пациентов из одного стационара в другой.
Tassios и соавт. на основании результатов PFGE-типирования, анализа плазмид и детерминант резистентности сделали вывод о родственности штаммов S. Typhimurium, выделенных в Венгрии, Греции и России (Санкт-Петербург) [42]. При этом штамм из Санкт-Петербурга (SE005/Sp-893), описанный в работе Tassios и соавт. как родственный греческим и венгерским штаммам, по данным выполненного нами молекулярного типирования принадлежит к той же клональной группе, что и остальные изоляты из России. Кроме того, известны факты «экспортирования» пациентами CTX-M-продуцирующих штаммов S. Typhimurium из южной части России в другие страны: в частности российским иммигрантом в Грецию в 1998 г. [51] и ребенком, усыновленным в США в 2000 г. [43]. Несмотря на отсутствие данных типирования этих штаммов, примечательным является тот факт, что выделенный в США изолят характеризовался наличием плазмиды размером до 9 тпн, несущей ген blaCTX.M.5, и, следовательно, сходной с плазмидами, обнаруженными у нозокомиального штамма из Латвии [38] и штаммов, циркулирующих на территории России, Казахстана и Беларуси.
Все вышесказанное позволяет сделать вывод о широком географическом распространении штаммов S. Typhimurium, принадлежащих к единой клональной группе. Наиболее важной особенностью штаммов данной группы является продукция БЛРС CTX-M-5. Большинство изолятов данной группы проявляют ассоциированную устойчивость к антибиотикам разных классов за счет комбинации дополнительных плазмидных и хромосомных детерминант резистентности. Имеющиеся эпидемиологические данные указывают на возможность быстрого распространения клона в госпитальной среде путем передачи возбудителя между пациентами и, возможно, медицинским персоналом.
Списоклитературы
1. Nakaya H., Yasuhara A., Yoshimura K. et al. Life-threatening infantile diarrhea from fluoroquinolone-resistant Salmonella enterica typhimurium with mutations in both gyrA and parC // Emerg. Infect. Dis. - 2003. - V.9, N2. - P. 255-257.
2. Lan R., Reeves P.R., Octavia S. Population structure, origins and evolution of major Salmonella enterica clones // Infect. Genet. Evol. - 2009. - V.9, N5. - P. 996-1005.
3. Velge P., Cloeckaert A., Barrow P. Emergence of Salmonella epidemics: the problems related to Salmonella enterica serotype Enteritidis and multiple antibiotic resistance in other major serotypes // Vet. Res. - 2005. -V.36. N3. - P. 267-288.
4. Foley S.L., Lynne A.M. Food animal-associated Salmonella challenges: pathogenicity and antimicrobial resistance // J. Anim. Sci. - 2008. - V.86, 14 Suppl. - E. 173-187.
5. Акимкин В.Г., Покровский В.И. Нозокомиальный сальмонеллез взрослых. - Издательство РАМН, 2002. -C. 35-72.
6. Акимкин В.Г. Нозокомиальный сальмонеллез как самостоятельная нозологическая форма инфекционной патологии человека // Ж. микробиол. эпидемиол. и иммунобиологии. - 1998. - №4. - С. 106-110.
7. Edelstein M., Pimkin M., Dmitrachenko T. et al. Multiple outbreaks of nosocomial salmonellosis in Russia and Belarus caused by a single clone of Salmonella enterica serovar Typhimurium producing an extended-spectrum beta-lactamase // Antimicrob. Agents Chemother. - 2004. - V.48, N8. - P. 2808-2815.
8. Tapalski D., Hendriksen R.S., Hasman H. et al. Molecular characterisation of multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium isolates from Gomel region // Belarus, Clin. Microbiol. Infect. - 2007. - V.13, N10. - P. 1030-1033.
9. Orman B.E., Pineiro S.A., Arduino S. et al. Evolution of multiresistance in nontyphoid salmonella serovars from 1984 to 1998 in Argentina.// Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - V.46, N12. - P. 3963-3970.
10. Yan J.J., Ko W.C., Chiu C.H. et al. Emergence of ceftriaxone-resistant Salmonella isolates and rapid spread of plasmid-encoded CMY-2-like cephalosporinase // Taiwan. Emerg. Infect. Dis. - 2003. - V.9, N3. - P. 323-328.
11. Yu F., Chen Q., Yu X. et al. High prevalence of extended-spectrum beta lactamases among Salmonella enterica Typhimurium isolates from pediatric patients with diarrhea in China // PLoS One. - 2011. - V.6, N3. - P. 16801.
12. Clinical and Laboratory Standards Institute, Performance standards for antimicrobial susceptibility testing (21st informational supplement). - Wayne, PA, USA. - 2011. - 1250 p.
13. Dionisi A.M., Graziani C., Lucarelli C. et al. Molecular characterization of multidrug-resistant strains of Salmonella enterica serotype Typhimurium and Monophasic variant (S. 4,[5],12:i:-) isolated from human infections in Italy // Foodborne Pathog. Dis. - 2009. - V.6, N6. - 711-717.
14. Targant H., Ponsin C., Brunet C. et al. Characterization of resistance genes in multidrug-resistant Salmonella enterica serotype Typhimurium isolated from diseased cattle in France (2002 to 2007) // Foodborne Pathog. Dis. - 2010. - V.7, N4. - P. 419-425.
15. dos Reis E.M., Rodrigues dos P., de Freitas-Almeida A.C., Hofer E. Prevalence of R-type ACSSuT in strains of Salmonella serovar Typhimurium DT193 isolated from human infections in Brazil // Rev. Panam. Salud. Publica. - 2011. - V.29, N6. - P. 387-392.
16. Butaye P., Michael G.B., Schwarz S. et al. The clonal spread of multidrug-resistant non-typhi Salmonella serotypes // Microbes Infect. - 2006. - V.8, N.7. - P. 1891-1897.
17. Arlet G., Barrett T.J., Butaye P. et al. Salmonella resistant to extended-spectrum cephalosporins: prevalence and epidemiology // Microbes Infect. - 2006. - V.8, N7. - P. 1945-1954.
18. Rodriguez I., Barownick W., Helmuth R. et al. Extended-spectrum (betaj-lactamases and AmpC {beta}-lactamases in ceftiofur-resistant Salmonella enterica isolates from food and livestock obtained in Germany during 2003-07 // J. Antimicrob. Chemother. - 2009. - V.64, N2. - P. 301-309.
19. Heisig P. High-level fluoroquinolone resistance in a Salmonella typhimurium isolate due to alterations in both gyrA and gyrB genes // J. Antimicrob. Chemother. - 1993. - V.32, N3. - P. 367-377.
20. Aarestrup F.M., Wiuff C., Molbak K.,Threlfall E.J. Is it time to change fluoroquinolone breakpoints for Salmonella spp.? // Antimicrob. Agents Chemother. - 2003. - V.47, N2. - P. 827-829.
21. Cloeckaert A., Chaslus-Dancla E. Mechanisms of quinolone resistance in Salmonella.// Vet. Res. 2001. - V.32, N3-4. - P. 291-300.
22. Martinez-Martinez L., Eliecer Cano M., Manuel Rodriguez-Martinez J. et al. Plasmid-mediated quinolone resistance // Expert. Rev. Anti Infect. Ther. - 2008. - V.6, N5. - P. 685-711.
23. Martinez-Martinez L., Pascual A., Jacoby G.A. Quinolone resistance from a transferable plasmid.// Lancet. -1998. - V.351, N9105. - P. 797-799.
24. Robicsek A., Strahilevitz J., Jacoby G.A. et al. Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase // Nat. Med. - 2006. - V.12, N1. - P. 83-88.
25. Lindstedt B.A., Vardund T., Aas L.,Kapperud G. Multiple-locus variable-number tandem-repeats analysis of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium using PCR multiplexing and multicolor capillary electrophoresis // J. Microbiol. Methods. - 2004. - V.59, N2. - 163-172.
26. Tenover F.C., Arbeit R.D.,Goering R.V. How to select and interpret molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial infections: a review for healthcare epidemiologists. Molecular Typing Working Group of the Society for Healthcare Epidemiology of America // Infect. Control Hosp. Epidemiol. -1997. - V.18, N6. - 426-439.
27. Swaminathan B., Barrett T.J., Hunter S.B.,Tauxe R.V. PulseNet: the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance //. Emerg. Infect. Dis. (United States). - 2001. - V.7, N3. - P. 382-389.
28. Hopkins K.L., Peters T.M., de Pinna E.,Wain J. Standardisation of multilocus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA) for subtyping of Salmonella enterica serovar Enteritidi // Euro Surveill. - 2011. - V.16, N32. -P. 205-208.
29. Tamamura Y., Uchida I., Tanaka K. et al. Molecular epidemiology of Salmonella enterica serovar typhimurium isolates from cattle in hokkaido, Japan: evidence of clonal replacement and characterization of the disseminated clone // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - V.77, N5. - P. 1739-1750.
30. Torpdahl M., Sorensen G., Ethelberg S. et al. A regional outbreak of S. Typhimurium in Denmark and identification of the source using MLVA typing.// Euro Surveill. - 2006. - V.11, N5. - P. 134-136.
31. Bauernfeind A., Casellas J.M., Goldberg M. et al. A new plasmidic cefotaximase from patients infected with Salmonella typhimurium // Infection. - 1992. - V.20, N3. - P. 158-163.
32. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters (v 2.0.2012-01-01). www.eucast.org.
33. Nuesch-Inderbinen M.T., Kayser F.H., Hachler H. Survey and molecular genetics of SHV beta-lactamases in Enterobacteriaceae in Switzerland: two novel enzymes, SHV-11 and SHV-12 // Antimicrob. Agents Chemother.
- 1997. - V.41, N5. - P. 943-949.
34. Степанова M.H. Мутационная изменчивость CTX-M b-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli: Дис. ... канд. биол. наук. -Смоленск, 2009. - 119 с.
35. Kholodii G., Yurieva O., Mindlin S. et al. Tn5044, a novel Tn3 family transposon coding for temperature-sensitive mercury resistance // Res. Microbiol. - 2000. - V.151, N4. - P. 291-302.
36. Struelens M.J., Rost F., Deplano A.et al. Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae bacteremia after biliary endoscopy: an outbreak investigation using DNA macrorestriction analysis // Am. J. Med. - 1993. -V.95, N5. - P. 489-498.
37. Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V. et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing // J. Clin. Microbiol. - 1995. - V.33, N9. - P. 2233-2239.
38. Bradford P.A., Yang Y., Sahm D. et al. CTX-M-5, a novel cefotaxime-hydrolyzing beta-lactamase from an outbreak of Salmonella typhimurium in Latvia // Antimicrob. Agents Chemother. - 1998. - V.42, N8. - P. 19801984.
39. Livermore D.M. beta-Lactamases in laboratory and clinical resistance // Clin. Microbiol. Rev. - 1995. - V.8, N4.
- P. 557-584.
40. Wasyl D., Sandvang D., Skov M.N., Baggesen D.L. Epidemiological characteristics of Salmonella Typhimurium isolated from animals and feed in Poland // Epidemiol. Infect. - 2006 - V.134, N1. - P. 179-185.
41. Акимкин В.Г. Современные клинико-эпидемические аспекты нозокомиального сальмонеллеза //. Медицинскийалфавит. Эпидемиол. исанитария. - 2010. - №3. - С. 4-9.
42. Tassios P.T., Gazouli M., Tzelepi E. et al. Spread of a Salmonella typhimurium clone resistant to expanded-spectrum cephalosporins in three European countries // J. Clin. Microbiol. - 1999. - V.37, N11. - P. 3774-3777.
43. Zirnstein G.W., Swaminathan B., Angulo F. et al. Plasmid-Mediated CTX-M-5 b-lactamase Conferring Resistance to Ceftriaxone and Cefotaxime in a Salmonella serotype Typhimurium var. Copenhagen Isolate from an Infant Adopted from Russia // 2nd International Conference on Emerging Infectious Diseases. - 2000. -Atlanta, GA, US. - 568 p.
44. Fabre L., Delaune A., Espie E. et al. Chromosomal integration of the extended-spectrum beta-lactamase gene blaCTX-M-15 in Salmonella enterica serotype Concord isolates from internationally adopted children // Antimicrob. Agents Chemother. - 2009. - V.53, N5. - P. 1808-1816.
45. Sun Y., Zeng Z., Chen S. et al. High prevalence of bla(CTX-M) extended-spectrum beta-lactamase genes in Escherichia coli isolates from pets and emergence of CTX-M-64 in China // Clin. Microbiol. Infect. - 2010. -V.16, N9. - 1475-1481.
46. Mendonca N., Leitao J., Manageiro V. et al. Spread of extended-spectrum beta-lactamase CTX-M-producing escherichia coli clinical isolates in community and nosocomial environments in Portugal // Antimicrob. Agents Chemother. - 2007. - V.51, N6. - P. 1946-1955.
47. Hopkins K.L., Batchelor M.J., Liebana E. et al. Characterisation of CTX-M and AmpC genes in human isolates of Escherichia coli identified between 1995 and 2003 in England and Wales // Int. J. Antimicrob. Agents. -
2006. - V.28, N3. - P. 180-192.
48. Streit J.M., Jones R.N., Toleman M.A. Prevalence and antimicrobial susceptibility patterns among gastroenteritis-causing pathogens recovered in Europe and Latin America and Salmonella isolates recovered from bloodstream infections in North America and Latin America: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (2003) // Int. J. Antimicrob. Agents 2006. - V.27, N5. - P. 367-375.
49. Kay R.S., Vandevelde A.G., Fiorella P.D. et al. Outbreak of healthcare-associated infection and colonization with multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Senftenberg in Florida // Infect. Control Hosp. Epidemiol. -
2007. - V.28, N7. - P. 805-811.
50. Olsen S.J., DeBess E.E., McGivern T.E. et al. A nosocomial outbreak of fluoroquinolone-resistant salmonella infection // N. Engl. J. Med. - 2001. - V.344, N21. - P. 1572-1579.
51. Tzouvelekis L.S., Gazouli M., Markogiannakis A. et al. Emergence of resistance to third-generation cephalosporins amongst Salmonella typhimurium isolates in Greece: report of the first three cases // J. Antimicrob. Chemother. - 1998. - V.42, N2. - P. 273-275.
