Молекулярная характеристика изолятов Enterobacterales с продукцией бета-лактамаз расширенного спектра, выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

RM'AX

www.antibiotic.ru/cmac/

КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ

■ГШЮ

2018

Молекулярная характеристика изолятов Enterobacterales с продукцией бета-лактамаз расширенного спектра, выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови

Хрульнова С.А., Коробова А.Г., Фёдорова А.В., Фролова И.Н., Клясова Г.А.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва, Россия

Контактный адрес:

Светлана Алексеевна Хрульнова

Эл. почта: khrulnovas@mail.ru

Ключевые слова: Е^егоЬайегаЫ, БЛРС, гемокультура, гены бета-лактамаз, опухоли системы крови.

Цель. Изучить распределение генов blacTx-M, blaTEM и blasHv у изолятов Enterobacterales с продукцией бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови.

Материалы и методы. Материалом исследования были изоляты Enterobacterales, выделенные из гемокультуры больных, находившихся на стационарном лечении в 10 лечебных учреждениях России (2003-2015 гг.). Продукция БЛРС у Enterobacterales была определена фенотипическими методами (CLSI 2017). Наличие генов, кодирующих ферменты TEM, SHV и CTX-M, определяли методом поли-меразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров. Результаты. Всего было исследовано 499 изолятов Enterobacterales с продукцией БЛРС. В структуре микроорганизмов преобладали Klebsiella pneumoniae (43,9%) и Escherichia coli (43,3%). Исследуемые гены были представлены у Enterobacterales как в сочетании (79%), так и изолированно (19,6%). Гены blacTx-м были наиболее распространенными (82,6%), далее следовали гены blaTEM (73,7%) и blasHv (53,7%). У 1,4% (n=7) изолятов Enterobacterales с продукцией БЛРС исследуемые гены blacTx-M, blaTEM, blasHv выявлены не были. Гены blacix-M были обнаружены у 84,9% K. pneumoniae, 89,8% E. coli и 42,6% Enterobacter cloacae. Гены blacTx-M принадлежали к кластерам blacTx-M-1 (88,8%), blacTx-M-9 (14,8%) и blacTx-M-2 (0,2%). Доля изолятов, имеющих сочетание генов двух разных кластеров blacTx-M, составила 4,1%.

Выводы. Среди Enterobacterales с продукцией БЛРС наиболее распространенными были гены blacTx-M (82,6%), основная доля которых принадлежала к кластеру blacTx-M-1 (88,8%). У большинства исследуемых изолятов (79%) было выявлено сочетание генов разных типов бета-лактамаз, а у 4,1% cTx-M-продуцирующих Enterobacterales - сочетание генов двух разных кластеров.

Molecular characterization of extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacterales isolates collected from blood culture in patients with hematological malignancies

Khrulnova S.A., Korobova A.G., Fyodorova A.V., Frolova I.N., Klyasova G.A.

National Medical Research Center of Hematology, Moscow, Russia

Objective. The objective of the study was to evaluate the prevalance of genes blaTEM, blasHv and blacrx-M among extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Enterobacterales isolates collected from blood culture in patients with hematological malignancies.

Materials and Methods. The prospective multicenter study included Enterobacterales isolates collected from blood culture in hematological patients from 10 Russian hospitals (2003-2015). The isolates were screened for ESBLs by the phenotypic methods (CLSI 2017). Genes encoding TEM, SHV and CTX-M were detected using polymerase chain reaction (PCR) by specific primers.

Results. A total of 499 ESBL-producing Enterobacterales were evaluated. Among them Klebsiella pneumoniae (43.9%) and Escherichia coli (43.3%) predominated. The tested genes were present in combination (79%) and alone (19.6%). Genes of blacTx-M were most common (82.6%), followed by blaTEM (73.7%) and blasHv (53.7%). The genes (blaTEM, blasHv and blacTx-M) were not detected in 1.4% (n=7) ESBL-producing Enterobacterales. Genes blacTx-M were in 84.9% K. pneumoniae, 89.8% E. coli and 42.6% Enterobacter cloacae. The blacTx-M genes belonged to the subtypes blacTx-M-1 (88.8%), blacTx-M-9 (14.8%) and blacTx-M-2 (0.2%). Two different subtypes of blacTx-M were in 4.1% Enterobacterales isolates. Conclusions. Among the ESBL-producing Enterobacterales isolates blacTx-M genes were most common (82.6%), the majority of them belonged to the blacTx-M-1 subtypes (88.8%). Most of Enterobacterales isolates (79%) harbored several types of beta-lactamases genes and 4.1% isolates carried two subtypes of blacTx-M.

contacts:

Svetlana A. Khrulnova E-mail: khrulnovas@mail.ru

Key words: Enterobacterales, ESBL, blood culture, beta-lactamase genes, hematological malignancies.

Хрульнова С.А. и соавт.

Введение

Грамотрицательные бактерии занимают одну из лидирующих позиций среди возбудителей бактериемии у им-мунокомпрометированных больных. В России по результатам многоцентрового исследования доля Enterobacterales в этиологии 640 случаев бактериемии у 478 больных, находившихся на стационарном лечении в гематологических отделениях, составила 32,4%. Ведущими представителями из них были E. coli (18,5%) и K. pneumoniae (7,8%) [1].

За последние десятилетия отмечено увеличение резистентности микроорганизмов к антимикробным препаратам, используемым в клинике. Серьезную проблему представляет распространение Enterobacterales с продукцией бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС). Особое значение БЛРС определяется, прежде всего, их способностью обуславливать устойчивость к цефалоспо-ринам 3-4 поколения, которые широко используют для лечения нозокомиальных инфекций. Сепсис, вызванный энтеробактериями с продукцией БЛРС, характеризуется тяжелым течением, удлинением периода госпитализации, высокой летальностью и увеличением финансовых затрат на лечение.

Сообщения о выделении первых штаммов энтеробак-терий с продукцией БЛРС в России относятся к 90-м годам XX века. В многоцентровом исследовании «Micromax», проведенном в 1997-1998 гг., было показано, что в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) ряда учреждений распространение БЛРС среди E. coli приближалось к 40%, а среди Klebsiella spp. превышало 90% [2]. В другом российском многоцентровом исследовании, проведенном в тот же период (1997-1998 гг.), доля БЛРС-продуцентов составляла в среднем 15,8% среди E. coli и 60,8% среди K. pneumoniae, сильно варьируя в разных стационарах [3]. За короткий промежуток времени распространение БЛРС среди нозокомиальных штаммов Enterobacterales, выделенных в ОРИТ, значительно увеличилось. Так, уже в 2003 г. доля БЛРС-продуцирую-щих K. pneumoniae достигла 84,3%, E. coli - 54,7% [4]. Частота детекции БЛРС у энтеробактерий, выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови (20002015 гг.), составила 40% (у 483 из 1203 изолятов), из них у Klebsiella spp. - 58%, у E. coli - 40% [5].

Первый клинический изолят, продуцирующий БЛРС, был выделен в 1982 г. в Ливерпуле (Англия) [6]. Это был изолят Klebsiella oxytoca, выделенный из крови и спинномозговой жидкости новорожденного, находившегося в отделении реанимации. Устойчивость к цефтазидиму у K. oxytoca была обусловлена продукцией ранее неизвестного фермента TEM-E2. Позднее было проведено секвенирование, и этот фермент был отнесен к TEM-12 типу БЛРС [7]. Далее в 1983 г. во Франкфурте (Германия) были выделены изоляты K. pneumoniae и один изо-лят Serratia marcescens, устойчивые к цефалоспоринам 3 поколения, которые продуцировали новый фермент БЛРС - SHV-2 [8, 9]. Среди ферментов TEM и SHV типов могут быть бета-лактамазы как широкого спектра, так и расширенного спектра, представителями последних являются TEM-12 и SHV-2. Различие в нуклеотидной последовательности генов, кодирующих бета-лактамазы широкого спектра и БЛРС, составляет всего несколько

нуклеотидов, и их разделение возможно только при проведении секвенирования.

БЛРС, относящиеся к CTX-M типу, были описаны в 1990 г. [10]. Эти ферменты были обнаружены у E. coli, выделенной от ребенка с отитом. Все ферменты CTX-M типа относятся к БЛРС, в отличие от ферментов TEM и SHV типов. Несмотря на более позднее появление, ферменты CTX-M в настоящее время стали доминирующими у энтеробактерий с продукцией БЛРС. Бета-лактамазы CTX-M типа подразделяются на пять основных филогенетических кластеров на основании анализа нуклеотидной последовательности кодирующих их генов, такие как СТХ-М-1, СТХ-М-2, СТХ-М-8, СТХ-М-9, СТХ-М-25. Ключевую роль в распространении генов blaCTX-M играют мобильные генетические элементы - инсерционные последовательности, интегроны, транспозоны и плазмиды. В настоящее время известно более 170 вариантов ферментов CTX-M типа (www.lahey.org/Studies/).

Основная часть исследований, как в иностранной литературе, так и в российской, касается изучения БЛРС у клинически значимых изолятов Enterobacterales, выделенных из разных локусов от разных категорий больных, находящихся на лечении в многопрофильных стационарах. Целью настоящего исследования являлось изучение распределения генов blaCTx-M, blajEM и blaSHV среди БЛРС-про-дуцирующих Enterobacterales, выделенных только из гемо-культуры больных опухолями системы крови.

Материалы и методы

Источники бактериальных изолятов

Материалом исследования были изоляты Enterobacterales с продукцией БЛРС (n=499), выделенные из гемокуль-туры больных, находившихся на стационарном лечении в гематологических отделениях 10 лечебных учреждений 8 городов России (Москва, Иркутск, Новосибирск, Барнаул, Челябинск, Сургут, Самара, Ростов-на-Дону) с 2003 по 2015 гг. В исследование включали первый изолят, выделенный из гемокультуры. Все изоляты были доставлены в лабораторию ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, где были проведены окончательная идентификация микроорганизмов, определение чувствительности к антимикробным препаратам методом серийных микроразведений в бульоне и детекция генов резистентности к бета-лактамным антибиотикам.

Видовая идентификация и хранение

Идентификацию полученных изолятов до вида проводили в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России до 2012 г. с помощью тест-систем API 20E (BioMerieux, Франция), с 2012 г. - методом матричной лазерной десорбци-онной ионизационной времяпролетной масс-спектроме-трии (MALDI-TOF MS) на анализаторе Microflex LT (Bruker Daltonics, Германия). Для идентификации полученных изо-лятов до вида брали изолированные колонии бактерий. Ионизацию бактериальных белков осуществляли с помощью специального реагента - матрицы (а-циано-4-гидрок-сикоричная кислота и раствор, содержащий 50% ацетони-трила и 2,5% трифторуксусной кислоты). Идентификацию проводили в автоматическом режиме с использованием программы MALDI Biotyper Real Time Classification, версия

Хрульнова С.А. и соавт.

3.1 (Bruker Daltonics, Германия). В качестве критерия надежной видовой идентификации использовали рекомендуемые значения коэффициента совпадения («Score») от 2,0 и выше. До проведения исследований изоляты хранили при температуре -70°С в триптиказо-соевом бульоне с добавлением 20% глицерина.

Фенотипическая детекция бета-лактамаз

Для выявления продукции БЛРС у изолятов Enterobacterales проводили параллельное определение минимальных подавляющих концентраций (МПК) цефта-зидима и цефотаксима и их комбинаций с клавулановой кислотой [11]. Снижение МПК цефтазидима или цефо-таксима не менее чем в 8 раз (на 3 последовательных двукратных разведения) в присутствии ингибитора, в сравнении со значениями МПК соответствующих це-фалоспоринов без ингибиторов, свидетельствовало о продукции БЛРС. Для внутреннего контроля качества использовали референтные штаммы E. coliATCC®25922 и K. pneumoniae ATCC®700603 (SHV-12).

Определение генов бета-лактамаз

Наличие генов резистентности blaTEM и blaCTX-M определяли методом ПЦР с использованием наборов реагентов для выявления генов бета-лактамаз TEM и CTX-M типов («Литех», Россия), генов blaSHV - методом ПЦР в режиме реального времени с использованием специфических праймеров (179-s-F 5'-CGATGAACGCTTTCCCATGA-3';

280-s-R 5'-AGATCCTGCTGGCGATAGT-3'). Амплификацию проводили в термоциклере CFX96 Touch (BioRad, США).

Определение генов кластеров blaCTX-M-i, blaCTX-M-2, blaCTx-M-8, blaCTx-M-9 и blaCTx-M-25 проводили методом ПЦР с использованием специфических праймеров, представленных в статье Wooaford N. и соавт. [12].

Результаты

Всего было исследовано 499 изолятов Enterobacte-rales с продукцией БЛРС, выделенных из гемокульту-ры больных опухолями системы крови, которые были представлены 8 видами бактерий с преобладанием K. pneumoniae (43,9%) и E. coli (43,3%), Таблица 1. В этой когорте микроорганизмов E. cloacae составили 9%, остальные виды суммарно - 3,8%.

В Таблице 2 представлено распределение изучаемых генов бета-лактамаз. В геномах БЛРС-позитивных Enterobacterales преобладали гены blaCTX-M (82,6%), далее следовали гены blaTEM (73,7%) и blaSHV (53,7%). Ферменты CTX-M типа были представлены в сопоставимых долях у изолятов E. coli (89,8%) и K. pneumoniae (84,9%), только у 42,6% E. cloacae. TEM тип бета-лакта-маз преобладал у E. cloacae (82,2%) и у Enterobacterales, объединенных в группу «другие» (94,7%). Гены blaSHV были обнаружены почти у половины изолятов E. cloacae (48,9%) и лишь у 13,9% E. coli. У 1,4% (n=7) изолятов Enterobacterales с продукцией БЛРС исследуемые гены blaCTX-M, blaTEM, blaSHV выявлены не были.

Гены исследуемых типов бета-лактамаз были представлены у Enterobacterales в сочетаниях и изолированно. У большинства изолятов Enterobacterales с продукцией БЛРС (79%) было выявлено сочетание генов разных типов бета-лактамаз (CTX-M, TEM и SHV), изолированно - только у 19,6% изолятов (Таблица 2). Максимальная доля изо-лятов, имеющих комбинации генов бета-лактамаз разных типов, была определена у K. pneumoniae (94%), и среди них преобладало присутствие одновременно всех трех исследуемых генов (66,2%). Сочетание исследуемых генов резистентности определялось реже у E. coli (64,8%) и E. cloacae (75,6%). В геномах E. cloacae с продукцией

Таблица 1. Видовой состав изолятов Е^егоЬайега^ с продукцией БЛРС, выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови

Вид микроорганизмов Количество изолятов, n (%)

Klebsiella pneumoniae 219 (43,9)

Escherichia coli 216 (43,3)

Enterobacter cloacae 45 (9)

Klebsiella oxytoca 6 (1,2)

Proteus mirabilis 5 (1)

Serratia marcescens 4 (0,8)

Citrobacter freundii 2 (0,4)

Pluralibacter gergoviae 2 (0,4)

Таблица 2. Гены бета-лактамаз у изолятов Enterobacterales с продукцией БЛРС

Гены бета-лактамаз Изоляты, n (%)

K. pneumoniae, E. coli, E. cloacae, Другие*, Всего

n=219 n=216 n=45 n=19 n=499

blaoX-M + blaTEM + blaSHV 145 (66,2) 14 (6,5) 3 (6,7) 0 162 (32,5)

blaCTX-M + blaTEM 4 (1,8) 111 (51,4) 15 (33,3) 11 (57,9) 141 (28,3)

blaTEM + blaSHV 20 (9,1) 8 (3,7) 16 (35,6) 3 (15,8) 47 (9,4)

blaCTX-M + blaSHV 37 (16,9) 7 (3,2) 0 0 44 (8,8)

blaCTX-M 0 62 (28,7) 2 (4,4) 1 (5,3) 65 (13,0)

blaTEM 1 (0,5) 10 (4,6) 3 (6,7) 4 (21,1) 18 (3,6)

blaSHV 11 (5,0) 1 (0,5) 3 (6,7) 0 15 (3,0)

Не определены 1 (0,5) 3 (1,4) 3 (6,7) 0 7 (1,4)

Всего blaCTX-M 186 (84,9) 194 (89,8) 20 (42,6) 12 (63,2) 412 (82,6)

Всего blaTEM 170 (77,6) 143 (66,2) 37 (82,2) 18 (94,7) 368 (73,7)

Всего blaSHV 213 (97,3) 30 (13,9) 22 (48,9) 3 (15,8) 268 (53,7)

* K. oxytoca (n=6), P. mirabilis (n=5), S. marcescens (n=4), C. freundii (n=2), P. gergoviae (n=2).

Хрульнова С.А. и соавт.

БЛРС в равных долях присутствовали комбинации генов blacTx-M + blaTEM (33,3%) и blaTEM + blaSHV (35,6%), а у E. coli преобладали гены blacTx-M + blaTEM (51,4%). Наличие генов бета-лактамаз только одного типа чаще выявлялось у E. coli (33,8%) и было представлено генами bfacTx-M (28,7%), Таблица 2.

Гены blacTx-M, обнаруженные у изолятов Enterobacte-rales с продукцией БЛРС, принадлежали к трем кластерам. Наиболее распространенными были гены кластера bacTx-M-1 (88,8%), реже выявляли blacTx-M-9 (14,8%) и blacTx-M-2 (0,2%), Рисунок 1. Гены кластеров blacTx-M-s и blacTx-M-25 обнаружены не были.

Гены кластера blacTx-M-1 преобладали у всех исследуемых видов Enterobacterales и были представлены как изолированно (78,9-100%), так и в сочетаниях (0,54,8%), Таблица 3. Гены бета-лактамаз двух разных кластеров cTx-M были выявлены у 17 (4,1%) из 412 изоля-тов. Наиболее распространенным было сочетание генов кластеров blacTx-M-1 + blacTx-M-9 (3,9%) и определялось у K. pneumoniae (4,8%) и E. coli (3,6%). Гены кластера blacTx-M-9 были обнаружены у 61 изолята Enterobacterales, преобладали у E. coli (у 41 из 61 изолята), были представлены в основном изолировано (в 45 из 61), сочетание определялось с генами кластера blacTx-M-1 (у 16 из 61). Ген кластера blacTx-M-2 был обнаружен только у одного изолята K. pneumoniae в комбинации с геном кластера blacTx-M-1 (0,2%). У 1 (0,2%) из 412 cTx-M-продуци-рующих изолятов Enterobacterales не были установлены исследуемые кластеры ферментов.

На Рисунке 2 представлено распределение генов разных кластеров cTx-M типа в исследуемые временные периоды. Гены кластера bfacTx-M-1, определяемые изолированно, доминировали в течение всего исследования.

88,8 я

14,8

0,2 0 ^ О

СГХ-М-1

СТХ-М-2

СТХ-М-8

СТХ-М-9

СГХ-М-25

Рисунок 1. Распределение генов бета-лактамаз, относящихся к разным кластерам СТХ-М, у изолятов Е^егоЬасЛегае с продукцией БЛРС

90,1

84,2

8,5

| |оМо

83,4

13,2

0 ?'60,5

9,3

■ СТХ-М-1 II СТХ-М-9

СТХ-М-1 +СТХ-М-2

■ СТХ-М-1+СТХ-М-9 II не определены

6,6

И °-7Гю

Число 2003-2006 2007-2010 2011-2015

изолятов п=71 п=191 п=150 годы

с продукцией

СТХ-М

Рисунок 2. Распределение генов разных кластеров БЛРС СТХ-М типа в исследуемые временные периоды

Однако за анализируемый период произошло их снижение с 90,1% (2003-2006 гг.) до 83,4% (2011-2015 гг.) за счет увеличения сочетания с генами других кластеров Ь/астХ-М. Следующими по распространенности были гены кластера Ь/аСТХ-М-9, представленные изолированно в геномах Еп1егоЬас1ега^, и их доля варьировала от 8,5% до 13,2%. С течением времени наблюдалась отчетливая

66,7

89,2

93,5

92,0

86,1

96,9

Число 2003-2004 2005-2006 2007-2008 2009-2010 2011-2012 2013-2015 годы изолятов п=10 п=33 п=43 п=46 п=31 п=31

ст£-м"

(%) К.pneumoniae

50,0

96,5

78,4

65,0

91,7

97,1

Число 2003-2004 2005-2006 2007-2008 2009-2010 2011-2012 2013-2015 годы изолятов п=11 п=13 п=29 п=55 п=44 п=34 с продукцией СТХ-М

Рисунок 3. Динамика распределения генов blacTx-M у E. coli (A) и K. pneumoniae (Б) с продукцией БЛРС

Таблица 3. Гены кластеров бета-лактамаз cTx-M типа у изолятов Enterobacterales с продукцией БЛРС

Гены кластеров Изоляты, n (%)

CTX-M K. pneumoniae E. coli E. cloacae Другие* Всего

n=186 n=194 n=20 n=12 n=412

blacTx-M-i 165 (88,7) 153 (78,9) 20 (100) 11 (91,7) 349 (84,7)

blacrx-M-g 10 (5,4) 34 (17,5) 0 1 (8,3) 45 (10,9)

blacTx-M-1 + blacrx-M-g 9 (4,8) 7 (3,6) 0 0 16 (3,9)

blacrxM-i + blacrxM-2 1 (0,5) 0 0 0 1 (0,2)

Не определены 1 (0,5) 0 0 0 1 (0,2)

* K. oxytoca (n=6), P. mirabilis (n=4), S. marcescens (n=1), C. freundii (n=1).

Хрульнова С.А. и соавт.

тенденция к увеличению доли изолятов Enterobacterales, несущих комбинацию генов кластеров b/acrx-M-i и b/acTx-м-э с 1,4% (2003-2006 гг.) до 6,6% (2011-2015 гг.). Следует отметить, что более поздний анализируемый период (2011-2015 гг.) характеризовался наибольшим разнообразием вариантов присутствия генов b/aCTX-M в геномах изолятов Enterobacterales, как изолировано, так и в сочетаниях (Рисунок 2).

Динамика распределения генов бета-лактамаз CTX-M типа среди K. pneumoniae и E. co/i, ведущих представителей Enterobacterales, в разные периоды исследования представлена на Рисунке 3. Существенное увеличение доли CTX-M-позитивных изолятов с последующим выходом на плато среди изолятов E. co/i произошло в более ранний период в сравнении с изолятами K. pneumoniae. Так, доля изолятов E. co/i, несущих гены b/aCTX-M, увеличилась с 66,7% до 89,2% при сравнении 2003-2004 гг. и 2005-2006 гг., достигла 93,5% в 2007-2008 гг., выйдя на плато в последующие годы исследования (Рисунок 3, А). У K. pneumoniae увеличение доли изолятов с продукцией ферментов CTX-M типа происходило более плавно в сравнении с изолятами E. co/i, и в 20092010 гг. их доля составила 96,5% (Рисунок 3, Б).

Обсуждение

Основными представителями Enterobacterales с продукцией БЛРС, выделенными из гемокультуры больных опухолями системы крови, были K. pneumoniae (43,9%) и E. co/i (43,3%), как и в ранее проведенном нами исследовании [1]. Однако в отличие от исследования 20032005 гг. [1], в котором продуценты БЛРС были представлены тремя видами Enterobacterales (K. pneumoniae, E. co/i и P. mirabi/is), в данной работе спектр Enterobacterales с продукцией БЛРС был шире и состоял из 8 видов, включая такие возбудители как E. c/oacae, K. oxytoca, S. marcescens, C. freundii, P. gergoviae. Преобладание K. pneumoniae и E. co/i среди продуцентов БЛРС и в то же время видовое расширение БЛРС-пози-тивных Enterobacterales среди клинически значимых возбудителей инфекций в многопрофильных стационарах было отмечено и другими исследователями [4, 13, 14].

В России, как и во всем мире, отмечено увеличение доли БЛРС-продуцирующих изолятов, содержащих гены бета-лактамаз CTX-M типа. В представленном исследовании гены b/aCTX-M доминировали и были определены в геномах 82,6% БЛРС-позитивных изолятов Enterobacterales, выделенных из гемокультуры, гены b/aTEM и b/aSHV - в 73,7% и 53,7% соответственно. У БЛРС-продуцирую-щих изолятов Enterobacterales, выделенных от больных в многопрофильных стационарах (2002-2007 гг.), частота детекции генов b/aSHV была сопоставима с нашими результатами и составляла 45-55%, генов b/aTEM - 43-47%, причем в этих исследованиях видовой состав бактерий, включая K/ebsie//a spp. (39-47%), был сопоставимым с нашим исследованием [13, 15]. Как отмечалось ранее, метод ПЦР не позволяет дифференцировать бета-лакта-мазы типов TEM и SHV на ферменты широкого и расширенного спектра и вполне определенно, что изучаемые нами изоляты Enterobacterales с продукцией БЛРС имели и гены бета-лактамаз широкого спектра.

Хрульнова С.А. и соавт.

Сочетание генов разных типов бета-лактамаз было обнаружено у 79% Enterobacterales, выделенных из гемо-культуры больных опухолями системы крови, и этот показатель был выше, чем в других российских исследованиях (40-68%) [13, 15]. В работах других исследователей при анализе продуцентов БЛРС, выделенных из гемокультуры больных в многопрофильных стационарах, частота детекции комбинации генов разных типов бета-лактамаз у изо-лятов E. coli была сопоставима с нашими данными, и были выявлены некоторые отличия по изолятам K. pneumoniae. В исследовании Wang S. и соавт. [16] комбинация генов двух типов бета-лактамаз преобладала у изолятов E. coli, выделенных из гемокультуры больных в многопрофильных стационарах (62,3%). Нами было выявлено сочетание двух типов бета-лактамаз у 58,5% E. coli. В работе Cubero M. и соавт. [17] детекция сочетания генов двух или трех типов бета-лактамаз у K. pneumoniae составила 96,7% и была сопоставима с нашими данными (94%). Отличия были выявлены по числу сочетаний. Так, в исследовании Cubero M. и соавт. [17] 80% сочетаний были представлены двумя генами, а по нашим данным, у 66,2% изолятов K. pneumoniae определялись гены трех ферментов. Вероятно, наблюдаемые различия в соотношении частоты детекции генов двух или трех типов ферментов связаны с категорией больных, от которых были получены исследуемые изоляты K. pneumoniae. Для больных опухолями системы крови характерным является длительное, неоднократное пребывание в стационаре, и вполне определенно, что у микроорганизмов, колонизирующих слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, создаются условия для обмена генетической информацией, а транслокация бактерий из кишечника относится к основному механизму развития инфекций кровотока в период нейтропении.

В геномах исследуемых нами изолятов Enterobacterales были обнаружены гены трех кластеров blaCTX-M (blaCjx-M-i, blaCjx-M-2 и blaCjX-M-9), из которых доминировали гены кластера blaCjX-M-i (88,8%) аналогично другим российским исследованиям (94,1-93,8%) [4, 13]. Преобладание генов кластера blaCTX-M-i было подтверждено и другими исследованиями. Так, во Франции гены кластера blaCTX-M-i были обнаружены у 87% E. coli, выделенных из гемокультуры больных с онкогематологическими заболеваниями [18], в Китае этот показатель был несколько ниже и составил 63,2% у изолятов E. coli, выделенных из гемокультуры больных без опухолей системы крови [16]. В то же время следует отметить, что не во всех странах гены кластера blaCTX-M-i являются доминирующими. В Юго-Восточной Азии, Южной Корее, Японии и Испании преобладали гены, относящиеся к кластеру blaCTX-M-9, а в Южной Америке - к кластеру blaCTX-M-2 [19]. В Испании частота детекции генов кластера blaCTX-M-9 у E. coli, колонизирующих слизистую оболочку кишечника больных с гематологическими заболеваниями, составила 55% [20], в нашем исследовании - только у 14,8% Enterobacterales. В Японии гены кластера blaCTX-M-9 преобладали у Enterobacterales, выделенных из гемокультуры (43,2%) [21], и среди изо-лятов, вызвавших внебольничные инфекции (66,9%) [22]. Только один (0,2%) из исследуемых нами изолятов Enterobacterales содержал в своем геноме ген кластера blaCTX-M-2. В других исследованиях частота детекции генов

кластера Ыастх-м-2 также была невысокой и варьировала от полного отсутствия до 7-13,4% [3, 20, 22].

Гены разных кластеров blaCTX-M были представлены в основном изолированно (95,6%), а у 4,1% изолятов в сочетании с преобладанием Ь1астх-м-1 + Ь1астх-м-9 (3,9%). В исследовании Прямчук С.Д. и соавт. [13] сочетание генов кластеров ЫаСТХ-М-1+ЫаСТХ-М- 9 было выявлено только у

0.8. исследуемых изолятов. Более высокий процент обнаружения в сочетаниях генов разных кластеров blaCTX-M в нашем исследовании в сравнении с другими исследованиями в России, вероятно, также можно объяснить категорией больных, от которых они были выделены.

В нашем исследовании, как и в ранее опубликованной работе Эйдельштейн М.В. и соавт. [4], были показаны разные временные тенденции в распространении генов blaCTX-M у изолятов E. coliи K. pneumoniae. Увеличе-

Литература

1. Klyasova G.A., Speranskaya L.L., Mironova A.V., et al. The pathogens causing sepsis in immunocompromized patients: structure and problems of antibiotic resistance. Results of a multi-center cooperative study. Gemetologiya i transfuziologiya. 2007;52(1):13-18. Russian. (Клясова Г.А., Сперанская Л.Л., Миронова А.В. и соавт. Возбудители сепсиса у иммунокомпрометированных больных: структура и проблемы антибиотикорезистентности (результаты многоцентрового исследования). Гематология и трансфузиология. 2007;52(1):13-18.).

2. Sidorenko S.V., Stratchounski L.S., Ahmedova L.I., et al. The results of the multicenter study of the comparative activity of cefepime and other antibiotics against pathogens of severe nosocomial infection (the program "Micromax"). Antibiotiki i khimioterapiya. 1999;44(11):7-16. Russian. (Сидоренко С.В., Страчунский Л.С., Ахмедова Л.И. и соавт. Результаты многоцентрового исследования сравнительной активности цефепима и других антибиотиков в отношении возбудителей тяжелых госпитальных инфекций (программа «Micromax»). Антибиотики и химиотерапия. 1999;44(11):7-16.).

3. Eidelstein M., Pimkin M., Palagin I., Eidelstein I., Stratchounski L. Prevalence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spectrum р-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47:3724-3732.

4. Eidelstein M.V, Strachounski L.S. Trends in the prevalence and susceptibility of ESBL-producing Entererobacteriaceae to various antimicrobial agents in Russian ICUs. Klinicheskaya mikrobiologiya antimikrobnaya khimioterapiya. 2005;7(4):323-336. Russian. (Эйдельштейн М.В., Страчунский Л.С. Динамика распространенности и чувствительности БЛРС-продуцирующих штаммов энте-робактерий к различным антимикробным препаратам в ОРИТ России. Клиническая микробиология антимикробная химиотерапия. 2005;7(4):323-336.)

5. Klyasova G.A. Okhmat V.A. Antimicrobial therapy. In: Savchenko V.G., ed. Algorithms of diagnosing and protocols of treatment of blood system diseases. Moscow: Praktika; 2018. P.1069-1113. Russian. (Клясова Г.А. Охмат В.А. Антимикробная терапия. Под редакцией Савченко В.Г. Алгоритмы диагностики и протоколы лечения заболеваний системы крови. Москва: Практика; 2018. с.1067-1113.).

6. Payne D.J., Marriott M.S., Amyes S.G. Characterization of a unique ceftazidime-hydrolysing beta-lactamase, TEM-E2. J Med Microbiol. 1990;32(2):131-134.

7. Heritage J., Hawkey P.M., Todd N., Lewis I.J. Transposition of the gene encoding a TEM-12 extended-spectrum beta-lactamase. Antimicrob Agents Chemother. 1992;36(9):1981-1986.

8. Knothe H., Shah P., Krcmery V., Antal M., Mitsuhashi S. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens.

Infection. 1983;11(6):315-317.

9. Kliebe C., Nies B.A., Meyer J.F., Tolxdorff-Neutzling R.M., Wiedemann B. Evolution of plasmid-coded resistance to broad-spectrum cephalosporins. Antimicrob Agents Chemother. 1985;28(2):302-307.

10. Bauernfeind A., Schweighart S., Grimm H. A new plasmidic cefotaximase in a clinical isolate of Escherichia coli. Infection. 1990;18(5):294-298.

ние почти в 1,5 раза доли cTx-M-продуцирующих E. coli произошло в более ранний период в сравнении с изоля-тами K. pneumoniae.

Заключение

Данное исследование показало, что среди изолятов БЛРС-продуцирующих Enterobacterales, выделенных из гемокультуры больных опухолями системы крови, преобладали гены blacTx-M (82,6%), из них основная доля принадлежала к кластеру blacTx-M-1 (88,8%). Особенностью микроорганизмов, выделенных из гемокультуры, было наличие сочетания генов двух или трех типов бе-та-лактамаз у большинства исследуемых изолятов (79%) и генов двух разных кластеров у cTx-M-продуцирующих Enterobacterales (4,1%).

11. clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Seventh Informational Supplement. cLSI document M100-S27. Wayne, PA: clinical and Laboratory Standards Institute; 2017.

12. Woodford N., Fagan EJ., Ellington MJ. Multiplex PcR for rapid detection of genes encoding cTx-M extended-spectrum (beta)-lactamases. J Antimicrob chemother. 2006;57(1):154-155.

13. Pryamchuk S.D., Fursova N.K., Abaev I.V., et al. Genetic determinants of antibacterial resistance among nosocomial Escherichia coli, Klebsiella spp., and Enterobacter spp. isolates collected in Russia within 2003-2007. Antibiotiki i khimioterapiya. 2010;55(9-10):3-10. Russian. (Прямчук С.Д., Фурсова Н.К., Абаев И.В. и соавт. Генетические детерминанты устойчивости к антибактериальным средствам в нозокомиальных штаммах Escherichia coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., выделенных в России в 2003-2007 гг. Антибиотики и химиотерапия. 2010;55(9-10):3-10.).

14. Robin F., Beyrouthy R., Bonacorsi S., et al. Inventory of extended-spectrum-ß-lactamase-producing Enterobacteriaceae in France as assessed by a multicenter study. Antimicrob Agents chemother. 2017;61(3):e01911-16.

15. Sidorenko S.V., Berezin A.G., Ivanov D.V. Molecular mechanisms of cephalosporins resistance in gramnegative bacteria of the Enterobacteriaceae family. Antibiotiki i khimioterapiya. 2004;49(3):6-16. Russian. (Сидоренко С.В., Березин А.Г., Иванов Д.В. Молекулярные механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae к цефалоспориновым антибиотикам. Антибиотики и химиотерапия. 2004;49(3):6-16.).

16. Wang S., Zhao S.Y., xiao S.Z., et al. Antimicrobial resistance and molecular epidemiology of Escherichia coli causing bloodstream infections in three hospitals in Shanghai, china. PLoS One. 2016;11(1):e0147740.

17. cubero M., Grau I., Tubau F., et al. Molecular Epidemiology of Klebsiella pneumoniae strains causing bloodstream infections in adults. Microb Drug Resist. 2018;24(7):949-957.

18. Denis B., Lafaurie M., Donay J.L., et al. Prevalence, risk factors, and impact on clinical outcome of extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli bacteraemia: a five-year study. Int J Infect Dis. 2015;39:1-6.

19. Bevan E.R., Jones A.M., Hawkey P.M. Global epidemiology of cTx-M ß-lactamases: temporal and geographical shifts in genotype. J Antimicrob chemother. 2017;72:2145-2155.

20. Arnan M., Gudiol c., calatayud L., et al. Risk factors for, and clinical relevance of, faecal extended-spectrum ß-lactamase producing Escherichia coli (ESBL-Ec) carriage in neutropenic patients with haematological malignancies. Eur J clin Microbiol Infect Dis. 2011;30(3):355-360.

21. Noguchi T., Matsumura Y., Yamamoto M., et al. clinical and microbiologic characteristics of cefotaxime-non-susceptible Enterobacteriaceae bacteremia: a case control study. BMc Infect Dis. 2017;17(1):44.

22. Shibasaki M., Komatsu M., Sueyoshi N., et al. community spread of extended-spectrum ß-lactamase-producing bacteria detected in social insurance hospitals throughout Japan. J Infect chemother. 2016;22(6):395-399.

Хрульнова С.А. и соавт.