CC BY
98
А.Л. БИСЕКЕНОВА, Б.А. РАМАЗАНОВА, А.А. МУСАЕВА, Ш.М. НУРМОЛДИН,
Ж.С. АЛИБАЕВА, Ш.Е. УГЫШОВА
АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ШТАММОВ ENTEROBACTERIACEAE, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВ МНОГОПРОФИЛЬНЫХ
СТАЦИОНАРОВ
УДК 579.842.17:57.063.8:615.281:579.252.55:615.859
В данной работе представлены этиологическая структура хирургических инфекций в многопрофильных стационарах гАлматы (214 клинически значимых бактериальных изолятов), распределение видов выделенных энтеробактерий, результаты оценки чувствительности к антибактериальным препаратам 82 изолятов Enterobacteriaceae. Энтеробактерии составили в общей сложности 38,32% всех выделенных бактериальных возбудителей, наиболее частыми видами были Escherichia coli (23,83%) и Klebsiella pneumonia (4,21%). Продукция ß-лактамаз расширенного спектра действия (ESBL) обнаружена у 56,1% изолятов Enterobacteriaceae, в том числе, у 70,59% E.coli и 77,78% K.pneumoniae. При генотипической детекции у всех резистентных к цефалоспоринам Ш-^поколений штаммов E.coli в геноме и в плазмиде регистрировались гены TEM, из них 43,5% - изоляты, несущие только ген TEM; 43,5% - изоляты, несущие одновременно гены двух групп бета-лактамаз TEM1+CTX-M1; 13% - комбинацию генов TEM1+CTX-M1+OXA. У всех 7 резистентных к цефалоспоринам штаммов K.pneumoniae в геноме и плазмиде выявлены гены TEM-1, у 4 штаммов - комбинация генов TEM-1+CTX-M-1.
Ключевые слова: Enterobacteriaceae, Escheriсhiacoli, Klebsiella pneumoniae, антибиотикорезистентность, ß-лактамазы расширенного спектра.
Введение. Известно, что в этиологической структуре нозокомиальных и внебольничных инфекций ведущая роль принадлежит энтеробактериям. По результатам многоцентрового эпидемиологического исследования антибиотикорезистентности
возбудителей нозокомиальных инфекций МАРАФОН в 2011-2012 гг. в стационарах России энтеробактерии составили в общей сложности 33,7% всех выделенных бактериальных возбудителей. Наиболее частыми видами были Klebsiella pneumoniaе (16,9%), Eschen^ia coli (7,9%) и Enterobacter cloacae (2,6%) [1].В сравнении с аналогичными показателями, полученными в исследованиях, проведенных в России ранее, отмечалась тенденция к нарастанию: доля изолятов Enterobacteriaceae составила в 20022004 гг. 30,1% и 34,5% в 2006-2007 гг. [2, 3]. Наиболее клинически значимой является проблема резистентности грамотрицательных бактерий к современным цефалоспоринам и карбапенемам вследствие эпидемического распространения штаммов, продуцирующих ß-лактамазы
расширенного спектра действия[4,5,6,7, 8]. Гены, кодирующие ß-лактамазы описаны у многих возбудителей инфекций, особенно нозокомиальных. В разных регионах мира преимущественное распространение получили разные варианты таких генов. Наиболее значимыми в эпидемическом плане относятся гены, кодирующие БЛРС CTX-M-типа [9.10,11].
Целью настоящего исследования явилось изучение резистентности штаммов Enterobacteriaceae, выделенных от пациентов многопрофильных стационаров г. Алматы к бета - лактамным антибиотикам, анализ его молекулярных механизмов для выработки локальной эпидемиологической карты распространения bla-генов Материалы и методы.В исследование были включены 214 клинически значимых бактериальных изолятов, собранные в рамках внутривузовского научного проекта: «Мониторинг резистентности возбудителей внебольничных и нозокомиальных инфекций к антимикробным препаратам и изучение его молекулярных механизмов» в двух многопрофильных стационарах (отделений гнойной
хирургии, урологии ГКБ г. Алматы №4, 12). Материалом для микробиологических исследований служили: отделяемое раневых поверхностей, дренажей при абдоминальных инфекциях, моча. Из них 82 изолята - представители семейства Enterobacteriaceae, были изучены на предмет продукции БЛРС. Выделение и первичная идентификация бактериальных изолятов проводилась в лаборатории кафедры микробиологии КазНМУ им. С. Д. Асфендиярова. Окончательная видовая идентификация и определение их чувствительности к антимикробным препаратам проводились в НКДЛ НИИ им. Атчабарова. Все исследованные изоляты были идентифицированы до вида и определена их антибиотикочувствительность на бактериологическом автоматизированном анализаторе "VITEK-2 Compact". Также дополнительно использовали классический диско-диффузионный метод определения
антибиотикочувствительности на агаре Мюллера -Хинтона.
Для фенотипического выявления продукции БЛРС использовали метод двойных дисков [12]. По наличию расширенной зоны подавления роста между дисками с цефтазидимом (CAZ, 30 мкг), цефепимом (CPM, 30 мкг) и диском, содержащим комбинацию амоксициллина с клавулановой кислотой (AMC20/10 мкг). Для контроля качества определения чувствительности использовали штаммы E.coli ATCC 25922, K.pneumoniae ATCC 700603 (ESBL+). Детекцию наиболее распространенных и клинически значимых генов класса А (TEM1, STX-M1, SHV, OXA) для культур с подтвержденным ESBL - фенотипом проводили методом ПЦР[13]. Выделение геномной и плазмидной ДНК грамотрицательных бактерий был произведен по стандартной методике с помощью набора Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit (выделение геномной ДНК) и Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit (выделение плазмидной ДНК) (TransGenBiotech, Китай). Использовалось 5 мл 18-20-часовой культуры бактерий.
Для проведения полимеразной цепной реакции на 4 пар генов БЛРС (TEM1, CTX-M1, SHV, OXA) использованные праймеры приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Использованные праймеры
Ген Направление праймера Последовательность Длина продукта (п.н.)
OXA f ACACAATACATATCAACTTCGC 814
r AGTGTGTTTAGAATGGTGATC
TEM1 f TCAACATTTTCGTGTCGCCCT 765
r ACTACGATACGGGAGGGCTT
SHV f GGTTATGCGTTATATTCGCC 865
r TTAGCGTTGCCAGTGCTC
CTX-M1 f ATGTGCAGYACCAGTAARGT 593
r TGGGTRAARTARGTSACCAGA
Для ПЦР реакции использовалось 10 пмоль каждых праймеров и 20 нг геномной и плазмидной ДНК бактерий, таким образом, проводилось 2 реакций на 1 образец. ПЦР проводилось следующей программой 95°С - 5 мин, 95°С 45сек, 53.5° (60°, 54°, 55°С) 45 сек 35 циклов соответственно, 72°С - 45 сек, и окончательный отжиг 72°С - 10 мин. Использовался готовый мастер микс Platinum® PCRSuperMix (LifeTechnologies, CAUSA) объем реакции составлял 25 мкл, ПЦР проводился на BioRadIQ5 (Bio-RadLaboratories, Inc., CAUSA). Последующая детекция генов осуществлялась на 1% агарозном геле с добавлением
характеризуется определенной длиной, что дает нам качественные результаты. Результаты исследования.
В этиологической структуре инфекций (n=214) в многопрофильных стационарах г.Алматы грамотрицательные микроорганизмы в совокупности занимают ведущую роль - 116 изолятов (54,2%) . Доля изолятов семейства Enterobacteriaceae среди всех возбудителей хирургических инфекций составила - 82 (38,32%), наиболее частыми видами были Escherichia coli (23,83%) и Klebsiella pneumonia (4,21%). Доля изолятов неферментирующих
- 31 (14,49%)
этидиум бромида. Каждый ген
грамотрицательных бактерий составила (рисунок 1).
Этиологическая структура инфекций в хирургических стационарах г.Алматы
1,40%
Гр(+)кокки Энтеробактерии Гр(-)неферм.бактерии Бактерии др.групп
Рисунок 1
Распределение видов в этиологической структуре выделенных изолятов семейства ЕП:егоЬайепасеае представлена в таблице 1, из них наибольшее
количество - 51 изолятов были представлены E.coli, K.pneumoniae - 9 штаммов; Proteus mirabilis - 5 штаммов и Enterobacter spp. - 3.
Таблица 2 - Видовой состав изолятов - представителей семейства Enterobacteriaceae (n=82)
Вид Абс.кол-во Отн. кол-во
Escherichia coli 51 62,20%
Klebsiella pneumonia 9 10,98%
Proteus mirabilis 5 6,10%
Enterobacter cloacae 3 3,66%
Pantoea spp. 3 3,66%
Serratiamarcescens 2 2,44%
Salmonella enterica 2 2,44%
Shigella group 2 2,44%
Raoultellaplanticola 2 2,44%
Providenciastuartii 1 1,22%
Cedecealapagei 1 1,22%
Citrobacterkoseri 1 1,22%
Показатели степени чувствительности выделенных проявили 46 штаммов, что составило 56,1%, из них
штаммов энтеробактерий даны в таблице 2. Из 82 36 - E.coli, 7 - K.pneumoniae, 2 - E.cloacae и 1штамм
изолятов семейства Enterobacteriaceae C.koseri.
резистентность к цефалоспоринам III - IV поколений
Таблица 3 - Чувствительность изученных штаммов энтеробактерий к АМП_
Антибиотики Ч % МИК УР % МИК Р % МИК
мкг/мл мкг/мл мкг/мл
Escherichia coli (n=51)
Ампициллин 7,84 < 2 - - 92,16 >32
Пиперациллин 5,88 <4 - - 94,12 >128
Цефтазидим 31,37 <1 21,57 4 47,06 16-64
Цефтриаксон 27,45 <1 - - 72,55 16-64
Цефепим 45,10 <1 41,18 2-4 13,73 8-16
Эртапенем 98,04 <0,5 - - 1,96 -
Мерапенем 94,12 <0,25 5,71 5,88 - -
Амикацин 82,35 < 2 13,73 16 3,92 >16
Гентамицин 66,67 <1 1,96 4 31,37 >16
Тобрамицин 56,86 1-2 1,96 4 41,18 8-16
Ципрофлоксацин 35,29 <0,25 3,92 1 60,78 2-4
Левофлоксацин 37,25 0,12-1 - - 62,75 >8
Триметоприм/сульфометоксазол 31,37 < 20 - - 68,62 >320
Klebsiella pneumonia (n=9)
Ампициллин - - - - 100 >32
Пиперациллин - - - - 100 >128
Цефтазидим 22,22 <1 11,11 4 66,67 >64
Цефтриаксон 22,22 <1 - - 77,78 >64
Цефепим 22,22 <1 11,11 4 66,67 >64
Эртапенем 55,56 <0,5 22,22 4 22,22 4
Мерапенем 88,89 <0,25 - - 11,11 >16
Амикацин 44,44 2-4 22,22 16 33,33 >16
Гентамицин 22,22 <1 - - 77,78 >16
Тобрамицин 22,22 <1 - - 77,78 >16
Ципрофлоксацин 22,22 <0,25 - - 77,78 >4
Левофлоксацин 22,22 <0,12 - - 77,78 >8
Триметоприм/сульфометоксазол 22,22 < 20 - - 77,78 >320
Enterobacter cloacae (n=3)
Пиперациллин - - - 100 >128
Цефтазидим 33,33 <1 - - 66,67 >64
Цефтриаксон 33,33 <1 - - 66,67 >64
Цефепим 33,33 <1 - - 66,67 32
Эртапенем 33,33 <0,5 - - 66,67 >8
Мерапенем 100 <0,25 - -
Амикацин 33,33 < 2 - - 66,67 >64
Гентамицин 33,33 <1 - - 66,67 >16
Тобрамицин 66,67 <1 - - 33,33 >16
Ципрофлоксацин 33,33 <0,25 - - 66,67 >4
Левофлоксацин 33,33 <0,12 - - 66,67 >8
Триметоприм/сульфометоксазол 66,67 < 20 - - 33,33 >320
Примечание. Ч - чувствительность, Р - резистентность, УР - умеренная резистентность.
Escherichia coli. Среди представителей семейства Enterobacteriaceae (n=82) E.coli выделяли в отделениях хирургических стационаров г.Алматы чаще всего (в 62,2% случаев). Наиболее активными антибактериальными препаратами в отношении исследованных штаммов E.coli были карбапенемы (эртапенем - 98,0% чувствительных штаммов,
мерапенем - 94,29%). Высокая частота устойчивости к цефалоспоринам III - IV поколений (цефтриаксон -72,55% резистентных штаммов; цефтазидим - 47,06% резистентных, 21,57% умеренно резистентных штаммов) была обусловлена продукцией БЛРС, выявленной по тесту синергизма цефтазидима и амоксициллин/клавуланата (рисунок 2).
Среди цефалоспоринов наименьшая частота устойчивости была в отношении цефепима (резистентных штаммов - 11,43%, умеренно резистентных - 40,0%). Из аминогликозидов наиболее активным в отношении E.coli был амикацин (чувствительных штаммов - 82,35%); к гентамицину были чувствительными - 66,67% и к тобрамицину -56,86% штаммов. К фторхинолонам: ципрофлоксацину - отмечалась 60,78% резистентентность, левофлоксацину - 62,75% резистентности. При генотипическойдетекции у всех резистентных к цефалоспоринам III - ^поколений штаммов E.coli в геноме и в плазмиде регистрировались гены TEM1, из них 43,5% -изоляты, несущие только ген TEM1; 43,5% - изоляты, несущие одновременно гены двух групп бета-лактамазTEM1+CTX-M1; 13% - комбинацию генов TEM1+CTX-M1+OXA (рисунок 3). Klebsiella pneumoniae. Выделенные 9 штаммов K.pneumoniae составили 10,98% от всех представителей семейства Enterobacteriaceae (n=82). К цефалоспоринам III - IV поколений проявляли устойчивость 7 штаммов. К эртапенему и меропенему были чувствительны 8 выделенных штаммов. Чувствительность к аминогликозидам: амикацину сохраняли также 4 изолята, гентамицину и тобрамицину - 2 штамма. К фторхинолонам были резистентны 77,78% штаммов. При генотипической детекции у всех 7 резистентных к цефалоспоринам штаммов K.pneumoniae в геноме и плазмиде выявлены гены TEM-1, 4 штамма - комбинацию генов TEM-1+CTX-M-1.
Enterobacter cloacae. Было выделено 3 штамма E.cloacae, что составило 4% от всех энтеробактерий. Из них 2 штамма проявили резистентность на все
группы антибиотиков, кроме меропенема. Оба резистентных штамма при ПЦР-детекции несли гены TEM-1.
Обсуждение результатов и заключение.
Результаты данного исследования свидетельствуют о преобладании в этиологической структуре инфекций (n=214) в многопрофильных стационарах г.Алматы грамотрицательных микроорганизмов - (54,2%). Доля изолятов семейства Enterobacteriaceae среди всех возбудителей хирургических инфекций составила - 38,32%, наиболее частыми видами были Escherichia coli (23,83%) и Klebsiella pneumonia (4,21%).
Зарегистрированная высокая частота резистентности к современным цефалоспоринам у изолятов семейства Enterobacteriaceae (56,1%) и прежде всего, у E.coli (70,59%) и K.pneumoniae (77,78%), обусловленная распространением БЛРС исключает возможность их эмпирического применения для лечения внутрибольничных и внебольничных инфекций, вызванных энтеробактериями и определяет необходимость осуществления регулярного мониторинга чувствительности возбудителей инфекций в стационарах, и при необходимости коррекции стратегии
антибиотикотерапии.
Полученные локальные данные о высокой частоте сочетанной устойчивости выделенных штаммов E.coli, K.pneumoniae к традиционно используемым не-ß-лактамным антибиотикам - аминогликозидам II поколения (гентамицин, тобрамицин) -( 31 - 78%); фторхинолонам (ципрофлоксацин, левофлоксацин) -(60 - 78%), также не позволяет рекомендовать их широкое применение, за исключением случаев подтвержденной чувствительности.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Сухорукова М. В., Эйдельштейн М. В., СклееноваЕ. Ю ., Иванчик Н. В., ТимоховаА. В., Дехнич А. В., Козлов Р. С. и исследовательская группа «Марафон». Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011 - 2012 гг.// Клин микробиолантимикробхимиотер.- 2014.- №16 (4). - C.254-265.
2 Решедько Г. К., Рябкова Е. Л., Кречикова О. И., Сухорукова М. В., Шевченко О. В., Эйдельштейн М. В., Козлов Р. С., Туркутюков В. Б. и др. Резистентность к антибиотикам грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ многопрофильных стационаров России. //Клин микробиолантимикроб химиотер.-2008.-№8(2). - С.96-112.
3 Сидоренко С. В., Березин А. Г., Иванов Д. В. Молекулярные механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий семейства ЕйегоЬа^епасеаек цефалоспориновым антибиотикам // Антибиотики и химиотерапия. -2011. - 49(3). - С. 6-16.
4 Ильина В. Н., Субботовская А. И., Козырева В. С., Сергеевичев Д. С., Шилова А. Н. Характеристика штаммов Enterobacteriaceae, продуцирующих БЛРССТХ-M типа, выделенных в кардиохирургическом стационаре // Клин микробиолантимикроб химиотер. - 2013. - 15(4). - С. 309-314.
5 Мудрак Д. Е. Молекулярно-генетические особенности устойчивости к бета-лактамным антибиотикам грамотрицательных микроорганизмов-возбудителей нозокомиальных инфекций: Автореф. ... канд.биол.наук -М., 2010. - 22 с.
6 Степанова М. Н. Мутационная изменчивость СТХ-М в-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichiacoli: Автореф. ... канд.биол.наук - М., 2011. - 23 с.
7 Poirel L., Gnadkowski M., Nordmann P. Biochemical analyzing extended-spectrum в-lactamase CTX-M-15 and of its structurally related в-lactamase CTX-M-3. // J. Antimicrob Chemother. - 2002. - №50. - Р. 1031-1034.
8 ^que T. M., Novais A., Carattoli A. et al. Dissemination of clonally related Escherichia coli strains expressing extended-spectrum в-lactamase CTX-M-15 // Emerging Infectious Diseases. - 2008. - №14. - Р. 195-200.
9 Hawkey P. M., Jones A. M. The changing epidemiology of resistance // J Antimicrob Chemother. - 2009. - №64. - Р. 3-10.
10 Фурсова, Прямчук С. Д., Абаев И. В., Ковалев Ю. Н., Шишкова Н. А. и др. Генетическое окружение генов blaCTx-M, локализованных на коньюгативных плазмидах нозокомиальных изолятов Enterobacteriaceae, выделенных в России в 2003-2007 гг. // Антибиотики и химиотерапия. - 2010. - №11. - С. 3-10.
11 Эйдельштейн М. В. Выявление бета-лактамаз расширенного спектра у грамотрицательных бактерий с помощью фенотипических методов // Клин микробиол антимикроб химиотер. - 2001. - №3(2). - С. 183-189.
12 Monstein HJ, O" stholm-Balkhed A, Nilsson MV, Nilsson M,Dornbusch K & Nilsson LE (2007) Multiplex PCR amplification assay for the detection of blaSHV, blaTEM and blaCTX-M genes in Enterobacteriaceae // APMIS. -2008. - 115. - Р. 14001408.
А.Л. БИСЕКЕНОВА, Б.А. РАМАЗАНОВА, А.А. МУСАЕВА, Ш.М. НУРМОЛДИН, Ж.С. АЛИБАЕВА, Ш.Е. УГЫШОВА
К6ПСАЛАЛЫ СТАЦИОНАРЛАРДАFЫ ЕМДЕЛУШ1 НАУКАСТАРДАН Б6Л1П АЛЬЮТАН
ENTEROBACTERIACEAE ШТАММДАРЫНЫН, АНТИБИОТИКТЕРГЕ Т6З1МД1Л1П
Тушн: Бершген жумыста Алматы к;. кепсалалы емханалары стационарларында кездесетш хирургиялык инфекциялардын, этиологиялы; курылымы (клиникалы; мацызы бар 214 бактериалды изолят), белшш алынган энтеробактериялардын, турлерге жiктелуi, Enterobacteriaceae 82 изолятынын, антибактериалды препараттарга сезiмталдыFын багалау нэтижелерi усынылган. Жалпы, белiп алынган бактериалды коздыргыштардын, iшiнде 38,32% улесш энтеробактериялар курады, кеп мелшерде Escherichia coli (23,83%) аньщталды жэне Klebsiella pneumonia (4,21%) улесш курады. Эсер ету спектрi кен, в-лактамаз енiмi 56,1% Enterobacteriaceae изолятында аныкталды, сонымен катар 70,59 % E.coli жэне 77,78% K.pneumoniae - да аныкталды. Генотиптiк детекциялау кезiнде III-IV кезенднщ цефолоспорин енiмiне тезiмдi E.coli штамдарынын, геномында жэне плазмидасында TEM гендерi тiркелдi, олардын, iшiнде 43,5% - изоляттар тек TEM гендерш тасымалдаушылар; 43,5% - изоляттар бiр уакытта екi топ, бета - лактамаз TEM1+CTX-M1 гендерiн тасымалдаушылар; 13% - изолятында TEM1+ CTX - M1+ OXA гендершщ комбинациясы аныкталды. Барлык цефалоспоринге тезiмдi K.pneumoniae -нын, 7 штамынын, геномында жэне плазмидасында TEM-1 гендерi аныкталды, 4 штамында - TEM-1+CTX-M-1 гендершщ комбинациясы аныкталды.
ТYЙiндi сездер: Enterobacteriaceae, Escheriсhiacoli, Klebsiella pneumoniae, антибиотикке тезiмдiлiк, эсер ету спектрi кен в-лактамаз ешмь
A.L. BISSEKENOVA, B.A. RAMAZANOVA, A.A. MUSSAYEVA, SH.M. NURMOLDIN, ZH.S. ALIBAEVA, SH.E. UGUSHOVA ANTIBIOTIC RESISTANCE OF STRAINS OF ENTEROBACTERIACEAE ISOLATED FROM PATIENTS
IN MULTIDISCIPLINARY HOSPITALS
Resume: This paper presents etiological structure of surgical infections in the multi-field hospitals of Almaty (214 clinically significant bacterial isolates), the distribution of types of selected enterobacteria, the evaluation results of sensitivity to antibacterial preparations of 82 isolates of Enterobacteriaceae.
Enterobacteria amounted to a total of 38,32% of all the selected bacterial pathogens, the most common species were Escherichia coli (23,83%) and Klebsiella pneumonia (4,21%). Production of в-lactamase extended spectrum (ESBL) was detected in 56.1% of isolates of Enterobacteriaceae, including in 70,59% of E. coli and 77.78% of K. pneumoniae. During genotypic detection of all resistant to cephalosporins III - IV generations of E. coli strains, TEM1 genes were recorded in the genome, of which 43,5% of the isolates carrying only the gene TEM1; 43,5% of the isolates carrying simultaneously the genes of two groups of beta-lactamase TEM1+CTX-M1; 13% a combination of genes TEM1+CTX-M1+OXA. All 7 resistant to cephalosporins strains of K. pneumoniae in genome were identified to have genes TEM-1, 4 strains - a combination of genes TEM-1 +CTX
Keywords: Enterobacteriaceae, Eschea^a coli, Klebsiella pneumoniae, antibiotic resistance, в-lactamase extended-spectrum.
