Генетическое окружение генов bla ctx_ m, локализованных на конъюгативных плазмидах нозокомиальных изолятов Enterobacteriaceae, выделенных в России в 2003-2007 гг Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Генетическое окружение генов Ь/аСТх-м, локализованных на конъюгативных плазмидах нозокомиальных изолятов Еп1егоЪае1епаееае, выделенных в России в 2003—2007 гг.

Н. К. ФУРСОВА1, С. Д. ПРЯМЧУК1, И. В. АБАЕВ1, Ю. Н. КОВАЛЕВ1, Н. А. ШИШКОВА1, Э. И. ПЕЧЕРСКИХ1,

О. В. КОРОБОВА1, Е. И. АСТАШКИН1, Д. М. ПАЧКУНОВ1, Э. А. СВЕТОЧ1, С. В. СИДОРЕНКО2

1 Государственный научный центр Прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, Оболенск;

2 Научно-исследовательский институт детских инфекций ФМБА, Санкт-Петербург

Genetic Environments of b/aCTX-M Genes Located on Conjugative Plasmids of Enterobacteriaceae Nosocomial Isolates Collected in Russia within 2003—2007

N. K. FURSOVA, S. D. PRYAMCHUK, I. V. ABAEV, YU. N. KOVALEV, N. A. SHISHKOVA, E. I. PECHERSKIKH, O.V. KOROBOVA, E. I. ASTASHKIN, D. M. PACHKUNOV, E. A. SVETOCH, S. V. SIDORENKO

State Research Centre for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk;

Research Institute for Children' Infections, St.Petersburg

Показано, что гены й/аСТх_м присутствуют в геномах 71% устойчивых к цефалоспоринам нозокомиальных изолятов семейства Еп1егоЪае1ег1аееае (и=833), выделенных в России в 2003—2007 гг., в том числе в 91% культур Е.ео/1, 90% — К/еЬБМ/а Брр., 38% — ЕМегоЬаеТег Брр., 31% — ай-оЬаеТег Брр. (п=9) и 36% культур других видов энтеробактерий. Идентифицированы гены подтипов (кластеров): Ь/аСТх-м-1 (529 генов Ь/аСТх-м-15; 25 генов й/аСТх-м-3; по одному гену Ь/аСТх-

M-22, Ь/аСТх-м-23 и Ь/аСТх-м-34); Ь/аСТх-м-2 (од™ ген Ь/аСТх-м-2 и четыре геНа ь/аСТх-м-5) и Ь/аСТх-м-9 (два гена Ь/аСТх-м-9 и 28 генов Ь/аСТх-м-14). Гены Ь/аСТх-м локализованы на высокомолекулярных (60—160 т.п.н.) конъюгативных плазмидах, принадлежащих преимущественно к группам несовместимости 1псЕ, 1псЬ/М и 1псА/С (Ь/аСТх-м-15); 1псЬ/М (й/аСТх-м-3); 1псЕ, 1псЬ/Ми 1пс11-/у (Ь/аСТх-м-14). Генетическое окружение специфично для разных генов Ь/аСТх-м: перед генами Ь/аСТх-м-3, Ь/аСТх-м-14 и й/аСТх-м-15 локализована последовательность 18Еср1, демонстрирующая большое разнообразие перестроек (делеции разной протяжённости, а также инсерции последовательностей 1826, 181, 1810, геБТп2 и геБТп3 в разных ориентациях). Характерно расстояние между 18Еср1 и геном й/аСТх_м: 48 п.н. — для гена й/аСТх_м_15 (кроме одного изолята Е.со/1, у которого данная последовательность укорочена на 3 п.н.); 127 п.н. — для гена й/аСТх_м_3; 42 п.н. — для гена й/аСТх_м_14. После гена й/аСТх.м.3 локализована последовательность ог[477-тысА; после гена й/аСТх.м.15 — последовательность Аог/477-АтысА (в двух изолятах имеющая вставку Аог/3); а после гена й/аСТх_м_14 — последовательность 18903 (цельная или укороченная). Гены й/аСТх_м_2 и й/аСТх_м_9 локализованы в структуре 18СЙ1, после интег-рона класса 1 и последовательности ог/513.

Ключевые слова: b/acTx-м, ISEcpl, IS26, IS903, orf5l3, ISCRl.

The study showed that b/aCTX-M genes were present in the genomes of 71% of cephalosporin resistant Enterobacteriaceae nosocomial isolates (n=833) collected in Russian hospitals within 2003—2007, including 91% of E.co/i, 90% of Klebsiella spp., 38% of Enterobacter spp., 31 % of Citrobacter spp. (n=9), and 36% of the other Enterobacteriaceae species. The genes belonging to the following subtypes (clusters) were identified: b/aCTX-M-1 (529 b/aCTX-M-15 genes; 25 b/aCTX-M-3 genes; 1 b/aCTX-M-22 gene, 1

b/aCTX-M-23 gene and 1 b/aCTX-M-34 gene); b/aCTX-M-2 (1 b/aCTX-M-2 gene and 4 b/aCTX-M-5 genes^ and b/aCTX-M-9 (2 b/aCTX-

M-9 genes, and 28 b/aCTX-M-14 genes). It was shown that b/aCTX-M genes were located on high-molecular weight (60—160 bp) conjugative plasmids belonging mainly to the incompatibility groups IncF, IncL/Mand IncA/C (b/aCTX_M_15 gene); IncL/M(b/aCTX-M-3 gene); and IncF, IncL/M and IncI1-/y (CTX_M_14 gene). The gene environments of b/aCTX-M genes were shown specific for the subtype of the genes. A mobile genetic element lSEcp1 (in some cases deleted or inserted by IS26, IS1, IS10, resTn2, or resTn3 sequences, in direct or reverse position) were detected upstream of b/aCTX-M_3, b/aCTX-M_14, and b/aCTX-M_15 genes. A special characteristic was the sequence between ISEcpl and b/aCTX-M gene: 48 bp for b/aCTX-M_15 (except 1 E.co/i isolate having such a sequence deleted by 3 bp); 127 bp for b/aCTX_M_3; 42 bp for b/aCTX_M_14. Downstream of b/aCTX-M and b/aCTX_M_15 genes in the major bacterial isolates orf477 mucA and Aorf477—AmucA sequences were detected respectively. Two isolates had additional Aorf3 insertion inside of Aorf477—AmucA sequence. Insertion sequence IS903 (intact or deleted) was detected downstream of b/aCTX-M-14 gene. Unlike the others, b/aCTX_M_2 and b/aCTX_M_9 genes were located inside of IS CR1 mobile element, downstream of class 1 integron and orf513 sequence.

Key words: b/aCTx-M, ISEcpl, IS26, IS903, orf5l3, ISCRl.

© Коллектив авторов, 2010

Адрес для корреспонденции: 196376 Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17. НИИ гриппа СЗО РАМН

-е-

Большой проблемой здравоохранения во всём мире в последние десятилетия стала устойчивость возбудителей инфекционных заболеваний к лекарственным средствам. К настоящему времени описаны пять молекулярных механизмов этого явления: модификация мишени, на которую действует лекарственное вещество; ферментативная инактивация лекарства; активация обходного ферментативного пути; предотвращение проникновения лекарства к мишени; активация эфф-люксных насосов [1]. Основным механизмом устойчивости к беталактамным антибиотикам является продукция инактивирующих ферментов бета-лактамаз. Гены, кодирующие бета-лактама-зы, описаны у многих возбудителей инфекций, особенно нозокомиальных. В разных регионах мира преимущественное распространение получили разные варианты таких генов. К числу наиболее значимых в эпидемическом плане относятся гены, кодирующие бета-лактамазы расширенного спектра ^.HPC) CTX-M-типа [2]. К настоящему времени известно более 90 аллотипов генов blacxx-M [3], подразделяющихся на основании анализа их нуклеотидных последовательностей на шесть подтипов (кластеров), названных по первому описанному ферменту: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, CTX-M-25 и CTX-M-45. Источник происхождения генов blacxx-M разных кластеров — хромосомы разных видов Kluyvera spp. Мобилизованные подвижными генетическими элементами (транспозонами, IS-элементами, интегронами) и распространившиеся среди грамотрицательных бактерий, гены blacxx-M эволюционировали за счёт накопления точечных мутаций. Pазные аллотипы генов blacxx-M обеспечили бактериям способность гидролизовать беталактамные антибиотики различного спектра действия [4]. Эпидемиология возбудителей инфекций, несущих ферменты CTX-M, достаточно сложна, поскольку является результатом действия нескольких механизмов: особенностями геномов эпидемически значимых клонов бактерий [5], мобильных генетических элементов [6], конъюгативных плазмид [7] и рекомбинации между генами [8].

В Poccийcкoй Федерации ген, кодирующий цефалоспориназу CTX-M-типа (blacxx_M_4), впервые был обнаружен в штамме Salmonella typhimuri-um, выделенном в 1996 г. [9]. В 1997—1998 гг. гены данного типа встречались у нозокомиальных патогенов уже в 75% обследованных российских клиник, при этом они присутствовали в ~35% штаммов E.coli и Klebsiella pneumoniae, продуцирующих Б-^С Большинство генов БлPC (93%) принадлежало к подтипу 1 (blacxx_M_3 и blacxx_M_15), меньшая часть — к подтипу 2 (blacxx_M_5) [10]. Анализ механизмов формирования устойчивости к беталактамам в изолятах энтеробактерий, выделенных в Poccии в 2003—2007 гг., показал, что

85% БЛРС-продуцирующих штаммов имели гены b/aCxX_M, в том числе гены кластеров b/aCTX-M-1 в 92% случаев, b/aCxX-M-9 — в 7%, и b/aCxX-M-2 — в 1% случаев [11].

Целью настоящего исследования являлось изучение генетического окружения генов, кодирующих бета-лактамазы CTX-M типа, и оценка вклада мобильных генетических элементов и конъюгативных плазмид в наблюдающееся широкое распространение данных генов в геномах бактерий семейства Enterobacteriaceae, являющихся возбудителями нозокомиальных инфекций.

Материал и методы

Изоляты бактерий и определение чувствительности к антибиотикам. Независимо полученные нозокомиальные изоляты семейства Enterobacteriaceae (n=833) собраны в 2003—2007 гг. из разнопрофильных стационаров РФ. Видовую идентификацию проводили с помощью систем BBL Crystal™ E/NF (Becton, Dickinson, США) и MicroScan (DadeBehring, США). Бактериальные культуры хранили в 20% глицерине при -70°C. Чувствительность к антибактериальным препаратам определяли в соответствии с указаниями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [12], интерпретировали с учётом рекомендаций European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCASX) [13].

Коньюгативный перенос плазмид из клинических изолятов осуществляли с использованием реципиентного лабораторного штамма E.co/i C600 (RifRAzR). Ночные культуры бактерий выращивали при 26°С на агаризованной среде LB, содержащей 20 мг/л цефотаксима (Sigma, США) для донора и 500 мг/л азида натрия (Difco, США) для реципиента. Готовили клеточные суспензии в физиологическом растворе: 109 КОЕ/мл донора, 1010 КОЕ/мл реципиента. Объединяли клетки донора и реципиента в одной капле на поверхности агара LB в разных пропорциях: 100:10 мкл; 100:100 мкл; 10:100 мкл, инкубировали при 28°С в течение 6 ч; смывали с поверхности агара в 1 мл физиологического раствора; готовили ряды десятикратных разведений и высевали в двух повторностях на LB агар, содержащий 500 мг/л азида натрия и 4 мг/л цефотаксима; инкубировали при температуре 37°С в течение 48 ч. Частоту переноса плазмиды определяли по отношению числа трансконъюгантов к числу донорных клеток. Наличие спонтанных мутаций определяли, высевая неразведённую суспензию донорной культуры на LB агар, содержащий 500 мг/л азида натрия; а неразведённую суспензию реципиентной культуры — на LB агар, содержащий 4 мг/л цефотаксима.

ДНК плазмид выделяли по методу Kado & Liu. [14], разделяли в 1% агарозном геле при напряжении 120 В в течение 4 ч, визуализировали с помощью окрашивания бромистым этиди-ем, документировали на приборе Vilber Lourmat System (Франция). В качестве маркера ДНК использовали плазмиды, выделенные из штамма E.co/i K 12 NCXC 50192: 148 т.п.н.; 64 т.п.н.; 36 т.п.н.; 23 т.п.н.; 7 т.п.н.

Группы несовместимости (Inc) плазмид идентифицировали методом ПЦР-типирования по A. Carattoli и соавт. [15].

Определение генов blaCTX-M и их генетического окружения проводили методом ПЦР, используя опубликованные ранее специфические праймеры для детекции генов b/aCTX-M [10] и мобильных генетических элементов: ISEcpl [16, 17]; IS26; orf513; IS903; orf477 [16], а также гена mucA [16]. Интегроны определяли по наличию генов интеграз и интегронных вставок классов 1 и 2 [18, 19].

Секвенирование последовательностей ДНК ПЦР-продуктов проводили на оборудовании ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США).

Таблица 1. Гены, кодирующие бета-лактамазы CTX-M типа, в геномах нозокомиальных изолятов семейства

Enterobacteriaceae, выделенных в России в 2003—2007 гг.

Гены типа blaCTx-M Количество изолятов

E.coli (n=259) Klebsiella spp. (n=277) Enterobacter spp. (n=174) Citrobacter spp. (n=29) другие (n=94) всего (n=833)

Подтип b/aCTX-M-1

baCXX_M_15 206## 238# 47 9 29 529

b/aCXX_M_3 2 7 16 0 0 25

baCXX_M_22 0 0 1 0 0 1

baCXX_M_23 0 0 0 0 1* 1

baCXX_M_34 0 0 0 0 1** 1

Пддшп CTX_M_2

baCXX_M_2 1 0 0 0 0 1

baCXX_M_5 0 0 1 0 3*** 4

Подтип b/aCTX-M-9

baCXX_M_9 1 0 1 0 0 2

baCXX_M_14 25### 3# 0 0 0 28

Всего b/aCTX-M

b/aCXX_M 235 (91%) 248 (90%) 66 (38%) 9 (31%) 34 (36%) 592 (71%)

Примечание. * - изолят Proteus mirabilis; ** - изолят Providencia stuartii; *** - изоляты Salmonella enterica; # - один изолят содержит одновременно гены blaCTX-M-15 и blaCTX-M-14; ### - три изолята содержат одновременно гены blaCTX-M-15 и blaC

aCTX-M-14-

Гибридизацию ДНК-ДНК осуществляли с помощью высокочувствительного набора AlkPhos Direct Labeling и детектирующей системы CDP-Star в соответствии с рекомендациями производителя (Amersham, США). ДНК-зонды готовили из ПЦР -продуктов генов b/aCTX-M и интеграз 1 класса int/I.

Биоинформатический анализ последовательностей нуклеотидов генов и их рестрикционных карт проводили с помощью программного обеспечения Vector NXI9 (Invitrogen Corporation, США). Последовательности ДНК сравнивали с представленными в базе данных GenBank с помощью программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

Учетные номера последовательностей ДНК, секвенирован-ных в ходе данной работы и размещённых в базе данных GenBank (http:www.ncbi.nlm.nih.gov//), представлены в табл. 2.

Результаты и обсуждение

В ходе исследования показано, что устойчивость к беталактамным антибиотикам у бактерий семейства Enterobacteriaceae (n=833), выделенных в стационарах России в 2003—2007 гг., преимущественно определялась наличием генов, кодирующих БЛРС CTX-M-типа (n=592). С помощью ПЦР -анализа установлено, что доля b/acjx^-позитивных изолятов составляла 91% у E.co/i (n=235), 90% — у K/ebsie//a spp. (n=248), 38%

— у Enterobacter spp. (n=66), 31% — у Citrobacter spp. (n=9) и 36% — у других видов энтеробактерий: Proteus spp. (n=16); Morgane//a morganii (n=8); Serratia spp. (n=3); Sa/mone//a enterica (n=3); Providencia stuartii (n=2); Hafnia a/ve (n=1); и K/uyvera ascorbata (n=1). В изученных клинических изолятах идентифицированы гены, относящиеся к разным подтипам (кластерам) данного типа: b/aCTX-M-1 (529 генов b/aCTX-M-15; 25 генов

b/aCTX-M-3; по одН°мУ гену b/aCTX-M-22, b/aCTX-M-23 и b/aCTX-M-34); b/aCTX-M-2 (одИН ГСН b/aCTX-M-2 и чеТ^1ре

гена b/aCTX-M-5) и b/aCTX-M-9 (два гена b/aCTX-M-9 и 28 генов b/aCTX_M_14) (табл. 1). Таким образом, ген b/aCTX_M_15 являлся наиболее представленным, его

доля составила 89% от всех генов b/aCXX_M; особенно ярко преобладание данного гена проявилось в изолятах E.co/i и K/ebsie//a spp. Доля гена b/aCXX_M_3 составила 4% от всех генов b/aCXX_M, причем данный ген чаще встречался в изолятах Enterobacter spp. Ген b/aCXX_M_14 идентифицирован в 5% изолятов, большинство из которых E.co/i. Показано, что в трёх изолятах E.co/i и в одном изоляте K/ebsie//apneumoniae присутствовали одновременно два относящихся к разным подтипам гена

b/aCTX-M b/acxx_м_l5 и b/aCXX_M_14 Сгабл. 1). Инте-

ресно, что аналогичное соотношение аллотипов b/aCXX_M в нозокомиальных изолятах энтеробактерий в указанный период времени описано в Великобритании [20].

Конъюгативный перенос генов b/aCXX_M из клеток клинических изолятов в лабораторный ре-ципиентный штамм E.co/i C600 (RifRAzR) был успешно осуществлен для 23% E.co/i, 27% K/ebsie//a spp., 12% Enterobacter spp. и 44% Citrobacter spp. с эффективностью 10-6—10-7. Интересно отметить, что экспрессия передаваемых конъюгацией генов b/aCXX_M оцениваемая по МПК цефотаксима, цеф-тазидима и цефепима, в донорных клетках и в трансконъюгантах различалась. Это выражалось в увеличении МПК цефотаксима с 64—128 г/л до >512 г/л (9% трансконъюгантов); уменьшении МПК цефотаксима с 256 г/л до 64 г/л (5% трансконъюгантов); уменьшении МПК цефтазидима от 4—256 г/л до 1—64 г/л (77% трансконъюгантов); увеличении МПК цефепима от 16—32 г/л до 64—128 г/л (27% трансконъюгантов); уменьшении МПК цефепима от 128—256 г/л до 2—64 г/л (32% трансконъюгантов).

Сравнение плазмидных профилей доноров и трансконъюгантов показало, что клинические изоляты содержали от одной до двенадцати плаз-

-о-

Ген Й/«СТХ-М Вид микро- Генетическое окружение гена й/ястх-м Inc группы конъюгативных Размер Номер в GenBank

организма перед геном после гена плазмид (количество изолятов) плазмид (т.п.н.)

ШстХ-М-15 E.coii ISEcpl, 48п.н. Aorf477, AmucA F (« =4); А/С (« =4); F+FIB+A/C (н=1); F+FIA+FIB («=1); F+H12 (« = 1); N («=1); ND* (« = 2) 100-160 GQ339103; GQ339105; GQ330538; GQ330539

ISEcpl, 48п.н. ** F+H12 («=2); ND* (н=1) 100-150

IS26R, ISEcpl, 48п.н. Aorf477, AmucA F(«=l); F+L/M («=1); F+A/C («=1) 80-140 GQ339104; GQ344801; GQ330540

IS26R, AlSEcpl, 48п.н. Aorf477, AmucA F+FIA+N (п =3) >150 GQ344800; GQ385307; GQ385308

IS26R, ATn3R, AISEcpl, 48п.н. Aorf477, AmucA F+FIA(«=1) 150 GQ385305; GQ385306

IS26, ISEcpl, 48п.н. Aorf477, AmucA F+L/M («=1) 80-100 GQ385309

AIS10, ISEcpl, 48п.н. ** ND* («=1) 100-150 GQ284323

ISEcpl, 48п.н. Aorf477, Aorf3, AmucA N («=1) 130

IS Ecpl, 45п.н. Aorf477, Aorf3, AmucA А/С (н=1) 130 GQ339106

Klebsiella spp. IS Ecpl, 48п.н. Aorf477, AmucA А/С («= 9); F+L/M+11-ly («=1); L/M (н=3); ND* («= 3) 60-150

AIS Ecpl, 48п.н. Aorf477, AmucA F(/»=l) 130

Enterobader spp. IS Ecpl, 48п.н. Aorf477, AmucA FIB+L/M («=2); L/M («=2); FIB+A/C («= 1) 120-150 НМ219230

bl°tem> IS Ecpl, 48п.н. ** FIB+L/M (w=l);F(w=l) 120-150

Шстх-М-З E.coii IS26, ISEcpl, 127п.н. orf477, mucA L/M+A/C (h=1) 100 GQ339101

IS26R, ISEcpl, 127п.н. orf477, mucA L/M («= 1) 120 GQ339102

Klebsiella spp. ISEcpl, 127 п.н. orl'477, mucA L/M (n =3) 130 GQ325708; GQ325711; GQ325709

IS26R, AlSEcpl, 127п.н. orf477, mucA L/M (»=1) 120 GQ292713

AIS1R, ISEcpl, 127п.н. orf477, mucA L/M («= 1) 130 GQ292712

IS26R, resTn2, ISEcpl, 127п.н. Aorf477, AmucA L/M (»=1) 130 GQ304737

IS26R, AlSEcpl, 127п.н. Aorf477, AmucA L/M (h=1) 130 GQ325710

Enterobader spp. ISEcpl, 127 п.н. oorf477, mucA FIB+L/M (n =3); L/M (h=1); FIB+A/C (»=1); ND* («=10) 80-100

bl°tem> IS Ecpl, 127 п.н. orf477, mucA FIB+A/C («=2); FIB+L/M («=1); FIA+F («=2); A/C («=1); FIB+N («=1);ND* (h=1) 80

AIS Ecpl, 127 п.н. orf477, mucA ND* («=1) 100

Citrobader spp. ISEcpl, 127 п.н. orf477, mucA 120

bl°tem> IS Ecpl, 127 п.н. orf477, mucA ** 100

ШстХ-М-22 Enterobader spp. bl°tem> IS Ecpl, 127 п.н. Aorf477, tnpATn2 ** 80 НМ470254

Шстх-М-23 Proteus spp. ISEcpl, 127 п.н. ** ** >150

Шстх-М-34 Pivvidenda stcoartii ISEcpl, 127п.н. ** ** 120

ШстХ-М-2 E.coii intll, dfrA17, aadA5, qacE Al, sull, otf513, 266п.н. ** Il-ly+P (//=1) 90 GU187357

ШстХ-М-5 Enterobader spp. AIS Ecpl, 19п.н ** A/C («=1) 130 GQ385330

Salmonella enterica ISEcpl, 19п.н ** T (» =3) 150 GQ385327; GQ385328; GQ385329

<N

3

I

в

ф

=1

!

&

<1!

J

ea

e.

0

1 к

о s я РчЙ^

& 3

R « & s

=5 °

СЛ ^

“ rv

о ^

СЛ СЛ

00 00 СЛ СЛ

О

О

a

О

Н^^НТГООСШЛ

слслслслттслт

00 00 00 00XX00X

aaaa^^a^

oooooooo

aa a oo о

I

о

-4^4 c

£ -5 =?

I

о

-S к О

+ T1

О

о

S 11

S3<9

£ ^ ^ Рч « « 3

hh_L + _L_L + + w РчмРчммРч^Рч %

I I

3

c*

00 00 OO

S

S

S

fv >

CN

* ^ ^ 5? ^ ° *? oo

0 S

a

-S

|3

Г*4

£bq

I^S

a

a

^ *N r4 bq^1^

ю E2

1-4^ ^

'"^ ^ Qq~ И И Чо

<1 <1 й

ЖЖ о

с с ц

CN1 CN1 Й > > ^ c^s^ftq ' г^ г^ Чо bqbqc^ isiifiifi

,<

Ss

g

-S

-&

CP

3

л

cp

X

о

CD

u

о

IZ

о

cr

ср

CD

О

Q

_Q

E?

о

о

IZ

o 5

F= ^

и CD CD С

m ^

Q ГТ

^ О CP л

Ф

=1

3

<b

H

мид различной молекулярной массы (наибольшее количество плазмид отмечено в некоторых изолятах К.рпвитотав), а в клетках трансконъю-гантов в подавляющем большинстве случаев определялась только одна, высокомолекулярная плазмида размером 60—160 т.п.н. (табл. 2, рис. 1, а, рис. 2, а). С помощью Саузерн-гибридизации со специфичным ДНК-зондом показано, что именно на высокомолекулярных плазмидах локализованы гены Ь/асхх_м (рис. 1, б). В значительном количестве клинических изолятов на одних и тех же высокомолекулярных плазмидах локализованы одновременно гены Ь/асхх_м и интегроны класса 1 (74%) и класса 2 (15%), что показано с

Рис. 1,а — электрофореграмма плазмид в 0,7% агарозном геле: 1, 16 - маркёр ДНКA/HindIII; 2, 15 - E.coliC600 (RifRAzR); 3 - изолят E.coliS-549 (CTX-M-14); 4 - транс-конъюгант E.coii C600 (S-549); 5 - изолят E.coii S-907 (CTX-M-14); 6 - трансконъюгант E.coii C600 (S-907); 7 -изолят E.coii S-716 (CTX-M-14); 8 - трансконъюгант EcoliC600 (S-716); 9 - изолят E.coliK-26 (CTX-M-14); 10 -трансконъюгант E.coli C600 (К-26); 11 - изолят K.pneu-moniae D-01 (CTX-M-14); 12 - трансконъюгант E.coli C600 (D-01); 13 - изолят Kpneumoniae D-02 (CTX-M-14; 14 - трансконъюгант E.coli C600 (D-02). б — ДНК-ДНК Саузерн-гибридизация с зондом ПЦР-продуктом гена blaCTX_M_14.

в — ДНК-ДНК Саузерн-гибридизация с зондом ПЦР-продуктом гена intI1.

О

Рис. 2.a— плазмидные профили типов A, B, C, D штам-мов-трансконъюгантов E.coli, несущих высокомолекулярные плазмиды клинических изолятов; L — маркёр ДНК NCTC50192;

б — продукты рестрикции плазмид эндонуклеазой Eco RI; L - маркёр ДНК A/Hind III;

в— продукты рестрикции плазмид эндонуклеазой Bam HI; L - маркёр ДНК A/Hind III. A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, B1, B2, C1, D1, D2 - подгруппы плазмид на основании рестрикционного анализа.

помощью ДНК-ДНК гибридизации по Саузерну со специфичным зондом (рис. 1, в). С помощью секвенирования установлено, что интегроны классов 1 и 2 несут в составе своих вариабельных регионов детерминанты ассоциативной устойчивости к лекарственным средствам других классов (аминогликозидам, сульфаниламидам, хлорам-фениколу, эритромицину). Интересно отметить, что значительная часть выявленных интегронов (62% класса 1 и 39% класса 2) имели «пустые» ин-

тегронные вставки, не содержащие генных кассет, особенно высока доля таких кассет в клетках Enterobacter spp. (табл. 2, 3). Наличие «пустых» кассет может рассматриваться как резерв для накопления детерминант резистентности в будущем.

На описанных конъюгативных плазмидах локализованы также гены, кодирующие бета-лакта-мазы ТЕМ-типа (13% изолятов), что показано с помощью конъюгации и трансформации. Таким образом, полученные нами данные подтверждают отмеченную ранее другими авторами [7] важную роль конъюгативных плазмид в распространении генов лекарственной устойчивости. Конъюгативные плазмиды, присутствующие в клинических изолятах E.coli, преимущественно принадлежали к группам несовместимости IncF, IncA/C и IncI1-ly; в то время как в клинических изолятах Klebsiella spp. — к группам несовместимости IncA/C и IncL/M, а в клинических изолятах Enterobacter spp. — к группам несовместимости IncFIB, IncFIA, IncA/C и IncL/M. Многие конъюгативные плазмиды (38%) имели гибридную природу, т.е. показывали принадлежность к двум-че-тырём разным группам несовместимости. Кроме того, 23 конъюгативные плазмиды (20%) не удалось типировать с помощью использованного набора праймеров (табл. 2). На основании различий в молекулярных массах плазмиды были подразделены на несколько групп (A, B, C, D, E, F, G), а с помощью последующего рестрикционного анализа эндонуклеазами BamHI и EcoRI — на подгруппы (A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7; В1, В2; C1, C2; D1, D2) (рис. 2). Результаты рестрикционного ти-пирования коррелировали с результатами типи-рования по группам несовместимости. Так, в группу А вошли плазмиды, относящиеся к группе несовместимости IncF, а также гибридные плазмиды Inc(F+FIB+A/C), Inc(F+FIB+FIA), Inc(F+L/M) и др. (табл. 2). Выявленное разнообразие плазмид указывает на высокий уровень рекомбинационных процессов в популяциях российских нозокомиальных штаммов [21]. Показано, что группы несовместимости плазмид достаточно специфичны для разных аллотипов гена blaCTX-M: ген blaCTX-M-15 чаще ассоциирован с плазмидами групп несовместимости IncF, IncL/M и IncA/C; ген blaCTX-M-3 — с плазмидами IncL/M; а

Таблица 3. Детекция интеграз классов 1 (int I) и 2 (int II) и интегронных вставок, несущих генные кассеты (ins I и ins II) в клинических изолятах энтеробактерий, выделенных в 2003—2007 гг.

Виз микроорганизма Всего штаммов, абс. Количество штаммов, несущих интегронные структуры, абс. (%)

Int 1 Ins 1 Int 2 Ins 2

E.coli 162 109 (67) 63 (39) 15 (9) 15 (9)

Klebsiella spp. 106 67 (63) 31 (29) 17 (16) 15 (14)

Enterobacter spp. 113 112(99) 17 (15) 18 (16) 3 (3)

Другие Enterobacteriaceae 29 16 (55) 5 (17) 12 (41) 5 (17)

Всего 410 304 (74) 116(28) 62 (15) 38 (9)

Примечание. Int 1 - ген интегразы класса 1; Ins 1-интегронная вставка класса 2.

интегронная вставка класса 1; Int 2— ген интегразы класса 2; Ins 2-

ген b/aCTX_M_14 — с плазмидами 1псЕ, 1псЬ/М и 1пс11-/у (табл. 2).

Специфичным для генов Ь/асхх-м является также и их непосредственное генетическое окружение — набор мобильных генетических элементов, обеспечивающих распространение данных генов. Во всех клинических изолятах, кроме двух (несущих гены Ь/асхх_м_2 и Ь/асхх-м_9) выше гена Ь/асхх-м локализован мобильный генетический элемент ШЕср1. Характерно расстояние между данным элементом и геном, кодирующим бета-лактамазу: для гена Ь/асхх_м_15 оно составляет 48 п.н. (кроме одного изолята Е.соН, у которого данная последовательность делетиро-вана и составляет 45 п.н.); для гена Ь/асхх_м_3 это расстояние равно 127 п.н.; а для гена Ь/асхх-м_14

— 42 п.н., что согласуется с литературными данными [16]. В некоторых изолятах структура элемента ШЕср1 не изменена, но во многих случаях последовательность ШЕср1 имеет делеции различной протяженности, а также инсерции других мобильных элементов в разных ориентациях: 1326, Ш1,1Б10, гвзТп и гвзТпЗ (табл. 2). Ниже генов, кодирующих ферменты подтипа схх-м-1, в подавляющем числе изолятов локализована структура ог[477-тысЛ, причем в соседстве с геном Ь/асхх_м_3 их структура в большинстве изолятов не нарушена, а в ассоциации с геном Ь/асхх_м_15 чаще присутствуют укороченные варианты Аог/477-АтисА. В двух изолятах Е.соН после гена Ь/асхх_м_15 идентифицирована последовательность, имеющая дополнительную вставку: Аог[477-Аог/3-АтисЛ. Ниже генов, кодирующих ферменты подтипа СТх-м-9, локализована последовательность элемента 1Б903, чаще в полноразмерном виде, но в некоторых изолятах — укороченная (табл. 2). Уникальность генетического окружения генов Ь/асхх_м_2 и Ь/асхх_м_9, идентифицированных в двух изолятах Е.соН, состоит в том, что они встроены в структуру 18 СЯ1 элемента, по соседству с инте-гроном класса 1 и последовательностью ог[513. Именно такие структуры описаны ранее как характерные для данных генов [16].

Известно, что анализ генетического окружения генов устойчивости позволяет выявить не только мобильные генетические элементы, осуществившие захват и перенос этих генов в клинические штаммы, но также фрагменты генетического материала бактерий-доноров. Сравнение генетического окружения генов устойчивости в клинических изолятах, выделенных в различных географических регионах и в разные периоды времени позволяет дифференцировать описанные ранее и новые случаи мобилизации данных генов из природных микроорганизмов [22]. Выявленные нами генетические конструкции не противоречат схемам, описывающим захват хро-

мосомных генов бактерий рода Х/иуувт двумя основными способами: специфической транспозицией посредством мобильного элемента ШЕср1 ^^СТх-м^ Ь/асхх-м-15 и Ь/асхх-м-14) ИЛИ ГОМЮЛОТИЧ-ной транспозицией в составе 18 СЯ1 элемента посредством транспозазы ОгГ513 (Ь/асхх-м_2; Ь/асхх-м_9). Новых независимых актов мобилизации генов Ь/асхх-м на конъюгативные плазмиды не выявлено, но отмечен факт множественных рекомбинационных процессов в последовательностях нуклеотидов, прилегающих к изучаемым генам, что привело к образованию разнообразных генетических конструкций, в том числе не описанных ранее (табл. 2).

Таким образом, полученные нами данные показывают наличие большого генетического разнообразия в участках геномов бактерий семейства Еп1егоЪас1епасеае, прилегающих к генам Ь/асхх-м, определяющим высокие уровни устойчивости к цефалоспоринам ГГГ—ГУ поколений. Данное разнообразие является отражением эволюционных процессов, проходящих на фоне селективного давления широко применяемых лекарственных средств для лечения инфекционных осложнений в стационарах Российской Федерации.

Заключение

В данной работе охарактеризовано генетическое окружение генов Ь/асхх-м, идентифицированных в 592 нозокомиальных изолятах бактерий семейства Еп1егоЪас1епасеае, выделенных в российских клиниках в 2003—2007 гг. Показано, что быстрое распространение изучаемых генов среди бактерий, циркулирующих в стационарах, обеспечивается мобильными генетическими элементами, окружающими гены устойчивости, а также локализацией этих генетических структур на высокомолекулярных конъюгативных плазмидах, относящихся к специфичным для индивидуальных генов группам несовместимости: 1псЕ, 1псЬ/М и 1псЛ/С (Ь/асхх-м-15); 1псЬ/М (Ь/асхх-м-3); 1псЕ, 1псЬ/Ми 1пс11-/у (Ь/асхх_м_15).

Генетическое окружение большинства идентифицированных генов (Ь/асхх-м_3, Ь/асхх_м_14 и Ь/асхх-м_15) включает в себя наличие перед генами последовательности ШЕср1, демонстрирующей большое разнообразие перестроек в разных изолятах, на расстоянии, характерном для индивидуальных генов: 48 п.н. или 45 п.н. (Ь/асхх. -м-15); 127 п.н. (Ь/асхх-м_3); 42 п.н. (Ь/асхх-м_14). Ниже генов Ь/асхх-м-3 и Ь/асхх-м-15 локализованы последовательности ог[477-тысЛ и Аог[477-АтисЛ соответственно, а ниже гена Ь/асхх-м_14 — последовательность 1Б903, в них также выявлены перестройки. Генетическое окружение встречающихся реже генов Ь/асхх-м_2 и Ь/асхх-м_9, идентифицированных в трёх клинических изолятах, принципиально от-

-е-

личается от описанного выше, т. к. названные гены локализованы в структуре IS CR1 элемента, после интегрона класса 1 и последовательности orf513. Выявленное разнообразие генетического окружения генов, кодирующих БЛРС CTX-M-типа в российских клинических изолятах, не противоречит схемам, описанным ранее другими исследователями, но увеличивает количество описанных вариантов, возникающих в результате продолжающейся эволюции данных участков генома за счёт рекомбинации и горизонтального переноса в популяциях бактерий.

Благозарности. Исследование проводилось при поддержке фонда программы развития биотехнологий США, в рамках международного

ЛИТЕРАТУРА

1. Nicaido H. Multidrug resistance in bacteria. Annu Rev Biochem 2009; 78: 119—146.

2. Canton R., Coque T.M. The CTX-M /З-lactamase pandemic. Curr Opinion Microbiol 2006; 9: 466—475.

3. http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1

4. Rossolini G. M., D'Andrea M. M., Mugnaioli C. The spread of CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases. Clin Microbiol Infect 2008; 14: 1: 33—41.

5. Coque T. M., Novais A., Carattoli A. et al. Dissemination of clonally related Escherichia coli strains expressing extended-spectrum /3-lacta-mase CTX-M-15. Emerging Infectious Diseases 2008; 14: 2: 195—200.

6. Rodrfguez-Bano J., Pascual A. Clinical significance of extended -spectrum beta-lactamases. Expert Rev Antiinfect Ther 2008; 6: 5: 671—683.

7. Hawkey P.M., Jones A.M. The changing epidemiology of resistance. J Antimicrob Chemother 2009; 64: 1: i3—10.

8. Barlow M., Fatollahi J., Salverda M. Evidence for recombination among the alleles encoding TEM and SHV /3-lactamases. J Antimicrob Chemother 2009; 63: 256—259.

9. Gazoli M., Tzelepi E., Sidorenko S. V., Tzouvelekis L. S. Sequence of the gene encoding a plasmid-mediated cefotaxime-hydrolyzing class A /З-lactamase (CTX-M-4): involvement of serine 237 in cephalosporin hydrolysis. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 5: 1259-1262.

10. Edelstein M., Pimkin M., Palagin I. et al. Prevalence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 12: 3724—3732.

11. Fursova N., Abaev I., Pryamchuk S. et al. Variability of Inc group of oon-jugative plasmids and CTX-M gene environments in Enterobacteriaceae nosocomial strains isolated from Russia. Clin Microbiol Infect 2008; 15: 4: 38—39.

партнёрского проекта ISTC#2913/BTEP#62P. Секвенирование ДНК проводили в Межинсти-тутском центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome-cen-tre.narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ (грант №00-04-55000). Выражаем свою благодарность нашим коллегам: к. б. н. Круглову А. Н. (Национальное агенство клинической фармакологии и фармации, г. Москва), д-ру Линде М. Вейгел и д-ру Дж. Камилу Рашиду (Центры контроля и предупреждения заболеваемости CDC, Атланта, Джорджия, США) за участие в обсуждении результатов нашей работы и за любезно предоставленный плазмидный маркер ДНК NCTC50192.

12. NCCLS/CLSI. 2006. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. Document M7-A5. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA.

13. http: / /www .eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EU C AST_files / Disk_test_documents/ EUCAST_breakpoints_v1.0_20091221.pdf

14. Kado C. I., Liu S. T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol 1981; 145: 1365—1373.

15. Carattoli A., Bertini A., Villa L. et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. J Microbiol Meth 2005; 63: 219—228.

16. Eckert C., Gautier V., Arlet G. DNA sequence analysis of the genetic environment of various blaCTX-M genes. J Antimicrob Chemother 2006; 57: 14—23.

17. Saladin M., Cao V. T., Lambert T. et al. Diversity of CTX-M beta-lac-tamases and their promoter regions from Enterobacteriaceae isolated in three Parisian hospitals. FEMS Microbiol Lett 2002; 209: 2: 161—168.

18. Machado E., Canton R., Baquero F. et al. Integron content of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli strains over 12 years in a single hospital in Madrid, Spain. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 5: 1823—1829.

19. Skurnik D., Le Menac'h A., Zurakowski D. et al. Integron-associated antibiotic resistance and phylogenetic grouping of Escherichia coli isolates from healthy subjects free of recent antibiotic exposure. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 7: 3062—3065.

20. Livermore D. M., Canton R., Gniadkowski M. et al. CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe. J Antimicrob Chemother 2007; 59: 2: 165—174.

21. Coque T. M., Baquero F., Canton R. Increasing prevalence of ESBL-producing Enterobacteriaceae in Europe. Eurosurveillance 2008; 13: 47: 1—11.

22. Poirel L., Naas T., Nordmann P. Genetic support of extended-spectrum /3-lactamases. Clin Microbiol Infect. 2008; 14: Suppl. 1: 75—81.