CC BY
50
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 582.282.123.4:577.152.34
ФИБРИНОЛИТИЧЕСКАЯ И КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ ШТАММОВ МИКРОМИЦЕТОВ ASPERGILLUSOCHRACEUSL-1 И ASPERGILLUS USTUS 1
А.А. Осмоловский1*, Е.А. Попова1, В.Г. Крейер1, Н.А. Баранова1, Н.С. Егоров2
1 Кафедра микробиологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова;
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
2 Международный учебно-научный биотехнологический центр, Московский государственный университет
имени М.В. Ломоносова;
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 * e-mail: [email protected]
Показано, что штаммы микромицетов A. ochraceus L-1 и A. ustus 1 различаются по проявлению активности внеклеточных протеиназ при разных значениях рН, а также по выраженности своего действия на фибриллярные белки. Выявлено, что протеиназы A. ochraceus L-1 проявляют максимальную активность при росте продуцента на среде без нитратов (рН ферментативной реакции 8,0), а протеиназы A. ustus 1 проявляют максимальную активность при росте микромицета на среде, содержащей нитрат натрия (рН ферментативной реакции 6,0). Значения удельных фибринолитической и коллагенолити-ческой активностей A. ochraceus L-1 в 2,2 и 1,6 раз больше, чем у A. ustus 1, соответственно, однако A. ustus 1 практически не проявляет общей протеолитической (казеинолитической) активности и обладает высоким соотношением фибринолитической активности и общей протеолитической (казеинолитической) активности (6,92), что делает его перспективным продуцентом протеиназ, расщепляющих фибрин и коллаген.
Ключевые слова: фибринолитические ферменты, коллагенолитические ферменты, протеиназы микромицетов.
Фибриллярные белки, в частности фибрин и коллаген, являются одними из трудногидролизуе-мых субстратов. Для их расщепления необходимы протеолитические ферменты со специфической активностью, применение которых особенно востребовано в медицине. Такие протеиназы используются в составе препаратов для удаления некротизи-рованных тканей, гнойных выделений и кровяных сгустков в открытых ранах [1]. Препараты протеи-наз с направленной фибринолитической активностью также весьма перспективны для использования в медицине в качестве тромболитических препаратов [2]. Наиболее эффективными протеиназами для этих целей являются ферменты, образуемые микроорганизмами, в том числе и микромицетами [3, 4].
Мицелиальные грибы, в отличие от бактерий, могут секретировать в окружающую среду до 5—12 протеиназ, активных при разных значениях физико-химических параметров и обладающих разной субстратной специфичностью [4, 5], поэтому микромицеты способны использовать для питания широкий спектр разнообразных белковых субстратов, встречающихся в почве [5]. Среди представителей разных групп мицелиальных грибов наибольший интерес представляют микромицеты рода
Aspergillus, которые способны образовывать несколько типов протеиназ направленного действия [1, 6]. В последнее время была показана способность протеиназ аспергиллов осуществлять специфичные реакции ограниченного протеолиза [7, 8].
Среди аспергиллов известны продуценты как коллагеназ, так и фибринолитических протеиназ [9—11]. Однако выделенные при их культивировании протеиназы были высоко активны в отношении глобулярных белков, что накладывает ограничения на возможность их медицинского применения, связанные с токсичностью и проявляемыми аллергическими реакциями. Поэтому необходим поиск новых продуцентов протеиназ с выраженной активностью к фибриллярным белкам. Важным для оценки эффективности таких протеиназ является соотношение фибринолитической и неспецифической общей протеолитической (казеинолитической) активности (ФА/ОПА) [12].
Штаммы микромицетов Aspergillus ochraceus и Aspergillus ustus, использованные в данной работе, были отобраны в результате предыдущих исследований как перспективные продуценты протеиназ с фибринолитической и коллагенолитической активностью [13, 14].
Целью работы было изучение действия протеи-наз А. оскгасвт Ь-1 и А. шШ 1 на фибриллярные белки (фибрин и азоколлаген) при разных значениях рН.
Материалы и методы
Объекты исследования и условия культивирования.
Использовали штаммы А. оскгасвт Ь-1 и А. шШ 1 из коллекции кафедры микробиологии МГУ. Мик-ромицеты культивировали в глубинных условиях на орбитальной качалке (200 об/мин) в качалочных колбах объемом 750 мл со 100 мл питательной среды при 28°С в течение 2 сут на среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон [15], после чего часть полученного посевного материала переносили в среды состава (в %): глюкоза — 3,5, крахмал — 0,1, гидролизат рыбной муки — 0,5, пептон — 0,5, ШС1 — 0,2, КН2Р04 — 0,05, MgSO4 — 0,05 (среда № 1); глюкоза — 3,0, глицерин — 7,0, гидролизат рыбной муки — 0,5, №М03 — 0,2, КН2Р04 — 0,05, MgSO4 — 0,05 (среда № 2) с последующим культивированием в течение 5 сут. Засев осуществляли смывом спор микромицетов, выращенных в пробирках на скошенном сусло-агаре в течение 7 сут.
Определение протеолитической активности. Активность протеиназ А. оскгасвт Ь-1 и А. шШ 1 определяли в культуральной жидкости после предварительного отделения биомассы фильтрованием при разных значениях рН с субстратами — казеином, фибрином и азоколлагеном, приготовленными на 0,1 М натрий-ацетатном буфере (рН 5,0 и 6,0) или же на 0,1 М Трис-НС1 буфере (рН 7,0 и 8,0).
Общую протеолитическую (казеинолитическую) активность культур определяли с помощью модифицированного метода Ансона — Хагихары [16, 17]. К 200 мкл пробы добавляли 400 мкл 1%-ного раствора казеина по Гаммерстену в соответствующем буфере, после чего проводили инкубацию при 37°С в течение 10 мин. Останавливали реакцию добавлением 600 мкл 10%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Далее образцы центрифугировали при 12 000 g и определяли поглощение при 275 нм в супернатанте. Активность выражали в мкМ тирозина, образовавшегося в течение 1 мин в 1 мл культуральной жидкости (ЕТир). Для расчета общей протеолитической активности строили калибровочную кривую по тирозину.
Фибринолитическую (плазминоподобную) активность определяли с помощью суспензии бычьего фибрина [18]. К 200 мкл пробы добавляли 400 мкл 1%-ной суспензии фибрина, приготовленного на соответствующем буфере, и после инкубации в течение 60 мин при 37°С реакцию останавливали добавлением 600 мкл 10%-ной ТХУ. Далее в су-пернатанте, полученном описанным выше способом, проводили измерение поглощения при 275 нм. Активность выражали в ЕТир.
Определение коллагенолитической активности проводили с использованием азоколла ("Са1Ыо-1ееИ", США) по общепринятой методике [14]. Ак-
тивность выражали в мкг расщепившегося азоколла за 1 мин (ЕАзк) в 1 мл культуральной жидкости.
Реакции проводили при постоянном перемешивании в термошейкере TS-100 ("BioSan", Латвия). Измерение оптической плотности растворов проводили на спектрофотометре Hitachi 200-20 (Япония).
Определение белка в культуральной жидкости.
Концентрацию белка определяли после предварительного осаждения в культуральной жидкости дез-оксихолатом натрия и ТХУ [19]. К 1 мл культуральной жидкости добавляли 100 мкл 0,15%-ного дезоксихолата натрия и выдерживали при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего добавляли 50 мкл 100% ТХУ. Далее образцы центрифугировали при 12 000 g, супернатант сливали, а осадок промывали 1 мл холодного этанола, высушивали в токе воздуха и растворяли в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,0-8,2. В полученных растворах проводили спектрофотометрическое определение концентрации белка при 280 нм в кювете с длиной пути в 1 см [20].
Результаты и обсуждение
Активность протеиназ штаммов A ochraceus L-1 и A. ustus 1 была изучена при значениях рН ферментативной реакции от 5,0 до 8,0 с интервалом через единицу. В этом диапазоне рН работают се-риновые протеиназы, которые характерны для аспергиллов — изолятов почв и растительных остатков [4]. Поскольку мицелиальные грибы обладают смешанным типом питания по источникам азота, образование протеиназ определяли на двух средах — с источниками аминного азота (среда № 1) или аминного и минерального азота (среда № 2).
В табл. 1 приведены данные общей протеоли-тической, фибринолитической и коллагенолити-ческой активности A. ochraceus L-1 и A. ustus 1. Как видно из таблицы, значения рН, при которых ми-кромицеты проявляют максимальную активность, неодинаковы. Так, для протеиназ A. ochraceus L-1 максимальные значения общей протеолитической и фибринолитической активности были показаны при рН реакции 8,0, а колагенолитической — при рН 7,0. Максимальные значения всех трех изученных активностей у протеиназ A. ustus 1 приходились на рН 6,0, однако этот штамм был высоко активен и при рН 8,0 в случае с фибринолитической и коллагенолитической активностью, что может указывать на присутствие в протеолитическом комплексе этого микромицета нескольких ферментов. Протеолитические ферменты обеих культур проявляли слабую активность или были неактивны при рН 5,0.
Следует отметить, что протеолитическая активность A. ochraceus L-1 была выше на среде № 1, а A. ustus 1 — на среде № 2, это может указывать на то, что разные источники азота в составе среды по-разному влияют на регуляцию секреции проте-иназ этих микромицетов. Для A. ochraceus ранее
Таблица 1
Протеолитическая активность микромицетов A. ochraceus и A. ustus при разных значениях рН
Активность рН реакции A. ochraceus A. ustus
Среда № 1 Среда № 2 Среда № 1 Среда № 2
Общая протеолитическая, ЕТир/мл 5,0 0,0 0,0 1,1 0,0
6,0 64,5 0,1 5,3 3,4
7,0 83,1 1,3 32,1 1,5
8,0 94,9 2,8 25,1 0,0
Фибринолитическая, Е^/мл 5,0 0,0 0,0 0,0 0,0
6,0 10,0 0,2 8,1 22,7
7,0 14,4 5,0 17,3 18,5
8,0 17,6 8,5 5,2 22,1
Коллагенолитическая, ЕАзк/мл X I0-3 5,0 3,5 0,0 0,0 19,5
6,0 21,5 14,2 24,3 107,2
7,0 59,7 30,3 33,2 87,3
8,0 56,4 11,2 37,1 101,4
было показано, что добавление к среде с нитратом натрия белковых субстратов увеличивало протео-литическую активность культуры [21]. В случае с A. ustus 1 добавление нитрата натрия к среде индуцировало образование протеиназ. Общая протеолитическая активность A. ochraceus L-1 на среде № 1 была в 7,9 раз больше, чем на среде № 2, а фибри-нолитическая и коллагенолитическая — почти в 2 раза. Фибринолитическая и коллагенолитическая активности микромицета A. ustus 1, выращенного на среде № 2, были в 1,3 и 2,9 раз больше, соответственно, чем на среде № 1. Эти активности были на 22,5% и 44,3% больше, чем у A. ochraceus L-1.
Общая протеолитическая активность A. ustus 1 была выше на среде № 1 (32,1 ЕТир/мл), а на среде № 2 она была незначительна (3,4 ЕТир/мл). Высокие значения фибринолитической и коллагеноли-тической активности и минимальное проявление общей протеолитической активности на одной среде (среда № 2) могут свидетельствовать о содержании в протеолитическом комплексе A. ustus 1 протеиназ с разной специфичностью, в том числе высокоактивных к фибриллярным белкам, а также о возможности регулировать их секрецию.
Определение содержания белка в культураль-ной жидкости продуцентов позволило выявить, что A. ustus 1 выделяет в среду культивирования больше белка, чем A. ochraceus L-1 (табл. 2). Сопоставление удельных значений фибринолитической и коллагенолитической активностей внеклеточных протеиназ данных микромицетов, рассчитанных на мкг белка, при рН реакции, проявившем максимальные значения активности, показало, что A. ochraceus L-1 имеет примерно одинаковые значения удельных активностей при росте на обеих
средах и они выше, чем у A. ustus 1 в 2,1 и 1,6 раз, соответственно (табл. 2). Значения удельных фибринолитической и коллагенолитической активностей протеиназ A. ustus 1, как и значения общих протеолитических активностей были на среде № 2 в 3 и 7 раз больше, чем на среде № 1. Сравнение удельных значений общей протеолитической активности протеиназ микромицетов на обеих средах показало, что A. ochraceus L-1 и A. ustus 1 обладают в 3,2 и 3,8 раз, соответственно, большей активностью на среде № 1, чем на среде № 2.
Соотношение фибринолитической и общей протеолитической активностей (ФА/ОПА) микромицетов A. ochraceus L-1 и A. ustus 1 представлено на рисунке. Как для значений общих активностей, так и для значений удельных активностей это соотношение для A. ustus 1 в 38 раз больше, чем для A. ochraceus L-1, что говорит о большей специфичности протеиназ A. ustus 1 к фибриллярным белкам по сравнению с A. ochraceus L-1.
Соотношение ФА/ОПА, показанное для протеиназ A. ustus 1, на среде № 2 в 11,5 раз больше, чем полученное на среде № 1. Вероятно, качественно и количественно изменяя источники азота в среде культивирования, возможно увеличить это соотношение и, таким образом, получить высокоспецифичные к фибрину и коллагену протеиназы. Аналогичные результаты были показаны для Penicillium chrysogenum H9. На среде с нитратом натрия соотношение ФА/ОПА для протеиназ этого ми-кромицета, как и для A. ustus 1, составило больше 6, а при варьировании источниками азота удалось его увеличить в 2,6 раза [12]. Именно поэтому протеолитические ферменты, образуемые A. ustus 1 и проявляющие выраженное действие на фибрин, представляют значительный интерес.
Таблица 2
Удельные значения протеолитической активности A. ochraceus и A. ustus
Микромицет № среды Общий белок, мкг/мл Удельная общая протеолити-ческая активность, ЕТир/мкг белка Удельная фибринолитическая активность, ЕТир/мкг белка Удельная коллагенолитическая активность, ЕАзк/мкг белка х 10-3
A. ochraceus 1 5,3 17,90 3,32 11,26
2 2,2 5,68 3,86 13,77
A. ustus 1 31,1 1,00 0,55 1,19
2 12,8 0,26 1,77 8,37
Таким образом, микромицеты А. оскгасвт Ь-1 и А. шШ 1 изучены в качестве продуцентов проте-иназ направленного действия. Показано, что внеклеточные протеиназы, образуемые этими штаммами, отличаются по проявлению активности при разных значениях рН и выраженности своего действия на фибриллярные белки. Внеклеточные протеиназы А. оскгасвт Ь-1 проявляют максимальную активность при росте микромицета на среде без нитрата при рН 8,0 и высокие значения удельных фибринолитической (3,86 ЕТир/мкг белка) и кол-лагенолитической (13,77 ЕАзк/мкг белка х 10-3) активностей. Для внеклеточных протеиназ А. тШз 1 показана максимальная активность при росте продуцента на среде, содержащей нитрат натрия, при рН реакции 6,0 и небольшими, по сравнению с А. оскгасвт Ь-1, значениями удельных фибрино-литической и коллагенолитической активностей (1,77 ЕТир/мкг белка и 8,37 ЕАзк/мкг белка х 10-3, соответственно). Однако штамм А тШз 1 практически не проявляет общей протеолитической (казеино-
« 8/00 -,
те
О.
>S 7,00 -0)
0 6'00 -
1
s 5,00 -
2 4,00 -S
| 3,00 -о
X 2,00 -
0,00 -I-
1
■ А. осЬгассиз □ А. иэилБ
Рисунок. Соотношение общих фибринолитической и протеолитической (1) и удельных (2) активностей протеиназ микро-мицетов А. оскгасвт и А. шШ
литической) активности, и ФА/ОПА составило 6,92, что делает его перспективным продуцентом фибри-нолитических и коллагенолитических протеиназ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zanoelo F.F., Giannesi G.C., Cabral H. Proteolytic enzymes: biochemical properties, production and biotechno logical application // Fungal enzymes / Eds. M.L.T.M. Polizeli and M. Rai. Boca Raton: CRC Press, 2013. P. 94-112.
2. Kotb E. Activity assessment of microbial fibrinolytic enzymes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. Vol. 97. N 15. P. 6647-6665.
3. Egorov N.S. Microbiological synthesis of proteolytic enzymes possessing fibrinolytic activity // Thrombosis and thrombolysis / Eds. E.I. Chazov and V.N. Smirnov. N.Y.: Consultants Bureau, 1986. P. 197-221.
4. Nirmal N.P., Shankar S., Laxman R.S. Fungal proteases: An overview // Int. J. Biotech. Biosc. 2011. Vol. 1. N 1. P. 1-40.
5. Ландау Н.С., Кураков А.В., Гуликова О.М., Батомун-куева Б.П., Струкова С.М., Егоров Н.С. Экстрацеллюлар-ные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами // Микробиология. 1998. Т. 67. № 2. С. 215-220.
6. Клечковская В.В., Егоров Н.С. О плазмокоагули-рующей и фибринолитической активностях грибов рода Aspergillus // Микробиология. 1983. Т. 52. № 3. С. 396-403.
7. Osmolovskiy A.A., Kreier V.G., Kurakov A.V., Barano-va N.A., Egorov N.S. Aspergillus ochraceus micromycetes —
producers of extracellular proteinases — protein C activators of blood plasma // Appl. Biochem. Microbiol. 2012. Vol. 48. N 5. P. 488-492.
8. Osmolovskiy A.A., Zvonareva E.S., Kreyer V.G., Ba-ranova N.A., Egorov N.S. The effect of micromycete extracellular proteases of the Aspergillus genus on the proteins of haemostatic system // Russ. J. Bioorg. Chem. 2014. Vol. 40. N 6. P. 634-639.
9. Sukhosyrova E.A, Nikitina Z.K., Yakovleva M.B., Veshchikova E.V., Bykov V.A. Characteristics of collageno-lytic enzymes secreted by deuteromycete fungi Aspergillus flavus // Bull. Exp. Biol. Med. 2003. Vol. 135. N 5. P. 447-451.
10. Barthomeuf C. Pourrat H., Pourrat A. Collagenolytic of a new semi-alkaline protease from Aspergillus niger // J. Ferment. Bioeng. 1992. Vol. 73. N 3. P. 233-236.
11. Schirasaka N., Naitou M., Okamura K., Kusuda M., Fukuta Y., Terashita T. Purification and characterization of a fibrinolytic protease from Aspergillus oryzae KSK-3 // My-coscience. 2012. Vol. 53. N 5. P. 354-364.
12. El-Aassar S.A., El-Badry H.M., Abdel-Fattah A.F. The biosynthesis of proteases with fibrinolytic activity in immobilized cultures of Penicillium chrysogenum H9 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. Vol. 33. N 1. P. 26-30.
13. Попова Е.А., Крейер В.Г., Осмоловский А.А., Егоров Н.С. Получение препарата коллагенолитической протеиназы, образуемой Aspergillus ustus в условиях глубинного и твердофазного культивирования // Усп. мед. микологии. 2014. Т. 12. С. 333-335.
14. Sharkova T.S., Kurakov A.V., Osmolovskiy A.A., Matveeva E.O., Kreyer V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. Screening of producers of proteinases with fibrinolytic and collagenolytic activities among micromycetes // Microbiology. 2015. Vol. 84. N 3. P. 359-364.
15. Batomunkueva B.P., Egorov N.S. Isolation, purification and resolution of the extracellular proteinase complex of Aspergillus ochraceus 513 with fibrinolytic and anticoagulant activities // Microbiology. 2001. Vol. 70. N 5. P. 519-522.
16. Hagihara B., Matbara H., Nakai M., Okunuk K. Crystalline bacterial proteinase. I. Preparation of crystalline proteinase of Bacillus subtilis // J. Biochem. 1958. \Ы. 45. N 3. P. 185-194.
17. Егоров Н.С., Ландау Н.С., Буяк Л.И., Крейер В.Г. Гидролитическая система нокардиоформной бактерии
Nocardia minima в процессе ее роста, развития и дифференциации // Микробиология. 1991. Т. 60. № 4. С. 637-643.
18. Mukherjee A.K., Rai C.K., Thakur R., Chattopadhyay P., Kar S.K. Bafibrinase: a non-toxic, non-hemorrhagic, direct-acting fibrinolytic serine protease from Bacillus sp. strain AS-S20-I exhibits in vivo anticoagulant activity and thrombolytic potency // Biochimie. 2012. Vol. 94. N 6. P. 1300-1308.
19. Bollag D.M., Edelstein S.J. Protein Methods. N.Y: Wiley-Liss Inc., 1991. P. 72-73.
20. Gertler A., Trop M. The elastase-like enzymes from Streptomyces griseus (Pronase). Isolation and partial characterization // Eur. J. Biochem. 1971. Vol. 9. N 1. P. 90-96.
21. Osmolovsky A.A, Kreier V.G., Baranova N.A., Kurakov A.V., Egorov N.S. Production of extracellular proteinases — protein C activators of blood plasma — by the micrimycete Aspergillus ochraceus during submerged and solid-state fermentation // Appl. Biochem. Microbiol. 2013. Vol. 49. N 6. P. 581-586.
Поступила в редакцию 06.08.2015
FIBRINOLYTIC AND COLLAGENOLYTIC ACTIVITY OF EXTRACELLULAR PROTEINASES OF MICROMYCETES ASPERGILLUS OCHRACEUS L-l AND
ASPERGILLUS USTUS l
A.A. Osmolovskiy1*, E.A. Popova1, V.G. Kreyer1, N.A. Baranova1, N.S. Egorov2
1 Department of Microbiology, School of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia;
2 International Biotechnological Center, M.V. Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia; * e-mail: [email protected]
It was shown that extracellular proteinases produced by micromycetes A. ochraceus L-1 and A. ustus 1 differ by the values of activity at various pH values and the intensity of its effect on fibrillar proteins. It was revealed that the proteinase of A. ochraceus L-1 demonstrated maximum activity during the growth of the producer on nitrate-free growth medium, at pH 8.0, and proteinase of A. ustus 1 showed maximum activity during the growth of the micromycete on a medium containing sodium nitrate, at pH of 6.0. Values of specific fibrinolytic and collagenolytic activities of A. ochraceus L-1 were in 2.2 and 1.6 times greater than those activities of A. ustus 1, but A. ustus 1 showed low values of total proteolytic (caseinolytic) activity and had a high ratio of fibrinolytic activity to total proteolytic (caseinolytic) activity (6.92), making it a promising producer of proteinases which hydrolyze fibrin and collagen.
Key words: fibrinolytic enzymes, collagenolytic enzymes, proteinases of micromycetes.
Сведения об авторах:
Осмоловский Александр Андреевич — канд. биол. наук, зам. декана, ст. преп. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: [email protected]
Попова Елизавета Андреевна — науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: [email protected]
Крейер Валериана Георгиевна — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: [email protected]
Баранова Нина Андреевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: [email protected]
Егоров Николай Сергеевич — докт. биол. наук, проф. Международного биотехнологического центра МГУ имени М.В. Ломоносова. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: [email protected]
