CC BY
26
24
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2017. Т. 72. № 1. С. 24-28
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 582.282.123.4:577.152.34
СПОСОБНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ МИКРОМИЦЕТОВ ASPERGILLUSFLAVIPES, ASPERGILLUSFUMIGATUSИ ASPERGILLUSSYDOWII ВОЗДЕЙСТВОВАТЬ НА БЕЛКИ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА ЧЕЛОВЕКА
А.А. Осмоловский1*, А.В. Кураков2, В.Г. Крейер1, Н.А. Баранова1, Н.С. Егоров3
1 Кафедра микробиологии и 2 кафедра микологии и альгологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12;
3 Международный биотехнологический центр, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова;
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12; *e-mail: aosmol@mail.ru
Изучена способность внеклеточных протеиназ A. flavipes А17, A. fumigatus D1 и A. sy-dowii 1 проявлять активность по отношению к белкам системы гемостаза человека. Показано, что протеиназы A. fumigatus D1 способны гидролизовать широкий набор специфичных хромогенных пептидных субстратов протеиназ системы гемостаза человека, а протеиназы, образуемые A. flavipes А17 и A. sydowii 1, проявляют более узкую специфичность, в основном — по отношению к субстратам тромбина и плазмина. Было впервые показано, что протеиназы A. flavipes А17 способны активировать протеин С и фактор Х. Внеклеточные протеиназы A. sydowii 1 проявляли большую фибринолитическую активность, чем протеиназы A. flavipes А17 и A. fumigatus D1.
Ключевые слова: протеиназы микромицетов, аспергиллы, белки системы гемостаза, фибринолитические ферменты, протеиназы — активаторы белков системы гемостаза, амидолитическая активность.
Протеолитические ферменты, встречающиеся во всех без исключения живых организмах, как служат для расщепления белковых субстратов, так и выполняют регуляторную функцию. Например, ключевые звенья системы гемостаза человека — свертывание крови и фибринолиз, представляют собой многокомпонентные протеолитические процессы, в которых, как известно, продукт предыдущей реакции служит ферментом для следующей [1]. Участвующие в этих реакциях белки представляют собой протеиназы, для которых характерны высокая скорость и специфичность проводимых реакций. Их использование в случае нарушений существующего равновесия между реакциями свертывания и разжижения крови позволяет проводить терапию тромбозов и тромбоэмболических заболеваний. Активность, подобная активности протеиназ системы гемостаза, была найдена у протеиназ, содержащихся в яде змей и в культуральной жидкости микроорганизмов. Полученные на их основе препараты используются в составе диагностических наборов и терапевтических средств для выявления и лечения подобного рода осложнений [2—4].
Внеклеточные протеолитические ферменты мик-ромицетов обладают способностью воздействовать на белки системы гемостаза в качестве активаторов (запуская прокоагулянтные и антикоагулянтные процессы) или прямых фибринолитиков (расщепляя образованные тромбы) [4—6]. Наиболее активными продуцентами таких протеиназ считаются микро-мицеты рода Aspergillus [6]. Для некоторых аспер-гиллов было показано, что образуемые ими протеи-
назы проявляют специфичность по отношению к некоторым белкам системы гемостаза, таким как протеин С (A. ochraceus L-1), фактор Х (A. ochra-ceus L-1), прекалликреин (A. terreus 2), фибрин (A. ochraceus L-1, A oryzae, A. versicolor 1, A. ustus 1, Aspergillus brasiliensis AUMC 9735, A. flavus AUMC 9736, A. japonicum KSS05, A. niger), фибриноген (A. ochraceus L-1) [6—10]. Таким образом, микроми-цеты образуют протеиназы, способные либо осуществлять протеолиз белков системы гемостаза, либо, наряду с гидролитической активностью, проявлять способность активировать проферменты этой системы, переводя их в активную форму ("актива-торная активность"). В связи с этим актуальным представляется выявление спектра протеолитиче-ского действия по отношению к белкам системы гемостаза внеклеточных протеиназ микромицетов — их потенциальных продуцентов.
Специфическая активность протеиназ аспер-гиллов по отношению к белкам системы гемостаза человека позволяет считать их перспективными заменителями компонентов в соответствующих диагностических и терапевтических препаратах.
Целью работы было изучение воздействия протеиназ A. flavipes А17, A. fumigatus D1 и A. sydowii 1 на белки системы гемостаза человека.
Материалы и методы
Объекты исследования и условия культивирования.
Использовали штаммы A. flavipes А17 и A. sydowii 1 из коллекции кафедры микологии и альгологии
МГУ и А. fumigatus из коллекции кафедры микробиологии МГУ. Микромицеты культивировали в глубинных условиях на орбитальной качалке (200 об/мин) в колбах объемом 750 мл со 100 мл питательной среды при 28°С в течение 2 сут на среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон [11], после чего часть полученного посевного материала переносили в среду следующего состава (в %): глюкоза — 3,0, глицерин — 7,0, гидролизат рыбной муки — 0,5, NN0.^ — 0,2, КН2Р04 — 0,05, MgSO4 — 0,05 с последующим культивированием в течение 5 сут. Засев осуществляли смывом спор микроми-цетов, выращенных в пробирках на скошенном сусло-агаре в течение 7 сут.
Определение протеолитической активности. Активность внеклеточных протеиназ микромицетов определяли в фильтрате культуральной жидкости. Фильтрацию проводили под вакуумом через фильтровальную бумагу марки "ФС" (Россия). Определение активности протеиназ осуществляли с помощью хромогенных пептидных субстратов без добавления плазмы крови (прямая амидолитическая активность) и с ее добавлением (активаторная активность), а также с бычьим фибрином (фибринолитическая активность) и казеином (общая протеолитическая активность).
Для определения гидролитической активности внеклеточных протеиназ к 200 мкл культуральной жидкости добавляли 100 мкл 0,05%-ного раствора (в 0,05 М Трис-НС1-буфере, рН 8,2) следующих хромогенных субстратов: Н-В-Уа1^еи^уз-рМА — для определения плазмина, Bz-I1e-G1u(0R)-G1y-Arg-рМА и 7-Б-А^^1у-А^-рМА — для определения активированного фактора Х плазмы крови человека (фактор Ха), G1p-Pro-Arg-pNA — для определения активированного протеина С, G1p-G1y-Arg-pNA — для определения урокиназы, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA и Tos-G1y-Pro-Arg-pNA — для определения тромбина [12]. Реакцию проводили при 37°С в соответствии с описанной ранее методикой [6].
Активаторную активность определяли аналогичным способом, прединкубируя культуральную жидкость с 50 мкл человеческой плазмы крови, разведенной в 2 раза 0,05М Трис-НС1-буфером, рН 8,2 [7].
Реакции останавливали добавлением 200 мкл 50%-ной уксусной кислоты. За единицу активности (Е) принимали количество мкМ п-нитроанилина, отщепившегося от субстрата за 1 мин.
Фибринолитическую и общую протеолитиче-скую активности определяли с помощью модифицированного метода Ансона — Хагихары, инкубируя при 37°С 200 мкл культуральной жидкости и 400 мкл 1%-ной суспензии фибрина или раствора казеина, приготовленных на 0,1 М Трис-НС1-бу-фере, рН 8,2, как описано ранее [10, 13] Активность выражали в мкМ тирозина, образовавшегося в течение 1 мин в 1 мл культуральной жидкости (ЕТир).
Реакции проводили при постоянном перемешивании в термошейкере TS-100 ("BioSan", Латвия). Измерение оптической плотности растворов проводили на спектрофотометре Hitachi 200-20 (Япония).
Результаты и их обсуждение
Способность A. flavipes А17, A. fumigatus D1 и A. sydowii 1 образовывать внеклеточные протеоли-тические ферменты, обладающие активностями некоторых протеиназ системы гемостаза человека, была изучена по расщеплению специфичных для протеиназ гемостаза хромогенных пептидных субстратов в соответствии с разработанной методикой [6]. При определении спектра расщепляемых субстратов особое внимание обращали на те субстраты, которые не расщеплялись протеиназами исследованных микромицетов. В таких случаях куль-туральную жидкость микромицетов дополнительно инкубировали с плазмой крови человека и таким образом выявляли активаторное воздействие протеи-назы на предполагаемый профермент плазмы крови.
Результаты определения активности внеклеточных протеиназ исследованных микромицетов с хромогенными пептидными субстратами протеиназ системы гемостаза приведены в табл. 1. Данные показывают, что все три штамма в разной степени обладают протеолитической активностью и способны расщеплять использованные субстраты. Так, A. fumigatus D1 был способен образовывать протеи-назы, расщеплявшие все перечисленные субстраты, и по этому свойству он сходен с другими аспергил-лами — A. ustus 1 и A. versicolor 1 [6].
Наибольшую активность протеиназы A. fumigatus D1 проявили с субстратами тромбина (Tos-Gly-Pro-Arg-pNA), плазмина (H-D-Val-Leu-Lys-pNA), фактора Ха (Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA) и активированного протеина С (Glp-Pro-Arg-pNA). Эти значения активности были в среднем в 13—15 раз больше, чем значения активности, определенные с другими субстратами — H-D-Phe-Pip-Arg-pNA, pGlu-Gly-Arg-pNA и Bz-Ile-Glu(OR)-Gly-Arg-pNA. Интересно отметить, что по гидролизу протеиназами аспер-гиллов хромогенных субстратов выявляется специфичность протеиназ A. fumigatus D1 к хромоген-ным пептидным субстратам: из двух субстратов тромбина и двух субстратов фактора Ха они эффективно гидролизовали лишь один. По-видимому, на проявление субстратной специфичности про-теиназ A. fumigatus D1, как и протеиназ других аспергиллов, существенное значение оказывают как последовательность аминокислотных остатков в субстрате, так и их количество: одни протеиназы активно гидролизуют более короткие пептиды, а другие — более длинные [6].
Микромицеты A flavipes А17 и A sydowii 1 также образовывали протеиназы, способные расщеплять субстрат плазмина и один из субстратов тромбина — Tos-Gly-Pro-Arg-pNA. Однако их активность была ниже, чем активность протеиназ A. fumigatus D1
Таблица 1
Расщепление хромогенных пептидных субстратов белков системы гемостаза внеклеточными протеиназами аспергиллов
Хромогенный субстрат Фермент, расщепляющий субстрат Значение активности, Е/мл -10-3
A. flavipes A17 A. fumigatus D-1 A. sydowii 1
Tos-Gly-Pro-Arg-pNA Тромбин 6,6 49,9 8,4
H-D-Phe-Pip-Arg-pNA Тромбин 0 2,0 0
H-D-Val-Leu-Lys-pNA Плазмин 27,9 29,8 16,3
pGlu-Gly-Arg-pNA Урокиназа 0 6,0 4,6
Bz-Ile-Glu(OR)-Gly-Arg-pNA Активированный фактор Х 0 3,6 0
Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA Активированный фактор Х 0 30,9 0
pGlu-Pro-Arg-pNA Активированный протеин С 0 35,9 2,2
(табл. 1). Внеклеточные протеиназы обоих микромицетов оказались неспособны расщеплять субстраты фактора Ха, что может отличать их субстратную специфичность от субстратной специфичности протеиназ A. fumigatus D1. Аналогичные свойства протеиназ были ранее показаны у A. ustus 1 и A. versicolor 1 [6]. Образуемые A. sydowii 1 протеиназы также, но в меньшей степени, чем протеиназы A. fumigatus D1, расщепляли субстраты урокиназы и активированного протеина С (на 23,3% и на 93,8%, соответственно).
В табл. 2 представлены результаты определения с хромогенными пептидными субстратами ак-тиваторной активности протеиназ аспергиллов по отношению к проферментам системы гемостаза. Эти субстраты не расщеплялись протеиназами A. flavipes А17 и A. sydowii 1. Как видно из таблицы, протеи-назы, образуемые A. sydowii 1, не были способны активировать проферменты системы гемостаза с образованием ферментов, расщепляющих использованные субстраты. Протеиназы A. flavipes А17 проявили активаторную активность по отношению к проферментам — фактору Х и протеину С. Среди изученных к настоящему времени аспергиллов подобные свойства протеиназ были выявлены
у A. ochraceus L-1, известного как продуцента протеиназ — активаторов протеина С и фактора Х [14, 15]. Проявление подобной активности делает A fla-vipes А17 потенциальным продуцентом протеиназ подобного действия и перспективным для дальнейшего изучения. Значения активаторных активностей протеиназ данного микромицета оказались в среднем в 11 раз ниже, чем у протеиназ, образуемых A. ochraceus L-1 [6].
Исходя из полученных данных, можно предположить, что протеиназы изученных микромицетов могут проявлять фибринолитическую активность. Для этого, а также для выявления специфичности образуемых протеиназ к фибрину, определяли про-теолитическую активность в культуральной жидкости микромицетов по гидролизу фибрина и казеина. В результате было показано, что внеклеточные про-теиназы A. flavipes А17, A. fumigatus D1 и A. sydowii 1 обладают фибринолитической (ФА) и общей про-теолитической (ОПА) активностями. Соотношение этих активностей (ФА/ОПА) является важным показателем направленного воздействия протеиназ на фибрин [16]. Для A flavipes А17 это соотношение составило 0,27, для A. fumigatus D1 — 0,10 и для A. sydowii 1 — 0,64 (рисунок). Для аспергиллов со-
Таблица 2
Активаторная по отношению к белкам системы гемостаза активность внеклеточных протеиназ A. flavipes А17 и A. sydowii 1
Хромогенный субстрат Фермент, расщепляющий субстрат Значение активности, Е/мл • 10-3
A. flavipes А17 A. sydowii 1
H-D-Phe-Pip-Arg-pNA Тромбин 0 0
pGlu-Gly-Arg-pNA Урокиназа 0 н/о*
Bz-Ile-Glu(OR)-Gly-Arg-pNA Активированный фактор Х 0 0
Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA Активированный фактор Х 3,0 0
pGlu-Pro-Arg-pNA Активированный протеин С 6,2 н/о
* н/о — активность не определяли.
отношение ФА/ОПА может быть различным: например, для А. оекгасвш Ь-1 оно составило 0,18, а для А. тШз 1 — 6,92 [10].
Следует отметить, что найденные соотношения ФА/ОПА не коррелируют со значениями плазми-ноподобной активности (активности, связанной с расщеплением субстрата плазмина), выявленной для А. Аау1рвз А17, А. fumigatus Б1 и А. sydowii 1 (27,9 Е/мл • 10-3, 29,8 Е/мл • 10-3 и 16,3 Е/мл • 10-3, соответственно; табл. 1). Протеиназы, образуемые А. fumigatus Б1, к примеру, проявляли наибольшую плазминоподобную активность среди остальных микромицетов, а соотношение ФА/ОПА оказалось наименьшим. Полученные результаты указывают на необходимость дальнейшего изучения протеиназ А. flavipes А17, А. fumigatus Б1 и А. sydowii 1 для выявления мишеней их действия среди белков системы гемостаза.
Таким образом, изучена активность внеклеточных протеиназ А. flavipes А17, А. fumigatus Б1 и А. sydowii 1 по отношению к протеиназам системы гемостаза человека. Протеиназы А. fumigatus Б1 способны гидролизовать широкий набор специфичных хромогенных пептидных субстратов протеиназ системы гемостаза. Протеолитические ферменты, образуемые А. flavipes А17 и А. sydowii 1, проявляли более
00 0,60
со
а
CD с .50 О
0
1 0.40
£ СО
® С.ЗС
I
CD
3
о С.20
I-
о о
О с. 10
A. flavipes
A. fumigatus
A. sydowii
Рисунок. Отношение фибринолитической активности к общей протеолитической активности у аспергиллов
узкую специфичность, в основном к субстратам тромбина и плазмина. Для протеиназ А. flаvipes А17 была впервые показана активаторная активность по отношению к протеину С и фактору Х. Внеклеточные протеиназы А. sydowii 1 обладали более выраженной фибринолитической активностью (соотношение ФА/ОПА составило 0,64), чем протеиназы других изученных штаммов аспергиллов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Струкова С.М. Современные представления о механизме свертывания крови // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов. 2002. № 2. C. 21—26.
2. Sajevic T., Leonardi A., Krizaj I. Haemostatically active proteins in snake venoms // Toxicon. 2011. Vol. 57. N 5. P. 627-645.
3. Kotb E. The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombi // Biotechnol. Prog. 2014. Vol. 30. N 3. P. 656-672.
4. Sharkova T.S., KurakovA.V., OsmolovskiyA.A., Mat-veeva E.O., Kreyer V.G., Baranova NA., Egorov N.S. Screening of producers of proteinases with fibrinolytic and collageno-lytic activities among micromycetes // Microbiology. 2015. Vol. 84. N 3. P. 359—364.
5. Kotb E., Helal G.E.-D.A., Edries F.M. Screening for fibrinolytic filamentous fungi and enzymatic properties of the most potent producer, Aspergillus brasiliensis AUMC 9735 // Biologia. 2015. Vol. 70. N 12. P. 1565—1574.
6. Osmolovskiy A.A., Zvonareva E.S., Kreyer V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. The effect of micromycete extracellular proteases of the Aspergillus genus on the proteins of haemostatic system // Russ. J. Bioorg. Chem. 2014. Vol. 40. N 6. P. 634—639.
7. Osmolovskiy A.A., Kreier V.G., Kurakov A.V., Baranova N.A., Egorov N.S. Aspergillus ochraceus micromycetes — producers of extracellular proteinases — protein C activators of blood plasma // Appl. Biochem. Microbiol. 2012. Vol. 48. N 5. P. 488—492.
8. Aradhye P.K., Chavan M.D. Production and characterization of fibrinolytic enzyme from Aspergillus niger // World J. Pharm. Pharm. Sci. 2015. Vol. 3. N 9. P. 843—851.
9. Yadav S., Siddalingeshwara K.G. Screening and biosynthesis of fibrinolytic enzyme from Aspergillus japonicum // J. Drug Deliv. Therap. 2015. Vol. 5. N 6. P. 60—62.
10. Osmolovskiy A.A., Popova E.A., Kreyer V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. Fibrinolytic and collagenolytic activity of extracellular proteinases of the strains of micromycetes Aspergillus ochraceus L-1 and Aspergillus ustus 1 // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016. Vol. 71. N 1. P. 62—66.
11. Batomunkueva B.P., Egorov N.S. Isolation, purification and resolution of the extracellular proteinase complex of Aspergillus ochraceus 513 with fibrinolytic and anticoagulant activities // Microbiology. 2001. Vol. 70. N 5. P. 519—522.
12. Proteolytic enzymes. A practical approach / Eds. R. Beynon and J.S. Bond. Oxford: Oxford Univ. Press, 2001. 340 p.
13. Егоров Н.С., Ландау Н.С., Буяк Л.И., Крейер В.Г. Гидролитическая система нокардиоформной бактерии Nocardia minima в процессе ее роста, развития и дифференциации // Микробиология. 1991. Т. 60. № 4. С. 637—643.
14. Zvonareva E.S., Osmolovskiy A.A., Kreyer V.G., Baranova N.A., Kotova I.B., Egorov N.S. Identification of targets for extracellular proteases activating proteins of the haemostatic system produced by micromycetes Aspergillus ochraceus and Aspergillus terreus // Russ. J. Bioorg. Chem. 2015. Vol. 41. N 5. P. 500—505.
15. Osmolovskiy A.A., Kreyer V.G. Baranova N.A., Kurakov A.V., Egorov N.S. Properties of extracellular proteinase — an activator of Protein C in blood plasma formed by Aspergillus ochraceus // Appl. Biochem. Microbiol. 2015. Vol. 51. N 1. P. 95—101.
16. El-Aassar S.A., El-Badry H.M., Abdel-Fattah A.F. The biosynthesis of proteases with fibrinolytic activity in immobilized cultures of Penicillium chrysogenum H9 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. Vol. 33. N 1. P. 26—30.
Поступила в редакцию 20.11.2016 Принята в печать 16.12.2016
MICROBIOLOGY
THE ABILITY OF EXTRACELLULAR PROTEINASES OF MICROMYCETES ASPERGILLUSFLAVIPES, ASPERGILLUSFUMIGATUS AND ASPERGILLUSSYDOWIITO AFFECT PROTEINS OF THE HUMAN HAEMOSTATIC SYSTEM
A.A. Osmolovskiy1*, A.V. Kurakov2, V.G. Kreyer1, N.A. Baranova1, N.S. Egorov3
1 Department of Microbiology and 2 Department of Mycology and Algology, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University; Leninskiye Gory 1—12, Moscow, 119234, Russia; 3 International Biotechnology Center, Lomonosov Moscow State University; Leninskiye Gory 1—12,
Moscow, 119234, Russia *e-mail: aosmol@mail.ru
The effect of extracellular proteases of A. flavipes A17, A. fumigatus D1 and A. sydowii 1 to proteins of the human hemostasis system was studied. It was shown that A. fumigatus D1 proteinases are able to hydrolyze wide range of chromogenic peptide substrates of specific human proteinases of the haemostatic system. Proteinases formed by A. flavipes A17 and A. sydowii 1 have a narrow specificity, mainly to thrombin and plasmin substrates. It was first shown that proteinase of A. flavipes A17 is capable to activate protein C and Factor X. Extracellular proteinase produced by A. sydowii 1 has greater fibrinolytic activity as compared with proteinases produced by A. flavipes A17 and A. fumigatus D1.
Keywords: proteinases of micromycetes, Aspergillus, proteins of the haemostatic system, fibrinolytic enzymes, proteinases — protein activators of the haemostatic system proteins, amidolytic activity.
Сведения об авторах:
Осмоловский Александр Андреевич — канд. биол. наук, ст. преп. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: aosmol@mail.ru
Кураков Александр Васильевич — докт. биол. наук, зав. кафедрой микологии и альгологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-54-82; e-mail: kurakov57@mail.ru
Крейер Валериана Георгиевна — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: vkreyer@yandex.ru
Баранова Нина Андреевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: vkreyer@yandex.ru
Егоров Николай Сергеевич — докт. биол. наук, проф. Международного биотехнологического центра МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: nsegorov21@mail.ru
