CC BY
36
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2017. T. 72. № 4. С. 241-245
241
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.222.3:577.152.34
СЕКРЕЦИЯ МИКРОМИЦЕТАМИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ, АКТИВНЫХ ПО ОТНОШЕНИЮ К ФИБРИЛЛЯРНЫМ БЕЛКАМ
Е.А. Попова1, Д.М. Бедненко1, А.А. Осмоловский1*, В.Г. Крейер1, И.Б. Котова1, Н.С. Егоров2
1 Кафедра микробиологии и 2Международный биотехнологический центр, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12 *e-mail: aosmol@mail.ru
Показано, что микромицеты Aspergillus ustus 1 и Tolypocladium inflatum k1 секретируют протеолитические ферменты, обладающие высокой коллагенолитической, фибринолити-ческой и эластолитической активностью. Активность протеиназ, гидролизующих фибриллярные белки, определяемая по расщеплению азоколлагена, у T. inflatum k1 составила 122,6*10—3 ЕАзк/мл у A.ustus 1 и 69,7*10-3 ЕАзк/мл (ЕАзк — количество расщепившегося за 1 мин азоколлагена в микрограммах). Максимальные значения активности наблюдались при культивировании в глубинных условиях A. ustus 1 в течение 4 сут, а T. inflatum k1 — в течение 5 сут. Показано, что максимумы проявления коллагенолитической и общей про-теолитической активности при культивировании у A. ustus 1, в отличие от T. inflatum k1, разнесены во времени, что, предположительно, может упростить процедуру получения активных по отношению к фибриллярным белкам протеиназ.
Ключевые слова: протеиназы микромицетов, протеолитическая активность, фибри-нолитические ферменты, коллагенолитические ферменты, эластолитические ферменты, энзиматический индекс
Протеолитические ферменты, высокоактивные по отношению к фибриллярным белкам, находят свое применение в различных промышленных отраслях. Например, для размягчения мясного сырья в пищевой промышленности и шкур животных в легкой промышленности используют коллагенолитические протеиназы [1]. Протеиназы, обладающие фибринолитической активностью, входят в состав препаратов, необходимых для комплексной тромболитической терапии, что делает их важным продуктом медицинской промышленности [2, 3].
Существующие способы получения подобных ферментов обладают некоторыми недостатками. Так, технология получения брахиуринов из гепа-топанкреаса камчатских крабов отличается образованием большого количества отходов во время производственного процесса, требующих утилизации [4]. Среди бактериальных продуцентов колла-генолитических ферментов наиболее активным является Clostridium hystoliticum — анаэробная спо-рообразующая патогенная бактерия, возбудитель газовой гангрены [5]. Использование такого продуцента требует повышенных мер безопасности на всех стадиях производства. В последнее время все большее внимание в качестве источников колла-генолитических и фибринолитических ферментов уделяется микромицетам. Среди продуцентов таких протеиназ известны представители родов Alternaria,
Aspergillus, Fusarium, Cladosporium, Pénicillium [1-3]. Однако образуемые некоторыми видами этих микромицетов ферменты не всегда по своим свойствам оказываются перспективными для применения. Поэтому изучение коллагенолитических и фибрино-литических ферментов, продуцируемых микроми-цетами, и поиск среди них наиболее подходящих по-прежнему остаются актуальными.
Протеолитическая активность у обнаруженных в последнее время штаммов микромицетов Beau-veria bassiana 2, Tolypocladium inflatum k1, Aspergillus ustus 1 и Purpureocillum lilacinum k1 может представлять значительный интерес [3]. Известно, что для микромицетов-энтомопатогенов, таких как B. bassiana 2 и T. inflatum k1, характерен широкий спектр образуемых внеклеточных протеолитических ферментов, что обусловлено их паразитическим образом жизни, а именно необходимостью преодоления жестких покровов насекомых при прорастании спор [6, 7]. Для микромицетов-сапротрофов A. ustus 1 и P. lilacinum k1 показаны высокие значения фибри-нолитической активности, что позволяет предположить образование и других, высокоактивных по отношению к фибриллярным белкам, ферментов [3].
Целью работы было изучение протеолитиче-ской активности Beauveria bassiana 2, Tolypocladium inflatum k1 , Aspergillus ustus 1 и Purpureocillum lilaci-num k1 по отношению к фибриллярным белкам.
Материалы и методы
Объекты исследования и их культивирование. В работе были изучены микромицеты из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГУ, отобранные ранее в качестве продуцентов протеолитических ферментов: Beauveria bassiana 2, Tolypocladium inflatum kl, Aspergillus ustus 1, Purpureocillum lilacinum kl [3].
Выявление протеолитического потенциала штаммов проводили при поверхностном культивировании в чашках Петри на средах следующего состава (г/л): KH2PO4 - 0,5, MgSO4 - 0,25, пептон - 5,0, казеи-нат натрия, желатин, фибрин, эластин — 10,0, агар — 15,0 [8]. Посев производили уколом в центр чашки, измерения диаметров зон гидролиза и колоний проводили через 7 сут. Энзиматический индекс (ET) рассчитывали по следующей формуле — EI = -—+—-, где D — диаметр колонии в мм, а d — диаметр -^ны гидролиза в мм [8—10].
Культивирование микромицетов в глубинных условиях проводили в качалочных колбах объемом 750 мл со 100 мл питательной среды на орбитальных качалках (200 об/мин) при 28°С. Выращенные на скошенном сусло-агаре 7-суточные культуры использовали в качестве посевного материала. Процесс культивирования осуществляли в две стадии: первые двое суток — в посевной среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон [8], затем часть биомассы переносили в ферментационную среду следующего состава (г/л): глицерин — 70,0, глюкоза — 30,0, соевая мука — 5,0, пептон — 5,0, NaH2PO4 — 0,5, MgSO4 — 0,5, KCl — 0,5.
Определение протеолитической активности. Общую протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона-Хагихары по количеству тирозина в неосаждаемых трихлоруксус-ной кислотой продуктах протеолиза после 10-минутного гидролиза 1%-ного раствора казеина в 0,1 М Трис-HCl буфере (рН 8,0—8,2, 37°С), как описано ранее [11]. Активность выражали в мкМ тирозина в минуту (ЕТир).
Коллагенолитическую активность определяли колориметрически с использованием азоколлагена по общепринятой методике. Активность выражали как количество расщепившегося за 1 мин азоколлагена в микрограммах (ЕАзк) [3, 12].
Реакции проводили при постоянном перемешивании в термошейкере TS-100 ("BioSan", Латвия). Измерение оптической плотности растворов проводили на спектрофотометре Hitachi 200-20 (Hitachi, Япония).
Опыты проводили в трех повторностях. Приведенные результаты представляют собой средние значения, ошибка которых не превышала 5—7%. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы MS Excel 2010.
Результаты и их обсуждение
Поверхностное культивирование Beauveria bassiana 2, Tolypocladium inflatum k1, Aspergillus ustus 1 и Purpureocillum lilacinum k1 на чашках Петри с белковыми субстратами — казеинатом натрия, желатином, фибрином и эластином — позволило провести оценку действия секретируемых протеиназ на глобулярные и фибриллярные белки. Гидролиз казеината натрия в составе среды показывает общий протеолитический потенциал микромицетов, а фибриллярных белков — специфичность секрети-руемых ими протеиназ. Величину протеолитического потенциала использованных штаммов рассчитывали по величине EI на средах с казеином (Е1Каз), желатином (Е1Жел), фибрином (Ефиб) и эластином (ЕЭл).
В таблице представлены EI для каждого штамма микромицетов, а также отношения их величин друг к другу.
Как видно из таблицы, наибольшее значение EI было показано для микромицета A. ustus 1 на среде с желатином и составило 1,96. Проявление зон гидролиза данного субстрата соответствует колла-генолитической активности образуемого A. ustus 1 комплекса протеиназ, выявленной ранее [11]. Од-
Таблица
Энзиматические индексы микромицетов при росте на средах с различными белковыми субстратами
Микромицет На среде с казеином (EW На среде с желатином (EW На среде с фибрином (EW На среде с эластином (^Эл) ЫКаз / ЫЖел МКаз / МФиб ^Каз / ^Эл
Tolypocladium inflatum k1 1,75 1,64 1,25 1,56 1,07 1,40 1,13
Beauveria bassiana 2 1,73 1,60 1,17 1,67 1,08 1,48 1,04
Aspergillus ustus 1 1,63 1,96 1,16 1,13 0,83 1,41 1,44
Purpureocillum lilacinum k1 1,10 1,29 1,09 1,11 0,85 1,01 0,99
Рис. 1. Общая протеолитическая (А) и коллагенолитическая (Б) активность микромицетов Beauveria bassiana 2, Tolypocladium
inflatum k1 и Aspergillus ustus 1
нако в случае с другими фибриллярными белками протеиназы, секретируемые Л. ustus 1, не проявляют столь высокой активности. Значения Е1 при росте микромицетов на средах с фибрином и эластином составили 1,16 и 1,13, соответственно. Для оценки эффективности действия протеиназ продуцентов на фибриллярные белки важным является соотношение целевой (специфической) и неспецефической активности [11, 13, 14], которую можно представить в виде соотношений Е1, полученных при росте микромицетов на среде с казеинатом натрия и на средах с каждым из изученных фибриллярных белков. Для Л. ustus 1 значение Е1Каз/Е1Жел оказалось небольшим (0,83). Это указывает на высокий уровень секреции ферментов, расщепляющих преимущественно фибриллярные, а не глобулярные белки.
Значения Е1 для микромицетов Т. т/1аШш к1 и В. bassiana 2 оказались достаточно близкими и составили 1,75 и 1,73 для среды с казеинатом натрия, 1,64 и 1,60 для среды с желатином, 1,25 и 1,17 для среды с фибрином, 1,56 и 1,67 для среды с эластином, соответственно. Помимо достаточно высоких значений Е1, полученных на среде с желатином, микромицеты Т. т/1аШш к1 и В. bassiana 2 проявляют протеолитическую активность и по отношению к эластину. Значения, полученные для Р. ИШатт к1, были достаточно низкими, что позволило исключить данный штамм из дальнейшей работы.
Для количественного определения активности протеиназ микромицетов по отношению к фибриллярным белкам в качестве общепринятого субстрата реакции использовали азоколлаген [1, 15], по отношению к глобулярным — казеин [16]. Были изучены коллагенолитическая и общая протеолитическая активность ферментов, образуемыхЛ.ustus 1, В. bas-siana 2 и Т. inflatuш к1 на 5-е сут культивирования в глубинных условиях. Как следует из данных, представленных на рис. 1, А и Б, наиболее высокое
значение коллагенолитической активности показано для Л. ustus 1 (110,6-10-3 ЕАзк/мл). Оно превышало соответствующее значение активности Т. т-flatuш к1 в 1,7 раз, а В. bassiana 2 — почти в 2 раза. Общая протеолитическая активность была выше у протеиназ, образуемых Т. inflatuш к1 (69,2 ЕТир/мл), что оказалось на 18% больше активности В. bas-siana 2 и более чем в 2 раза превысило значение активности протеиназ Л. ustus 1.
Учитывая высокие значения активности протеиназ, образуемых данными штаммами, по отношению к фибриллярным белкам, мы изучили динамику накопления протеолитических ферментов микромицетами Л. ustus 1 и Т. inflatuш к1 (рис. 2, А и Б). Было показано, что коллагенолитическая активность протеиназ, секретируемых Л. ustus 1, достигает максимума на 4-е сут культивирования и составляет 122,6*10—3 ЕАзк/мл; максимальное значение общей протеолитической активности приходилось на 5-е сут и составило 30,5 ЕТир/мл (рис. 2, А). Стоит отметить, что максимальное проявление как общей протеолитической, так и коллагенолитиче-ской активности у Л. ustus 1 наблюдалось только в одной точке, в отличие от активности протеиназ, образуемых Т. inflatuш к1. Для данного микроми-цета было характерно проявление двух пиков общей протеолитической активности, соответствующих 3-м (70,3 ЕТир/мл) и 5-м (64,4 ЕТир/мл) сут, и одного максимума коллагенолитической активности — на 5-е сут, 69,710-3 ЕАзк/мл (рис 2, Б).
Результаты изучения динамики накопления про-теолитических ферментов микромицетами Л ш1иш 1 и Т. inflatuш к1 демонстрируют ряд технологических преимуществ штамма Л. ustus 1. Так, активность протеиназ Л ustus 1, гидролизующих фибриллярные белки, в 1,7 раз выше, чем у Т. inflatuш к1, а максимум накопления изученных протеиназ микроми-цетом Л.ustus 1 в среде наблюдается на сутки раньше,
Рис. 2. Динамика накопления протеолитических ферментов микромицетами Aspergillus ustus 1 (А) и Tolypocladium inflatum k1 (Б). 1 — общая протеолитическая активность, 2 — коллагенолитическая активность
чем у T. inflatum k1. Кроме того, максимумы проявления коллагенолитической и общей протеолити-ческой активности при культивировании у A. ustus 1 разнесены во времени, в отличие от T. inflatum k1, что, предположительно, может упростить процедуру получения активных в отношении фибриллярных белков протеиназ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Wanderley M.C. de A., Neto J.M.W.D, Filho J.L. de L, Lima C. de A., Teixeira J.A.C., Porto A.L.F. Collagenolytic enzymes produced by fungi: a systematic review // Braz. J. Microbiol. 2017. Vol. 48. N 1. P. 13-24.
2. Kotb E. The biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombi // Biotechnol. Prog. 2014. Vol. 30. N 3. P. 656-672.
3. Sharkova T.S., KurakovA.V., Osmolovskiy A.A., Mat-veeva E.O., Kreyer V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. Screening of producers of proteinases with fibrinolytic and colla-genolytic activities among micromycetes // Microbiology. 2015. Vol. 84. N 3. P. 359-364.
4. Rudenskaya G.N. Brachyurins, serine collagenolytic enzymes from crabs // Russ. J. Bioorg. Chem. 2003. Vol. 29. N 2. P. 101-111.
5. Watanabe K. Collagenolytic proteases from bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. Vol. 63. N 5. P. 520-526.
6. Hasan S, Ahmad A., Purwar A., Khan N, Kundan R, Gupta G. Enzymes in the entomopathogenic fungus Verticillium lecanii // Bioinformation. 2013. Vol. 9. N 5. P. 238-242.
7. Yike I. Fungal proteases and their pathophysiological effects // Mycopathologia. 2011. Vol. 171. N 5. P. 299-323.
8. Osmolovskiy A.A., Rukavitsyna E.D., Kreier V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. Production of proteinases with fi-brinolytic and fibrinogenolytic activity by a micromycete Aspergillus ochraceus // Microbiology. 2017. Vol. 86. N 4. P. 512-516.
9. Gupta P., Samant K. Sahu A. Isolation of cellulose-degrading bacteria and determination of their cellullytic potential // Int. J. Microbiol. 2012. Vol. 22. Article ID 578925.
10. Behera B.C., Parida S, Dutta S.K., Thatoi N.H. Isolation and identification of cellulose degrading bacteria from angrove soil of Mahanadi river delta and their cellulose pro-
Таким образом, среди изученных штаммов микромицетов был отобран наиболее перспективный продуцент протеолитических ферментов, высокоактивных по отношению к фибриллярным белкам — A ustus 1, секретирующий коллагенолитические про-теиназы с высокой активностью (122,6*10—3 Е^/мл) на 4-е сут культивирования.
duction ability // Am. J. Microbiol. Res. 2014. Vol. 2. N 1. P. 41—46.
11. Osmolovskiy A.A., Popova E.A., Kreyer V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. Fibrinolytic and collagenolytic activity of extracellular proteinases of the strains of micromycetes Aspergillus ochraceus L-1 and Aspergillus ustus 1 // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016. Vol. 71. N 1. P. 62—66.
12. Chavira R. Jr., Burnett T.J., Hageman J.N. Assaying proteinase with Azocoll // Anal. Biochem. 1984. Vol. 136. N 2. P. 446—450.
13. El-Aassar S.A., El-Badry H.M., Abdel-Fattah A.F. The biosynthesis of proteases with fibrinolytic activity in immobilized cultures of Penicillium chrysogenum H9 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. Vol. 33. N 1. P. 26—30.
14. Osmolovskiy A.A., Kurakov A.V., Kreyer V.G., Baranova N.A., Egorov N.S. Ability of extracellular proteinases of micromycetes Aspergillus flavipes, Aspergillus fumigatus, and Aspergillus sydowii to affect proteins of the human haemostatic system // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2017. Vol. 72. N 1. P. 20—24.
15. Lima C.A., Viana Marques D.A., Neto B.B., Lima Filho J.L., Carneiro-da-Cunha M.G., Porto A.L.F. Fermentation medium for collagenase production by Penicillium aurantiogri-seum URM4622 // Biotechnol. Prog. 2011. Vol. 27. N 5. P. 1470—1477.
16. Егоров Н.С., Ландау Н.С., Буяк Л.И., Крейер В.Г. Гидролитическая система нокардиоформной бактерии Nocardia minima в процессе ее роста, развития и дифференциации // Микробиология. 1991. Т. 60. № 4. С. 637—643.
Поступила в редакцию 27.07.2017 г.
Принята к печати 09.09.2017 г.
MICROBIOLOGY
SECRETION OF EXTRACELLULAR PROTEINASES, ACTIVE AGAINST FIBRILLARY PROTEINS, BY MICROMYCETES
E.A. Popova1, D.M. Bednenko1, A.A. Osmolovskiy1*, V.G. Kreyer1, I.B. Kotova1, N.S. Egorov2
Department of Microbiology and 2International Biotechnology Center, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye Gory 1—12, Moscow, 119234, Russia *e-mail: aosmol@mail.ru
Micromycetes Aspergillus ustus 1 and Tolypocladium inflatum k1 were shown to produce proteolytic enzymes with high collagenolytic, fibrinolytic and elastolytic activity. The activity of the proteinases against fibrillar proteins was determined by the cleavage of azocollagen: collagenolytic activity was 122.6*10-3 EAzc/ml (EAzc — the amount of azocollagen cleaved in 1 min in micrograms) for proteinases produced by A. ustus 1 and 69.7*10-3 EAzc/ml for proteinases produced by T. inflatum k1. The maximum activity values were observed at submerged cultivation of A. ustus 1 during 4 days, and T. inflatum k1 during 5 days. It has been shown that the maximum of collagenolytic and general proteolytic activity during the cultivation of A. ustus 1 are time-separated, unlike T. inflatum k1. This fact, presumably, can simplify the procedure for obtaining of active proteinases.
Keywords: proteinases of micromycetes, proteolytic activity, fibrinolytic enzymes collagenolytic enzymes, elastolytic enzymes, enzymatic index
Сведения об авторах
Попова Елизавета Андреевна — науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: veliana@gmail.com
Бедненко Дарья Михайловна — магистрант кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: bi17bi03da@mail.ru
Осмоловский Александр Андреевич — канд. биол. наук, ст. преп. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: aosmol@mail.ru
Крейер Валериана Георгиевна — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: vkreyer@yandex.ru
Котова Ирина Борисовна — докт. биол. наук, проф. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-27-72; e-mail: kira1959@gmail.com
Егоров Николай Сергеевич — докт. биол. наук, проф. Международного биотехнологического центра МГУ. Тел.: 8-495-939-30-33; e-mail: nsegorov21@mail.ru
