CC BY
29«C©yL©qyiym=J©yrMaL»#3î27),2©19 / BIOLOGICAL SCIIEMOIS
13
Rice. 2-Spectrum obtained by INCA ENERGY -250 x-ray microanalysis system[5].
The system of x-ray spectral microanalysis allows to determine the content of chemical elements in the sample to obtain a spectrum, diagrams and tables of results.
The peaks of the spectrum correspond to the Ka and La main lines of the chemical element. So, for example the chemical element Calcium has two lines: the Ka is equal to 3.49 and the line La is equal to 0,34; Magnesium has a line Ka equal 1,2536; Phosphorus has a line Ka equal 2,0134; Sulfur is line Ka equal 2,3075; Silicon has a line Ka equal 1,7398 [6,c.217]
As a result of the obtained data of the x-ray microanalysis system on the spectrum it is seen that the main element of the eggshell is calcium.
Thus eichna shell is the main source of biocalcium fully digested by the human body.
Eggshell has its beneficial effect on all stages of the life cycle of the human body, from the formation of the embryo to the achievement of advanced years.
Bibliography:
1. Gouldstein J., Yakovitsa H. Practical scanning electron microscopy. Per. from English by ed. Petrova V.I. - M .: Mir, 1978. S - 658.
2. Kozlov V.V. Oxford Instruments electron probe microanalysis systems: new detectors. Oxford Instruments NanoAnalysis Ltd. Oxford Instruments, 2008. S- 324.
3. Raster electronic myrkoskop. JSM-6390, JSM-6390 LV, JSM-6390 A, JSM-6390 LA scanning electron microscope. Instructions. - Tokyo: Jeol Ltd, 2008.S - 286.
4. B.K.Kudelin. Chromatogram on a dated egg. Chemistry and Life №11, 1981. S. 18-25.
5. http://www.nnre.ru/zdorove/kalcii_iony_ zdorovja/p4.php The chemical composition of the eggshell.
6. Alekseev F.F. Industrial poultry farming. - M .: Agropromizdat 1991. S - 544.
УДК: 579.61:577.15
Никитина З.К., Гордонова И.К.
ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР),
Москва
DOI: 10.24411/2520-6990-2019-10006 ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ ASPERGILLUS REPENS
Nikitina Z.K., Gordonova I.K.
All-Russian research Institute of medicinal and aromatic plants,
Moscow
THE PROTEOLYTIC ACTIVITY OF ASPERGILLUS REPENS VARIOUS STRAINS
Аннотация
Целью работы являлось сравнительное исследование протеолитических свойств некоторых дей-теромицетов при росте на различных субстратах для отбора продуцентов протеиназ. Найдено, что все изученные штаммы дейтеромицетов являются деструкторами белков кожи. Только два штамма A. repens росли на модифицированных субстратах, что может указывать на их высокий протеолитиче-ский потенциал. Культивирование в глубинных условиях подтвердило, что эти микромицеты секрети-руют как кератинолитические, так и коллагенолитические ферменты.
14_BIOLOGICAL SCIENCES / «Ш11©адУМ-ШУГМА1>>#3ШЗ,2Ш9
Abstract
The aim of the present work was the comparative estimation of proteolytic properties of some deuteromy-cetes when they were growthing on different substrates for selection of proteinases promising producers. It was found that all the studied strains of deuteromyces were destructors of skin proteins. Only two strains of A. repens had the ability to grow on modified substrates, which could indicate to their high proteolytic potential. Cultivation in deep conditions confirmed that these micromycetes secrete as keratinolytic and collagenolytic enzymes.
Ключевые слова: дейтеромицеты, протеиназа, коллагеназа, кератиназа, поверхностное и глубинное культивирование
Key words: deuteromyces, proteinase, collagenase, keratinase, surface and deep cultivation
Способность микроорганизмов разрушать различные вещества широко используются в настоящее время в биотехнологии для удаления пестицидов [1], нефтяных загрязнений [2], переработке отходов различных производств, в том числе белоксодержащих [3 - 5]. Микроорганизмы-деструкторы, воздействуя на различные объекты, вызывают повреждения последних, изменяя их структурные и функциональные характеристики [6]. Поиск биодеструкторов и изучение особенностей их воздействия на различные объекты позволяет с одной стороны, оценить биодеградирующий потенциал микроорганизмов, а с другой - выбрать штаммы, перспективные в дальнейшем для получения различных гидролитических ферментов. Целью настоящей работы являлась сравнительная оценка протеолитических свойств некоторых дей-теромицетов при росте на различных белоксодер-жащих субстратах.
В работе использовались дейтеромицеты из коллекции ФГБНУ ВИЛАР: Aspergillus flavus F 52, A.repens F 5, 6, 7, 31, Penicillium citrinum F 54. Для указанных штаммов A. flavus и P. citrinum ранее была показана способность к синтезу протеолити-ческих ферментов с различной субстратной специфичностью [7, 8]. Культуры дейтеромицетов выращивали на скошенной поверхности агаризо-ванной среды Чапека в течение 7-ми суток в термостате при 260С. Для оценки биодеструктивной способности штаммов использовали чашечный скрининг-метод с определением зон лизиса, индекса лизиса [10], а также размера колоний и скорости роста культур.
В качестве белковых субстратов использовали образцы нативной и модифицированной кожи из хвостов белых беспородных крыс-самок (120150 г). Модифицированную кожу получали ранее описанным способом [10, 11]. Образцы ткани тщательно измельчали, промывали водой, обезжиривали смесью хлороформ - метанол (1:1), высуши-
вали на лиофильной сушке «Edwards» до постоянного веса и измельчали в блендере.
Для проведения поверхностного культивирования использовали агаризованные среды, содержащие солевой фон среды Чапека с полной заменой сахарозы на 2% соответствующего белкового субстрата. Культивирование в глубинных условиях осуществляли в колбах объемом 300 мл с 100 мл питательной среды на качалке при скорости вращения 220 об/мин при 260С. Посевным материалом служила суспензия спор семисуточных культур дейтеромицета. Количество посевного материала составляло 2,6-3,6x108 спор на 100 мл среды. Культивирование осуществляли на модифицированной среде Чапека с частичной заменой сахарозы на белковый субстрат из нативной кожи (0,5% сахарозы и 1,5% белка). Протеолитическую активность определяли, как это описано ранее, используя в качестве субстратов коллаген или жидкий кератин [8].
Полученные результаты (Таблица 1) свидетельствуют о том, что все исследованные культуры росли на среде с белками нативной кожи и образовывали заметные зоны лизиса. Наибольшие диаметры колоний на начальных этапах культивирования отмечались у A. flavus и A. repens F 7, однако к седьмым суткам рост культур практически останавливался. Все вновь изучаемые штаммы (A. repens F 5, 6, 7, 31) более активно росли на начальных этапах культивирования на средах, содержащих белки нативной кожи. Однако при сравнении максимальных диаметров колоний этих дейтеромицетов с тем же показателем у P. citrinum, продуцента протеолитических ферментов [8], не выявлено существенных различий между ними. Поэтому на основании только данных о росте культур на указанном субстрате осуществить выбор потенциального продуцента протеаз не представлялось возможным.
«C©yL©qyiym=J©yrMaL»#3i27),2©19 / BIOLOGICAL SOEMCIS
15
Таблица 1
Параметры роста культур микромицетов при поверхностном культивировании на средах, со-
1 Й Время культивирования, сутки
л ч л е- 4 5 6 7 11
S? а £ б £ Dk, мм D^ мм dk, мм D^ мм Dk, мм D^ мм Dk, мм D^ мм Dk, мм D^ мм
F 52 кн 19,5 20,8 24,3 27,2 28,3 33,8 29,3 36,5 29,2 35,7
км - - - - - - - - - -
F 5 кн 15,0 21,3 21,0 24,5 25,0 27.0 26,7 31,3 31,3 33,3
км - - - - 1,5 - 4,3 - 18,8 21,7
F 6 кн 11,2 19.1 16,8 21,3 21,3 26,8 23,8 32,5 33,8 46,1
км - - - - 2,0 - 2,5 - 11,5 12,5
F 7 кн 18,8 22,5 24,5 26,5 26,3 29,2 26,5 29,8 28,7 30,8
км - - - - - - - - - -
F 31 кн 14,1 - 21,7 23,0 25,3 30,9 27,7 32,5 31,7 36,7
км - - - - - - - - - -
F 54 кн 6,5 - 10,0 12,2 14,5 17,1 17,5 22,0 28,0 31,5
км - - 2,8 - 6,4 9,3 7,4 11,2 16,0 20,3
Примечание. Dк - диаметр колоний; Dл - диаметр зон лизиса; кн - кожа нативная; км - кожа модифицированная
Ранее нами было предложено [9, 10] в качестве дополнительного критерия при отборе перспективных продуцентов протеаз использовать модифицированные формальдегидом белковые субстраты, обладающие повышенной устойчивостью к протеолизу. Можно видеть (Таблица 1), что на среде с белками модифицированной кожи рост культур отмечался только у P. citrinum, продуцента протеаз, и у двух штаммов A. repens F 5 и F 6. Эти же штаммы к концу культивирования образовывали зоны лизиса.
Анализ индексов лизиса, полученных для исследованных микромицетов при росте на среде с нативной кожей, показал (Таблица 2), что у штаммов A. repens F5 и F 6 максимальные индексы лизиса превышали аналогичные показатели у других культур. При этом максимальный индекс лизиса у A. repens F 6 в 1,44 раза превышал этот показатель у штамма F 5. При росте на среде с модифицированной кожей индексы лизиса у A. repens F 5 и F 6 были несколько ниже, чем у P. citrinum.
Таблица 2
Индексы лизиса исследованных культур на различных средах
№ штамма Субстрат Время культивирования, сутки
4 5 6 7 11
F 52 кн 1,14 1,25 1,43 1,55 1,50
км - - - - -
F 5 кн 2,02 1,36 1,17 1,37 1,13
км - - - 1,0 1,33
F 6 кн 2,91 1,61 1,58 1,87 1,86
км - - 1,0 1,0 1,18
F 7 кн 1,43 1,17 1,23 1,31 1,15
км - - - - -
F 31 кн 1,0 1,12 1,49 1,38 1,34
км - - - - -
F 54 кн 1,0 1,49 1,39 1,58 1,27
км - 1,0 2,11 2,29 1,61
Примечание. кн - кожа нативная; км - кожа модифицированная.
С целью дополнительной оценки протеоли-тической активности изучаемых штаммов A. repens проводилось глубинное культивирование этих микромицетов и культуры сравнения - P. cit-rinum. В качестве индукторов синтеза ферментов использовали препараты нативной кожи, в состав которой входят коллаген и кератин, способные индуцировать синтез протеиназ с соответствую-
щей субстратной специфичностью. Можно видеть (Таблица 3), что A. repens F 5 и F 6 секретировали в культуральную жидкость протеиназы с керати-нолитической активностью меньшей, чем у P. а^ rinum. При этом коллагенолитическая активность обоих штаммов была выше, чем у пеницилла в 1,6 и 1,5 раз для F 5 и F 6 соответственно.
16 BIOLOGICAL SCIENCES / «C©LL©qUOUM~J0U®MAL»#M27)),2©]]9
Таблица 3
Максимальная протеолитическая активность культуральной жидкости микромицетов,
мкМ/(мгхч)
№ Коллагенолитическая актив- Кератинолитическая актив- Суммарная ак-
штамма ность ность тивность
F 5 7,93±0,67 11,91±1,12 19,84
F 6 7,59±0,69 9,64±0,91 17,23
F 7 1,71±0,17 1,00±0,10 2,71
F 31 6,71±0,47 2,32±0,25 9,03
F 54 4,96±0,49 20,90±1,81 25,86
Коллагенолитическая активность A. repens F 7 была значительно ниже, чем у P. citrinum и составляла только 34,5%, а кератинолитическая активность - лишь 4,8%. Более высокая протеолитическая активность культуральной жидкости обнаруживалась у другого штамма - F 31. Коллагенолитическая активность у этого гриба была на 26,1% выше, чем у P. citrinum. В то же время кератинолитическая активность оставалась на низком уровне и составляла 11,1% от аналогичного значения для пеницилла. Суммарная протео-литическая активность культур уменьшалась в ряду P. citrinum > A. repens F 5 > A. repens F 6> A. repens F 31> A. repens F 7.
Таким образом, из четырех вновь изученных штаммов микромицетов перспективными продуцентами протеиназ являются 2 штамма A. repens. Кроме того, показано, что результаты скрининго-вых исследований с использованием субстратов с повышенной устойчивостью к протеазам являются дополнительным критерием при выборе потенциальных продуцентов указанных ферментов.
Список литературы
1. Широких A.A., Колупаев A.B. Грибы в биомониторинге наземных экосистем / Теоретическая и прикладная экология. - 2009. - № 3. - С. 414.
2. Сидоренко О.Д., Лубников С.И., Павликова Т.А. // Патент России № 2264357, 20.04.2005.
3. Onifade A.A., Al-Sane N.A., Al-Mussallam A.A. A review: potentials for biotechnological application of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources // Biore-source Technol. - 1998. - V. - 66. P. 1-11.
4. Касаткина, А.,Н. Использование мультиэн-зимных композиций для деструкции пивной дробины // Биотехнология. - 2008. - № 2. - С. 59-65.
5. Башишкина Е.В., Панфилов В.И., Шакир И.В. и др. // Патент России № 2393719. 10.07.2010. Бюл. № 19. 5с.
6. Семенов С.А., Гумаргалиева К.З., Заиков Г.Е. Биоповреждения материалов и изделий техники / Горение, деструкция и стабилизация полимеров, под ред. Заикова Г.Е. - М: Научные основы и технологии. 2008. 422с.
7. Никитина З.К., Сухосырова Е.А.. Яковлева М.Б, Вещикова Е.В, Быков В.А.. Выделение, очистка и некоторые свойства коллагенолитиче-ских ферментов, секретируемых Aspergillus flavus //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической хими. - 2008. - № 2. - С.46-49.
8. Никитина З.К., Гордонова И.К. Выделение, очистка и биохимические свойства кератинолити-ческого фермента, секретируемого Penicillium citrinum // Вопросы биол., медиц. и фармацевтич. химии. - 2013. - № 9. - С.36-41.
9. Яковлева М.Б., Зон Х.Ч., Никитина З.К., Быков В.А. Рост и синтез внеклеточных ферментов некоторыми видами дейтеромицетов на натив-ных и модифицированных белковых субстратах // Вопросы биол., медиц. и фармацевтич. химии. -2009. - №1. - С. 6-10.
10. Гордонова И.К., Никитина З.К., Зон Х.Ч., Томашевич С.В., Быков В.А. Изучение протеоли-тических свойств дейтеромицетов при росте на модифицированных и немодифицированных кера-тинсодержащих субстратах. // Вопросы биол., ме-диц. и фармацевтич. химии. - 2009. - №1. - С. 1924.
