CC BY
24
ISSN 2412-608Х. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (173), 2018
Защита растений и иммунология
УДК 633.854.78:632.444.2:632.953.1 DOI 10.25230/2412-608X-2018-1-173-82-86
ЭЛЕМЕНТЫ ЛАБОРАТОРНОГО РЕГЛАМЕНТА ПРОИЗВОДСТВА МИКРОБИОПРЕПАРАТОВ В ПРЕПАРАТИВНОЙ ФОРМЕ «СМАЧИВАЮЩИЙСЯ ПОРОШОК» НА ОСНОВЕ ГРИБОВ-АНТАГОНИСТОВ ИЗ РОДА TRICHODERMA ПРИ ПОВЕРХНОСТНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА ЖИДКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
Л.В. Маслиенко,
доктор биологических наук
А.Х. Воронкова,
младший научный сотрудник Е.Ю. Шипиевская,
кандидат биологических наук
ФГБНУ ВНИИМК
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17 Тел.: (861) 275-85-19 E-mail: biometod@vniimk.ru
Для цитирования: Маслиенко Л.В., Воронкова А.Х., Шипиевская Е.Ю. Элементы лабораторного регламента производства микробиопрепаратов в препаративной форме «смачивающийся порошок» на основе грибов-антагонистов из рода Trichoderma при поверхностном культивировании на жидких питательных средах // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. - 2018. - Вып. 1 (173). - С. 82-86.
Ключевые слова: микробиопрепараты, штамм-продуцент, Т-2 Trichoderma sp., препаративная форма, поверхностное культивирование, смачивающийся порошок.
Разработаны элементы лабораторного регламента производства микробиопрепаратов в препаративной форме «смачивающийся порошок» (СП) при поверхностном культивировании на жидких питательных средах перспективного грибного штамма-продуцента Т-2 Trichoderma sp. из коллекции лаборатории биометода. Определён оптимальный срок поверхностного культивирования на жидкой питательной среде Рудакова - десять
суток. Оптимальный объём посевной культуры по отношению к объёму питательной среды составил 2,0 %. Опытные образцы микробиопрепарата в препаративной форме СП, полученные при поверхностном культивировании штамма Т-2 Trichoderma sp. на жидкой питательной среде, образовывали в воде стойкую суспензию и имели исходный титр 109-10 КОЕ/г и влажность 5,4-6,5 %. При хранении опытных образцов СП микробиопрепарата в пакетах с доступом воздуха и в банках с притёртой крышкой в условиях постоянной низкой температуры (-18 °С) титр в течение 12 месяцев не снизился. При переменной температуре (+24...+26 °С) через шесть месяцев титр опытного образца СП микробиопрепарата снизился на один порядок как в банке, так и в пакете и сохранялся таким 12 месяцев (1,2-6,0 х 108 КОЕ). При постоянной высокой температуре (+30 °С) титр в течение двенадцати месяцев снизился на четыре порядка - до 105 КОЕ/г. Для сохранения опытных образцов СП микробиопрепарата на основе гриба Т-2 Trichoderma sp. с незначительным снижением титра (с 109 до 108 КОЕ/г) в течение двенадцати месяцев при переменной температуре добавление стабилизаторов нецелесообразно.
UDC 633.854.78:632.444.2:632.953.1
Elements of the laboratory regimen for production of microbiopreparation in form of 'wettable powder' based on fungus-antagonists of a genus Pseudomonas on surface cultivation on liquid nutrient medium.
Maslienko L.V., doctor of biology Voronkova А.ХИ., junior researcher E.Yu. Shipievskaya, PhD in biology
All-Russia Research Institute of Oil Crops 17, Filatova str., Krasnodar, Russia 350038 Те1: (861) 275-85-19 E-mail: biometod@yandex.ru
Key words: microbiopreparations, strain-producer, Т-2 Trichoderma sp., preparation form, surface cultivation, wettable powder.
There were developed the elements of the laboratory regimen for production of microbiopreparation in the form of 'wettable powder' on surface cultivation on liquid nutrient mediums of perspective fungus strain-producer Т-2 Trichoderma sp. from a collection of the laboratory of biomethods. Period of 10 days was determined as optimal for surface cultivation on a liquid nutrient medium of Rudakova. Optimal ratio between volumes of culture and nutrient medium was 2.0%. Test samples of microbiopreparation in the form of 'wettable powder' obtained on surface cultivation of the strain Т-2 Trichoderma sp. on a liquid
nutrient medium formed a stable suspension in water and had an initial titer 109-10 CFU/g and a moisture content of 5.4-6.5 %. When storing a 'wettable powder' microbiopreparation in packages with air access and in jars with a tightly closed lid, regardless of the method of biomass separation, under conditions of permanent low temperature (-18 °С), the titer have not decreased within twelve months. When storing under variable temperature (+24...+26 °С), after six months the titer of a test sample of a 'wettable powder' microbiopreparation decreased by one order of magnitude both in a jar, and in a package and remained the same for twelve months (1.2 x 108 CFU). Under permanent high temperature (+30 °С) the titer decreased by four orders of magnitude to 105 CFU/g in twelve months. It is not reasonable to add antiaging agents to keep test samples of microbiopreparation in the form of 'wettable powder' based on a fungus Т-2 Trichoderma sp. with insignificant decrease of the titer (from 109 to 108 CFU/g) during twelve months under variable temperature.
Введение. В лаборатории биометода ФГБНУ ВНИИМК многие годы ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных и других сельскохозяйственных культур от болезней. Создана уникальная коллекция штаммов грибов и бактерий-продуцентов микробиопрепаратов - биофунгицидов. Разрабатываются технологии производства разных препаративных форм микробиопрепаратов и технологии их применения [1].
Ранее в лаборатории биометода были разработаны препаративные формы микробиопрепаратов: жидкая культура, паста и порошок на основе твёрдых носителей -питательных сред (семянки, лузга, отходы от очистки семян подсолнечника) и перлита. Но жидкие культуры и пасты, особенно на основе грибных штаммов-продуцентов, выдерживали хранение не более 10 суток и 3-х месяцев соответственно, даже в холодильнике, а порошки плохо смачивались в воде и забивали отверстия распылителей [2].
Поэтому в последние годы нами решается задача по увеличению срока хранения биопрепаратов без снижения титра в препаративной форме «смачивающийся порошок» (СП) при поверхностном вы-
ращивании штаммов-продуцентов на жидкой питательной среде и конвекционной сушке током воздуха. Ранее нами проведены исследования по отработке элементов лабораторного регламента производства микробиопрепаратов в препаративной форме СП при поверхностном культивировании на жидких питательных средах перспективных грибных штаммов-продуцентов из рода Pénicillium и бактерий из рода Bacillus [3; 4].
В данной работе приведены результаты исследований по разработке элементов лабораторного регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме СП при поверхностном культивировании перспективного грибного штамма-продуцента Т-2 Trichoderma sp. из коллекции лаборатории биометода на жидкой питательной среде. Решены задачи:
- по установлению оптимальных сроков поверхностного культивирования штамма-продуцента на жидких питательных средах и объёма посевной суспензии для максимального образования биомассы;
- по определению сроков хранения опытных образцов микробиопрепаратов в препаративной форме СП на основе штамма-продуцента в зависимости от упаковки, температуры и стабилизаторов без значительного снижения титра.
Материалы и методы. Для установления оптимальных сроков поверхностного культивирования штамм-продуцент выращивали на жидкой питательной среде Рудакова [5] в течение 10, 15 и 20 суток. Определяли массу порошка и титр. Для определения оптимального объёма посевной культуры к 500 мл питательной среды добавляли 2 и 4 % глубинной культуры антагониста, которую предварительно выращивали на жидкой среде, на качалке (195 об./мин) в течение трех суток. Сроки хранения опытных образцов в препаративной форме СП определяли в зависимости от упаковки, температуры и стабилизаторов. Штамм-продуцент выращивали поверхностным способом на жидкой питательной среде при оптимальной температуре 25 °С. Выращенную мицели-
альную плёнку гриба отделяли сливом культуральной жидкости. Затем к биомассе добавляли прибипаьель (3 %), рас-текатьль (0,5 %) и наполнитель (20 %). Всё перемешивали, высушивали под вытяжкой при температуье 25-28 °С и размалывали на мальннце с охлаждением. Определяли влажность сырой биомассы б СП методом высушибания до постоянного сеса [6]. Опысныге образцы хранили а бааках с плотно закрыггой крышкой объемом 100 мл и бумажных пакетах с доступом воздуха (при этом обе упаковки заполняли СП на 30 % ос объема) при постоянных (+30 и -181 °С) и переменной (+24... +26 °С) темперетурах. При переменной температуре испытывали стаби-лизаторые резорции (0,1 %), тиомоче-вину (0,05 %), аскосбиновую кислоту (0,055 %), бензоат натрия (0,1 %), сульфат меди (0,05 %), гумат натрия (0,5 %), мелаиьу (0,3 %), уголи активированный (5,5 %), двуокись титана (1,0 %) и гента-мицин Н5,515 %). Через 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения микробиопрепарать определяли титр) микробиологическим способом [7].
Результаты и обсуждение. Опытные образцы микробиопрепарата в препаративной форме СП, пооученаые при поверхностном культивибисаниб штамма Т-2 Trichoderma sp. на жидкой питательной среие Рудакова, обрезовывали в воде стойкую суспензию, имели исходный титр 109-10 КОЕ/г.
Установлен оптимальный срок поверхностного культивирования грибного штамма-продуцента микробиопрепарать Т-2 Trichodermm sp. на жидкой питательной среде; (табл. 1 ).
Установлено, что пеи всех сроках поверхностного культивирования грибного штамма-продуцента на жидкой питательной среде;, из опытнасх образцов сырой биомассы, получена примерно одинаковая масса СП, с влажностью 5,4-6,5 %. С увьсичением срока пессрхностного культивирования гриба с 10 до 15 и 20 сутот вес СП увеличивался незначительно и составил соответственно 10,С)6; 12,18 б 12,877 г на 500 мл питательной среды.
Таблица 1
Влияние срока поверхностного культивирования и объёма посевной суспензии грибного штамма-продуцента Т-2 Trichoderma sp. намассо опытного образца микробиппрепарата в препаративной форме «смачивающийся порошок» и титр
г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.
Вь еб-ьнт Объ ёп ес-спв-нсй суспензии, % Сеок тьиьтбBбиовaнбя, еуттб
10 15 20
Мьесь СП, г ТиГР, КОЕ/г Мьсас СП, г Тбир, КОЕ/г Мьссь СП, г Тигр, КОЕ/г
Т-2 2,0 10,06 ± 0,08 1,8 х 1010 12,18 ±0,03 4,5 х 1010 02,79 ±0,03 6,5 х 1010
4,5 10,3 ±3,310 2,9 х 1010 11,51 ±3,30 4,9 х 10м 02,87 ±0,55 7,9 7 Ю10
Примечание: * СП - микробиопрепьрат в пре-еаиативной форме «смачивающийся поро-шс>т»
Увеличение объёма посевной культуры к питательной сред е с 2 до 4 % значительно не повышало выхода СП, который составил 10,06 и 10,30 г; 12,18 и 11,51 г; 12,79) и 12,87 г ллответственно через 10, 15 и 20 суток ьультивирования. Титр опытных образцов СП микробиопрепарата не зависел от слоков культивирования штамма-продуцента и был одного порядка во всех вариентах выращивания (1,87,9 х 1010 КОЕ/г).
Таким образом, оптимальный срок по-весхностного культивирования грибного штамма Т-2 ТпсСоОвгта яр. на жидкой питательной среде Рудакова составил 10 суток, а оптимлльыый объём повнвной культуры - 2% .
Установлены сркки хранения опытных образцов микробиопрепарата на основе грибного штамма-продуцента микробиопрепарата Т-2 ТпсСоОвгта яр. в препаративной форме СП в зависимоати от герметичности упаковки и темперьсуры хранения (табл . 2).
Изначальный титр опытного образца СП микробиопропарата бли 6,4 х 109 КОЕ/г. При хранении СП микробиопрепаратв в пакетах с доступом воздуха и банках с плотно закрытой ррышкой при поотоян-ной низкой темпраатур е 1-18 °С) в тече-
ние двенадцати месяцев титр сохранялся одного порядка с первоначальным уровнем (3,2-3,9 х 109 КОЕ/г). При переменной температуре (+24...+26 °С) через шесть месяцев титр СП снизился на один порядок как в банке, так и в пакете и сохранялся таким двенадцать месяцев (1,26,0 х 108 КОЕ).
Таблица 2
Влияние температуры и упаковки на титр опытных образцов микробиопрепарата в препаративной форме «смачивающийся порошок» на основе грибного штамма-продуцента Т-2 ТпсНвйегта sp. в процессе хранения
г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.
При постоянной высокой температуре (+30 °С) титр СП микробиопрепарата на основе гриба-антагониста в течение двенадцати месяцев снизился до 105 КОЕ/г.
Таким образом, при хранении опытного образца микробиопрепарата на основе грибного штамма Т-2 Тпекойвтта ¿р. в препаративной форме «смачивающийся порошок» в пакетах с доступом воздуха и банках с плотно закрытой крышкой в условиях постоянно низкой температуры (-18 °С) титр в течение двенадцати месяцев не снизился. При переменной температуре в лаборатории (+24.+26 °С) за двенадцать месяцев хранения СП титр снизился на один порядок как в банке, так и в пакете (108 КОЕ/г). При постоянно высокой температуре (+30 °С) за двенадцать месяцев хранения титр СП снизился на четыре порядка (105 КОЕ/г).
Для установления влияния стабилизаторов на сроки хранения опытных образцов микробиопрепарата на основе грибного штамма-продуцента СП хранили в бумажных пакетах с доступом воз-
духа при переменной температуре в помещении лаборатории от +24 до +26 оС (табл. 3).
Таблица 3
Влияние стабилизаторов на титр опытных образцов микробиопрепарата на основе грибного штамма-продуцента Т-2 ТпсНвйегта sp. в препаративной форме СП при хранении в условиях переменной температуры
г. Краснодар, ВНИИМК, 2017 г.
Вариант Титр, КОЕ/г, через, месяцев
3 6 9 12
Контроль 3,5 х 108 3,1 х 108 2,2 х 108 1,0 х 108
Резорцин 0,1 3,1 х 108 4,5 х 107 3,5 х 107 1,5 х 107
Тиомочевина 0,05 3,5 х 108 1,0 х 107 6,7 х 106 2,7 х 106
Аскорбиновая кислота 0,05 4,2 х 108 1,0 х 108 5,8 х 107 2,9 х 107
Бензоат натрия 0,1 3,3 х 108 2,0 х 107 4,6 х 106 2,6 х 106
Сульфат меди 0,005 4,5 х 108 4,0 х 108 2,9 х 108 1,8 х 108
Гидрохинон 0,1 5,3 х 108 3,0 х 108 2,8 х 108 1,0 х 108
Гумат натрия 0,5 5,5 х 108 1,0 х 108 4,5 х 107 2,5 х 107
Меласса 0,3 3,7 х 108 2,5 х 107 1,8 х 107 1,5 х 107
Двуокись титана 1,0 4,3 х 108 1,5 х 108 3,2 х 107 3,0 х 107
Уголь активированный 0,5 4,6 х 108 3,0108 4,7 х 107 3,5 х 107
Гентамицин 0,015 4,3 х 108 5,5 х 107 2,5 х 107 1,9 х 107
Исходный титр опытного образца СП микробиопрепарата на основе грибного штамма-продуцента Т-2 Тпекойвтта ¿р. в контроле без добавок составил 5,0 х 109 КОЕ/г. При хранении в бумажном пакете в условиях переменной температуры от +24 до +26 °С в течение двенадцати месяцев титр микробиопрепарата снизился незначительно, на один порядок - с 109 до 108 КОЕ/г.
Добавление стабилизаторов не способствовало сохранению титра СП грибного препарата, а наоборот, снижало титр на порядок, а в вариантах с бензоатом натрия и тиомочевиной - на два порядка (106 КОЕ/г). Исключение составили варианты с сульфатом меди и гидрохиноном, в которых титр сохранился на уровне контроля.
Таким образом, установлено, что для сохранения опытных образцов микробиопрепарата на основе гриба Т-2 Тпекойвтта ¿р. с незначительным сниже-
9 8
нием титра (с 10 до 10 КОЕ/г) в течение двенадцати месяцев при переменной тем-
Срок хранения, месяцев Титр, КОЕ/г
+24. +26 °С +30 °С -18 °С
пакет банка пакет банка пакет банка
3 1,5 х 109 1,2 х 109 3,7 х 107 3,3 х 107 5,7 х 109 6,4 х 109
6 3,1 х 108 6,0 х 108 5,0 х 106 4,2 х 106 2,5 х 109 4,7 х 109
9 2,2 х 108 2,8 х 108 2,6 х 105 3,2 х 105 3,1 х 109 4,0 х 109
12 1,2 х 108 1,6 х 108 1,0 х 105 1,2 х 105 3,2 х 109 3,9 х 109
пературе добавление стабилизаторов нецелесообразно.
Выводы. 1. Опытные образцы микробиопрепарата в препаративной форме СП, полученные при поверхностном культивировании штамма Т-2 Trichoderma sp. на жидкой питательной среде Рудакова, образовывали в воде стойкую суспензию, имели исходный титр 109-10 КОЕ/г и влажность 5,4-6,5 %.
2. Оптимальный срок поверхностного культивирования грибного штамма Т-2 Trichoderma sp. на жидкой питательной среде Рудакова составил 10 суток, а оптимальный объём посевной культуры - 2 %.
3. При хранении опытного образца СП микробиопрепарата в пакетах с доступом воздуха и банках с плотно закрытой крышкой при постоянной низкой температуре (-18 °С) в течение двенадцати месяцев титр сохранялся одного порядка с первоначальным уровнем (3,2-3,9 х 109 КОЕ/г).
4. При переменной температуре (+24...+26 °С) через шесть месяцев титр опытного образца СП микробиопрепарата снизился на один порядок как в банке, так и в пакете и сохранялся таким двенадцать месяцев (1,2-6,0 х 108 КОЕ/г).
5. При постоянной высокой температуре (+30 °С) титр опытного образца СП микробиопрепарата на основе гриба-антагониста в течение двенадцати месяцев снизился на четыре порядка - до 105 КОЕ/г.
6. Для сохранения опытных образцов СП микробиопрепарата на основе гриба Т-2 Trichoderma sp. с незначительным
9 8
снижением титра (с 10 до 10 КОЕ/г) в течение двенадцати месяцев при переменной температуре добавление стабилизаторов нецелесообразно.
Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края, грант № 16-48-230293.
Список литературы
1. Маслиенко Л.В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с болезнями подсолнечника: дис. ... докт. биол. наук: защищена 03.06.05, утв. 07.10.05. - Краснодар, 2005. - 377 с.
2. Маслиенко Л.В. Лаборатория биологических средств защиты растений (вчера, сегодня, завтра)
// В кн.: История научных исследований во ВНИ-ИМКе за 90 лет. - Краснодар, 2003. - С. 273-281.
3. Маслиенко Л.В., Воронкова А.Х. Элементы лабораторного регламента производства микробиопрепаратов на основе грибных штаммов-продуцентов в препаративной форме «смачивающийся порошок» // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2016. - Вып. 4 (168). - С. 100-107.
4. Маслиенко Л.В., Воронкова А.Х. Элементы лабораторного регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме «смачивающийся порошок» на основе бактерий антагонистов из рода Bacillus // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - Краснодар, 2017. - Вып. 3 (171). - С. 93-96.
5. Рудаков О.Л. Микофильные грибы, их биология и практическое значение. - М.: Наука, 1981. - 160 с.
6. ГОСТ 5180-2015 Грунты. Методы лабораторного определения физических характеристик. -М.: Стандартинформ, 2016. - 20 с.
7. Егоров Н.С. Выделение микробов-антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1957. - 78 с.
References
1. Maslienko L.V. Obosnovanie i razrabotka mikrobiologicheskogo metoda bor'by s boleznyami podsolnechnika: dis. ... dokt. biol. nauk: zashchishchena 03.06.05, utv. 07.10.05. - Krasnodar, 2005. - 377 s.
2. Maslienko L.V. Laboratoriya biologicheskikh sredstv zashchity rasteniy (vchera, segodnya, zavtra) // V kn.: Istoriya nauchnykh issledovaniy vo VNIIMKe za 90 let. - Krasnodar, 2003. - S. 273281.
3. Maslienko L.V., Voronkova A.Kh. Elementy laboratornogo reglamenta proizvodstva mikrobiopreparatov na osnove gribnykh shtammov-produtsentov v preparativnoy forme «smachivayushchiysya poroshok» // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2016. - Vyp. 4 (168). - S. 100-107.
4. Maslienko L.V., Voronkova A.Kh. Elementy laboratornogo reglamenta proizvodstva mikrobiopreparata v preparativnoy forme «smachivayushchiysya poroshok» na osnove bakteriy antagonistov iz roda Bacillus // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - Krasnodar, 2017. -Vyp. 3 (171). - S. 93-96.
5. Rudakov O.L. Mikofil'nye griby, ikh biologiya i prakticheskoe znachenie. - M.: Nauka, 1981. - 160 s.
6. GOST 5180-2015 Grunty. Metody laboratornogo opredeleniya fizicheskikh kharakteristik. - M.: Standartinform, 2016. - 20 s.
7. Egorov N.S. Vydelenie mikrobov-antagonistov i biologicheskie metody ucheta ikh antibioticheskoy aktivnosti. - M.: Izd-vo Mosk. un-ta, 1957. - 78 s.
