CC BY
45
ISSN 2412-608Х. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 3 (171), 2017
УДК 632.937.15
ЭЛЕМЕНТЫ ЛАБОРАТОРНОГО РЕГЛАМЕНТА ПРОИЗВОДСТВА МИКРОБИОПРЕПАРАТА В ПРЕПАРАТИВНОЙ ФОРМЕ СМАЧИВАЮЩИЙСЯ ПОРОШОК НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ ИЗ РОДА BACILLUS
Л.В. Маслиенко,
доктор биологических наук
А.Х. Воронкова,
младший научный сотрудник
ФГБНУ ВНИИМК
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17 Тел.: (861) 275-85-19 E-mail: [email protected]
Для цитирования: Маслиенко Л.В., Воронкова А.Х. Элементы лабораторного регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок на основе бактерий-антагонистов из рода Bacillus // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. - 2017. - Вып. 3 (171). - С. 93-96.
Ключевые слова: микробиопрепараты, штамм-продуцент D 7-1 Bacillus subtilis, препаративная форма, смачивающийся порошок.
Разработаны элементы лабораторного регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок (СП) при поверхностном культивировании на жидких питательных средах перспективного бактериального штамма-продуцента D 7-1 Bacillus subtilis из коллекции лаборатории биометода. Определён оптимальный срок поверхностного культивирования на жидкой питательной среде Тайлона 3 -15 суток. Оптимальный объём посевной культуры по отношению к объёму питательной среды составил 2,0 %. При всех условиях хранения опытных образцов микробиопрепарата в пакетах и банках, при постоянных (+30 и -18 °С) и переменной (+24 - +26 °С) температурах, в течение двенадцати месяцев титр сохранялся на первоначальном уровне (108 КОЕ/г), за исключением варианта хранения при низкой температуре (-18 °С), где титр незначительно снизился - до 8,0-9,2 х 107 КОЕ/г. Для сохранения опытных об-
разцов микробиопрепарата на основе бактерий из рода Bacillus с исходным титром в течение двенадцати месяцев добавление стабилизаторов нецелесообразно.
UDC 632.937.15
Elements of the laboratory regimen for production of microbiopreparation in form wettable powder based on bacteria-antagonists of a genus Bacillus. Maslienko L.V., doctor of biology Voronkova A.Kh., junior researcher
All-Russia Research Institute of Oil Crops 17, Filatova str., Krasnodar, 350038, Russia Те1: (861) 275-85-19 E-mail: [email protected]
Key words: microbiopreparations, strain-producer D 7-1 Bacillus subtilis, preparation form, wettable powder.
Elements of the laboratory regimen for production of microbiopreparation in form wettable powder at surface cultivation on liquid nutrient mediums of perspective bacteria strain-producer D 7-1 Bacillus subtilis from a collection of the laboratory of biomethods. Period of 15 days was determined as optimal for surface cultivation on a liquid nutrient medium of Taylon 3. Optimal ratio between volumes of culture and nutrient medium was 2.0%. Titer have been keeping at the initial level (108 KFU per g) during 12 months under permanent (+30 and -18 °С) and variable (+24-+26 °С) temperatures, in pockets and jars, in all storage conditions for test samples of microbiopreparation. Only in variant when sample were storing under low temperature (-18 °С), titer lowered insignificantly up to 8.0-9.2 x 107 KFU per/g. To add antiaging agents is not reasonable to keep test samples of microbiopreparation based on a genus Bacillus with initial titer during 12 month.
Введение. В лаборатории биометода ФГБНУ ВНИИМК многие годы ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных и других сельскохозяйственных культур от болезней. Создана уникальная коллекция штаммов грибов и бактерий-продуцентов микробиопрепаратов - биофунгицидов. Разрабатываются технологии производства и применения разных препаративных форм микробиопрепаратов [1].
Ранее нами были разработаны препаративные формы микробиопрепаратов жидкая культура, паста и порошок на основе твёрдых носителей - питательных сред (семянки, лузга, отходы от очистки семян подсолнечника) и перлита. Но жидкие культуры и пасты выдерживали хранение не более 10 дней и 3-х месяцев соответственно, даже в холодильнике, а порошки плохо смачивались в воде и забивали отверстия опрыскивателей [2]. Поэтому в последние годы нами решается задача по увеличению срока хранения биопрепаратов без снижения титра, в форме, образующей в воде однородные суспензии.
В данной работе приведены результаты исследований по разработке элементов лабораторного регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок (СП) при поверхностном культивировании на жидкой питательной среде перспективного бактериального штамма-продуцента D 71 Bacillus subtilis из коллекции лаборатории биометода.
Материалы и методы. Для отработки элементов лабораторного регламента производства микробиопрепарата на основе бактерий из рода Bacillus нарабатывались лабораторные образцы в препаративной форме смачивающийся порошок. Для этого штамм-продуцент D 7-1 Bacillus subtilis выращивали поверхностным способом на жидкой питательной среде Тайлона 3 [3] при оптимальной температуре 28-30 0С, в трёхлитровых стеклянных баллонах, с объёмом питательной среды 500 мл. Выращенную биомассу бактерии отделяли сливом надосадочной жидкости с предварительным охлаждением при температуре + 2 0С. Затем к биомассе добавляли при-липатель, растекатель и наполнитель. Всё перемешивали, высушивали под вытяжкой при температуре 25-28 0С и размалывали на мельнице с охлаждением. Титр порошка определяли микробиологическим способом [4].
Для установления оптимальных сроков поверхностного культивирования бактериальный штамм-продуцент выращивали в течение 10, 15 и 20 суток, с предварительным добавлением двух процентов его глубинной культуры к объёму питательной среды. Определяли вес порошка и титр. Для определения оптимального объёма посевной культуры к 500 мл питательной среды добавляли 2 и 4 % глубинной культуры антагониста. Сроки хранения опытных образцов в препаративной форме СП определяли в зависимости от упаковки, температуры, стабилизаторов и фотопротекторов. Опытные образцы хранили в банках с притертой крышкой и в бумажных пакетах, при постоянных (+30 и -18 0С) и переменной (+24 - +26 0С) температурах.
Испытывали стабилизаторы: резорцин (0,1; 0,2 %), тиомочевину (0,05; 0,1 %), аскорбиновую кислоту (0,05; 0,1 %), бензоат натрия (0,1; 0,5 %), сульфат меди (0,05 %), гумат натрия (0,5; 2,0 %) и гидрохинон (0,1; 0,2 %); фотопротекторы: уголь активированный (0,5; 1,0; 4,0 %) и двуокись титана (1,0; 10,0 %), при переменной температуре +24 -+26 0С. Через 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения микробиопрепарата определяли титр.
Результаты и обсуждение. Установлен оптимальный срок поверхностного культивирования на жидкой питательной среде Тайлона 3 и объём посевной суспензии бактериального штамма-продуцента (табл. 1).
Таблица 1
Влияние срока поверхностного культивирования на жидкой питательной среде и объёма посевной суспензии бактериального штамма-продуцента микробиопрепарата D 7-1 Bacillus subtilis на массу смачивающегося порошка и титр опытных образцов микробиопрепарата
г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.
Объём Срок культивирования, сутки
посев- 10 15 20
ант ной суспензии, % масса СП, г титр, КОЕ/г масса СП, г титр, КОЕ/г масса СП, г титр, КОЕ/г
D 7-1 2,0 12,6 1,1 х 108 27,9 5,9 х 108 27,7 1,9 х 108
4,0 16,08 1,4 х 108 28,5 3,7 х 108 23,6 4,8 х 108
Максимальная масса СП получена через 15 и 20 суток культивирования D 7-1 Bacillus subtilis на жидкой питательной среде; она не зависела от объёма посевной суспензии (2 и 4 %): 27,9-28,5 г и 27,7-23,6 г соответственно против 12,616,8 г с 500 мл питательной среды, при сроке выращивания 10 суток. Титр СП не зависел от сроков культивирования и объёма посевной суспензии штамма-продуцента и был одного порядка во всех вариантах выращивания (1,1-5,9 х 108 КОЕ/г).
Таким образом, оптимальный срок поверхностного культивирования бактериального штамма D 7-1 Bacillus subtilis на жидкой среде Тайлона 3 составил 15 суток, оптимальный объём посевной суспензии - 2,0 % к объёму питательной среды.
Установлены сроки хранения опытных образцов микробиопрепарата на основе бактериального штамма-продуцента микробиопрепарата D 7-1 Bacillus subtilis в препаративной форме СП в зависимости от упаковки и температуры хранения (табл. 2).
Таблица 2
Влияние температуры и упаковки на титр опытных образцов микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок на основе бактериального штамма-продуцента D 7-1 Bacillus subtilis в процессе хранения
Вариант Титр, КОЕ/г
+24 -+26 6С +30 6С -18 6С
пакет банка пакет банка пакет банка
Через 3 месяца 3,3 х 108 3,8 х 108 3,1 х 108 2,4 х 108 1,4 х 108 1,5 х 108
Через 6 месяцев 2,0 х 108 2,1 х 108 2,7 х 108 1,9 х 108 1,1 х 108 1,1 х 108
Через 9 месяцев 1,7 х 108 1,5 х 108 1,4 х 108 1,5 х 108 9,0 х 108 9,2 х 107
Через 12 месяцев 1,0 х 108 3,4 х 108 2,1 х 108 8,2 х 108 2,5 х 108 8,0 х 107
Установлено, что при всех условиях хранения опытных образцов микробиопрепарата в пакетах и банках в течение 12
месяцев титр сохранялся на первоначаль-
о
ном уровне (10 КОЕ/г). Исключением был вариант хранения СП при низкой температуре (-18 оС) в банках, где титр незна-
п
чительно снизился до 8,0-9,2 х 10 КОЕ/г через 9 и 12 месяцев хранения. Особенно следует отметить, что в отличие от микробиопрепаратов на основе грибных штаммов-продуцентов [5] исходный титр сохранялся и в варианте хранения опытного образца при постоянной высокой температуре (+30 оС) и особенно при
о
хранении в банках (8,2 х 10 КОЕ/г).
Определяли влияние стабилизаторов и фотопротекторов на сроки хранения опытных образцов микробиопрепарата на основе бактериального штамма-продуцента D 7-1 Bacillus subtilis в препаративной форме СП в бумажных пакетах при переменной температуре (табл. 3).
Таблица 3
Влияние стабилизаторов и фотопротекторов на титр опытных образцов микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок на основе бактериального штамма-продуцента D 7-1 Bacillus subtilis через двенадцать месяцев хранения при переменной температуре от +24 до +26 6С
г. Краснодар, ВНИИМК, 2016 г.
Вариант Титр, КОЕ/г, через, месяцев
3 6 9 12
Контроль 3,3 х 108 2,0 х 108 1,7 х 108 1,0 х 108
Резорцин 0,1 4,8 х 108 4,0 х 108 3,8 х 108 2,8 х 108
Резорцин 0,2 3,0 х 108 3,1 х 108 3,0 х 108 2,4 х 108
Тиомочевина 0,05 8,4 х 108 3,0 х 107 2,0 х 107 1,5 х 107
Тиомочевина 0,1 8,0 х 108 4,3 х 107 2,0 х 107 1,8 х 107
Аскорбиновая кислота 0,05 4,5 х 108 1,2 х 108 1,0 х 108 1,0 х 108
Аскорбиновая кислота 0,1 4,4 х 108 1,0 х 108 1,0 х 108 1,0 х 108
Бензоат натрия 0,1 2,4 х 108 9,8 х 107 8,0 х 107 8,0 х 107
Бензоат натрия 0,5 1,3 х 108 6,4 х 107 5,0 х 107 6,4 х 107
Сульфат меди 0,005 2,3 х 108 3,4 х 107 2,0 х 107 2,0 х 107
Гидрохинон 0,1 3,7 х 108 6,8 х 107 5,0 х 107 4,8 х 107
Гидрохинон 0,5 4,1 х 108 6,8 х 107 2,0 х 107 2,0 х 107
Гумат 0,5 1,7 х 108 3,1 х 107 2,0 х 107 1,8 х 107
Гумат 2,0 1,8 х 108 3,4 х 107 1,0 х 107 1,0 х 107
Меласса 0,3 2,5 х 108 1,5 х 107 1,0 х 107 1,0 х 107
Меласса 0,5 2,7 х 108 6,3 х 107 2,0 х 107 2,0 х 107
Двуокись титана 1,0 1,4 х 108 6,4 х 107 3,0 х 107 2,8 х 107
Двуокись титана 10,0 1,4 х 108 5,5 х 107 2,8 х 107 2,4 х 107
Уголь активированный 0,5 2,3 х 108 8,6 х 107 2,0 х 107 2,0 х 107
В контроле без добавок титр микробиопрепарата при хранении в бумажном пакете в условиях переменной температуры от +24 до +26 оС в течение 12 месяцев сохранился на исходном уровне (1,0-
о
3,3 х 10 КОЕ/г). При добавлении стабилизаторов и фотопротекторов титр сохранился на исходном уровне в вариантах с резорцином и аскорбиновой кислотой (1,0-2,8 х 108 КОЕ/г). В остальных вари-
у
антах титр даже снизился до 10' КОЕ/г,
но в варианте с бензоатом натрия - с вып
соким основанием (6,4-8,0 х 107 КОЕ/г).
Таким образом установлено, что для сохранения опытных образцов микробиопрепарата на основе бактерий из рода Bacillus с исходным титром в течение 12 месяцев добавление стабилизаторов нецелесообразно.
Заключение. Оптимальный срок поверхностного культивирования бактериального штамма D 7-1 Bacillus subtilis на жидкой среде Тайлона 3 составил 15 суток, а объём посевной суспензии - 2,0 % к объёму питательной среды. При всех условиях хранения опытных образцов микробиопрепарата в пакетах и банках в течение 12 месяцев титр сохранялся на
о
первоначальном уровне (108 КОЕ/г). Исключением был вариант хранения СП при низкой температуре (-18 0С) в банках, где титр незначительно снизился - до 8,0-9,2 х 107 КОЕ/г, через 9 и 12 месяцев хранения. В отличие от микробиопрепаратов на основе грибных штаммов-продуцентов исходный титр сохранялся и в варианте хранения опытного образца при постоянной высокой температуре (+30 оС), осо-
о
бенно при хранении в банках (8,2 х 10 КОЕ/г). Для сохранения опытных образцов микробиопрепарата на основе бактерий из рода Bacillus с исходным титром в течение 12 месяцев добавление стабилизаторов нецелесообразно.
Список литературы
1. Маслиенко Л.В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с
болезнями подсолнечника: дис. ... докт. биол. наук / Любовь Васильевна Маслиенко. -Краснодар, 2005. - 377 с.
2. Маслиенко Л.В. Лаборатория биологических средств защиты растений (вчера, сегодня, завтра) // В кн.: История научных исследований во ВНИИМКе за 90 лет. -Краснодар, 2003.- С. 273-281.
3. Егоров Н.С. Выделение микробов-антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1957. - 78 с.
4. Нетрусов Ф.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.
5. Маслиенко Л.В., Воронкова А.Х. Элементы лабораторного регламента производства микробиопрепаратов на основе грибных штаммов-продуцентов в препаративной форме «смачивающийся порошок» // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2016.
- Вып. 4 (168). - С. 100-107.
References
1. Maslienko L.V. Obosnovanie i razrabotka mikrobiologicheskogo metoda bor'by s boleznyami podsolnechnika: dis. ... dokt. biol. nauk / Lyubov' Vasil'evna Maslienko. - Krasnodar, 2005. - 377 s.
2. Maslienko L.V. Laboratoriya biologicheskikh sredstv zashchity rasteniy (vchera, segodnya, zavtra) // V kn.: Istoriya nauchnykh issledovaniy vo VNIIMKe za 90 let.
- Krasnodar, 2003. - S. 273-281.
3. Egorov N.S. Vydelenie mikrobov-antagonistov i biologicheskie metody ucheta ikh antibioticheskoy aktivnosti. - M.: Izd-vo Mosk. un-ta, 1957. - 78 s.
4. Netrusov F.I., Egorova M.A., Zakharchuk L.M. Praktikum po mikrobiologii. - M.: Izdatel'skiy tsentr «Akademiya», 2005. - 608 s.
5. Maslienko L.V., Voronkova A.Kh. Elementy laboratornogo reglamenta proizvodstva mikrobiopreparatov na osnove gribnykh shtammov-produtsentov v preparativnoy forme «smachivayushchiysya poroshok» // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2016. - Vyp. 4 (168). - S. 100-107.
