CC BY
24
ЛИТЕРАТУРА
1. Вагапова В. Ш. // Морфология. — 2004. — № 4. — С. 26.
2. Маланин Д. А., Новочадов В. В., Самусев С. Р // Вестник ВолГМУ. — 2009. — № 2 (30). — С. 7—13.
3. Amis A. A., Firer P E., Thomas N. P // Knee. — 2003. — Vol. 10, № 3. — P 215—220.
4. Grood E. S., Suntay W. J. // J. Biomech. Eng. — 1983. — Vol. 105, № 2. — P.136—144.
5. Maquet P. // Clin. Orthop. — 1976 — Vol. 115. — P. 225—228.
6. Odensten M, Gillquist J. // J. Bone Joint Surg. — 1985. — Vol. 67. — P. 257—262.
7. Ostermeier S., Hurschler C, Stukenborg-Colsman C. // Arthroscopy. — 2004. — Vol. 22, № 3. — P. 308—319.
8. Sandmeier R. H., Burks R. T., Bachus K. N. // Am. J. Sports Med. — 2000. — Vol. 28, № 3. — P. 345—349.
9. Steensen R. N., Dopirak R. M., McDonald W. G. // Am. J. Sports Med. — 2004. — Vol. 32, № 6. — P. 1509—1513.
10. Trent P. S.,Walker P S., Wolf B. // Clin. Orthop. — 1976. — Vol. 117. — P 263—270.
11. Wang C. J., Walker P S. // J. Biomech. — 1973. — Vol. 19. — P 587—596.
Контактная информация
Новиков Дмитрий Александрович — аспирант кафедры травматологии, ортопедии и ВПХ с курсом травматологии, ортопедии ФУВ, e-mail: novikoy_trauma@mail.ru
УДК 612.352.3:616.157 - 612.014.44
ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ BCL-2 И BAD В ПЕЧЕНИ КРЫС И УРОВЕНЬ ЦИТОКИНОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ ПЕРСИСТЕНЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ФОНЕ КРУГЛОСУТОЧНОГО ОСВЕЩЕНИЯ
И. П. Жураковский, М. В. Битхаева, С. А. Архипов,
Т. А. Кунц, М. Г. Пустоветова, И. О. Маринкин
Новосибирский государственный медицинский университет
Выявлена зависимость экспрессии белков семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bad) в печени крыс Wistar от уровня цитокинов (IL-1 р, IL-1 р RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INF-y) в сыворотке крови при персистенции бактериальной инфекции, вызванной золотистым стафилококком (штамм 209) на фоне круглосуточного освещения.
Ключевые слова: бактериальная инфекция, золотистый стафилококк, маркеры апоптоза, Bcl-2, Bad, цитокины, круглосуточное освещение.
BCL-2 AND BAD PROTEINS EXPRESSION IN RAT LIVER AND CYTOKINES LEVEL IN BLOOD SERUM AT PERSISTING BACTERIAL INFECTION DURING ROUND-THE-CLOCK ILLUMINATION
I. P. Zhurakovsky, M. V. Bitkhaeva, S. A. Arkhipov, T. A. Kunts, M. G. Pustovetova, I. O. Marinkin
It was revealed that expression of Bcl-2 protein family (Bcl-2, Bad) in Wistar rat liver depends on cytokines (IL-1 p, IL-1 р RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF -a, INF-y) level in blood serum at persisting bacterial infection caused by Staphylococcus aureus (strain 209) during round-the-clock illumination.
Key words: bacterial infection, Staphylococcus aureus, apoptosis markers, Bcl-2, Bad, cytokines, round-the-clock illumination.
Длительное существование фокальной персисти-рующей инфекции вызывает определенное изменение функционирования основных гомеостатических систем и, как следствие, структурную перестройку органов и тканей. Имеются работы, в которых показано, что фокальная персистирующая инфекция, локализующаяся вне печени, способна приводить к развитию неспецифического реактивного гепатита и фиброзным изменениям в печени [1]. Вместе с тем взаимосвязи между процессами, регулирующими апоптоз клеток печени, и изменениями цитокинового профиля остаются до конца не изученными. Особенный интерес, в этой связи, представляет изучение особенностей течения хронического воспалительного процесса на фоне воздействия раз-
личных дополнительных дестабилизирующих факторов, одним из которых является световой десинхроноз.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Выявление зависимости экспрессии белков Bcl-2 и Bad в печени крыс Wistar от уровня цитокинов в сыворотке крови при персистенции бактериальной инфекции на фоне круглосуточного освещения.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперимент проведен на 18 половозрелых крысах-самцах Wistar с исходной массой 180—220 г. У 12 животных с помощью золотистого стафилококка (штамм 209) был воспроизведен остеомиелит большеберцовой кости.
Выпуск 4 (44). 2012
71
Световой десинхроноз вызывали содержанием крыс при круглосуточном освещении в течение 2 недель через 1,5 месяца после момента инфицирования. Животных выводили из эксперимента через 2 и 3 месяца с момента воспроизведения модели. В качестве контроля использовали 6 интактных животных. Эксперимент выполнялся с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей.
Материал фиксировали в 12%-м формалине. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм, которые, для обзорной световой микроскопии, окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином. Для изучения экспрессии в клетках печени белков Bcl-2 и Bad использовали двухэтапный иммуногистохимический метод. Анализ интенсивности специфического окрашивания анти- и проапоптотических белков-регуляторов и площади, на которой они выявлялись, проводилась с помощью светооптического микроскопа и морфометрического комплекса на базе микроскопа Micros MC 300A, цифровой камеры CX 13c фирмы Baumer и программного обеспечения ImageJ 1.42g (Национальный институт здоровья, США). Для каждой группы оценивалось по 48 изображений, площадь одного из которых составляла 21455 мкм2.
Исследование цитокинового профиля проводился наборами реагентов для иммуноферментного определения концентрации (IL-1 р, IL-1 р RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INF-y) в сыворотке крови - производства ЗАО «Вектор Бест» (г. Новосибирск) с использованием Wellwasf 4 Mk2 фирмы Thermo scientific (Finland) и спектрофотометра Multiscan Spectrum фирмы Thermo scientific (Finland).
Статистическая обработка полученных в ходе исследования данных проводилась с использованием программного пакета для статистической обработки SPSS v 13.0 for Windows. Учитывая малое количество случаев в выборке, применяли непараметрические критерии. Сравнение независимых групп проводили с использованием критерия Крус-кала-Уоллиса с последующим межгрупповым сравнением с помощью критерия Манна-Уитни. Различия между значениями сравниваемых параметров расценивались как статистически значимые при достижении уровня статистической значимости (р) менее чем 0,05 р < 0,05). Полученные в ходе исследования данные представлены как средняя (M) ± стандартная ошибка средней (т). С целью выявления наиболее информативного комплекса признаков осуществлялся корреляционный анализ путем вычисления коэффициента корреляции с помощью непараметрического критерия Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного исследования нами было установлено, что персистенция бактериальной инфекции в большеберцовой кости сопровождается раз-
витием признаков неспецифического реактивного гепатита, который сохранял свою активность на протяжении всего эксперимента. Проведенное на этом фоне изучение экспрессии белков-регуляторов апоптоза позволило выявить определенную динамику изменений, касающихся экспрессии белков семейства Bcl-2 (табл. 1).
Таблица 1
Относительная площадь, занимаемая гепатоцитами, экспрессирующими анти- (Bcl-2) и проапоптотический белок (Bad) в %, и интенсивность окрашивания клеточных элементов, экспрессирующих эти маркеры, у. е., (M ± m)
Показатель Инт. ВД 2 мес. ВД 3 мес.
Площадь, занимаемая гепатоцитами, экспрессирующими Bcl-2 26,30 ± 0,83 28,60 ± 0,81 17,10 ± 0,62*
Площадь, занимаемая гепатоцитами, экспрессирующими Bad 19,1 ± 0,7 31,10± 0,72* 31,6 ± 0,8*
Интенсивность окрашивания клеточных элементов, экспрессирующих Bcl-2 28,6 ± 0,6 41,30 ± 0,71* 40,00 ± 0,71*
Интенсивность окрашивания клеточных элементов, экспрессирующих Bad +1 о" о СО 45,90 ± 0,61* 31,30 ± 0,89
Примечание. Здесь и далее: Инт. — интактные животные, ВД 2 мес. — через 2 месяца после создания очага хронической инфекции на фоне светового десинхроноза, ВД 3 мес. — через 3 месяца после создания очага хронической инфекции, восстановительный период после светового десинхроноза.
^Достоверные отличия по сравнению с показателями интактной группы.
Так, через 2 мес. после создания очага хронической инфекции было отмечено, что проапоптогенный белок Bad стал выявляться в значительно большем количестве гепатоцитов. При этом количество гепатоцитов, экспрессирующих Bcl-2, не изменился. Интенсивность специфического окрашивания как к маркеру Bcl-2, так и Bad статистически значимо повысилась.
Известно, что Bcl-2 и его гомологи (Bcl-xL, Mcl-1 и др.) выполняют функцию защиты клеток от апоптоза. Фактор Bcl-2 поддерживает инактивированное состояние проапоптотического белкового комплекса, в состав которого входят прокаспаза-9 (Apaf-3), адаптер Apaf-1, флавопротеин AIF, цитохром с (Apaf-2), фактор Smac [2, 6]. В то время как белок Bad относят к группе апоптоз-опосредующих факторов (наряду с Bax, Bak, Bik, Bid). Для переключения клетки в режим апоптоза необходимо связывание Bcl-2, что нейтрализует ингибирующее действие последнего. Такое связывание может осуществляться большинством из проапоптотических белковых факторов Bcl-2-семейства [2, 4].
Результаты исследования, полученные нами через 3 мес. после создания очага хронической бактериальной
72
Выпуск 4 (44). 2012
инфекции, свидетельствуют о снижении относительной площади гепатоцитов, экспрессирующих Bcl-2, на фоне увеличения относительной площади клеточных элементов, экспрессирующих Bad. Это позволяет сделать предположение, что к одному из вероятных механизмов запуска апоптоза гепатоцитов при персистенции бактериальной инфекции можно отнести процесс гетеродимеризации Bcl-2, обусловленный одновременным снижением экспрессии белка Bcl-2 и повышением экспрессии в гепатоцитах белка Bad. Указанный процесс гетеродимеризации Bcl-2 может быть сопряжен с изменением степени фосфорилирования/ дефосфорилирования белка-индуктора Bad. Как известно, в этих условиях Bad дефосфорилируется, образуются гетеродимеры Bcl-2/Bad и запускается процесс апоптоза за счет высвобождения митохондриальных факторов, при этом в конечном итоге происходит активация каспазы-9 [3, 5].
Данные изменения происходят на фоне изменения профиля цитокинов, что можно рассматривать как отражение состояния иммунной системы, наблюдаемого при персистенции бактериальной инфекции (табл. 2).
Таблица 2
Концентрация цитокинов в сыворотке крови, пг/мл (M ± m)
Цитокины Инт ВД 2 мес. ВД 3 мес.
IL-1P 3,9 + 0,33 5,20 + 0,83 4,30 + 0,21
IL-1 р RA 110,30 + 8,56 134,0 + 17,3 162,10 + 16,51*
IL-2 19,70 + 3,37 16,30 + 1,05 14,50 + 0,56
IL-4 3,20 + 0,05 3,80 + 0,03* 3,50 + 0,11
IL-6 5,00 + 0,12 5,80 + 0,43* 5,70 + 0,07*
IL-10 23,6 + 0,7 31,60 + 4,46 26,50 + 0,88*
IL-17 16,50 + 0,46 19,90 + 1,61 19,00 + 0,68*
IL-18 19,0 + 0,39 22,00 + 1,55 21,80 + 0,88*
IFN-y 17,5 + 0,9 32,60 + 4,36* 19,20 + 0,64
TNF-a 5,80 ± 0,21 6,00 ± 0,39 6,50 ± 0,23*
Через 2 мес. после воспроизведения бактериальной инфекции на фоне светового десинхроноза при поведении корреляционного анализа были получены результаты, указывающие на существование высоко значимой отрицательной зависимости, между концентрацией IL-18 в сыворотке крови животных этой группы и площадью клеточных элементов печени, экспрессирующих Bcl-2 (r = -0,928; p = 0,008). Кроме того, были выявлены высокозначимые положительные корреляционные связи между интенсивностью специфического окрашивания и концентрацией IL-10 (г = 0,943; p=0,005), IL-17 (г = 0,829; p = 0,042), IL-1 р (г = 0,829; p = 0,042).
Через 3 мес. после воспроизведения бактериальной инфекции, в восстановительный период после светового десинхроноза, при поведении корреляционного анализа были получены результаты, указывающие на существование высокозначимой положительной зависимости между концентрацией INF-y и относительной
площадью клеточных элементов, экспрессирующих Bcl-2 (г = 0,870; p = 0,024), а также высокозначимой положительной зависимости между концентрацией IL-17 в сыворотке крови животных этой группы и относительной площадью гепатоцитов со специфической окраской к маркеру Bad (г = 0,886; p = 0,019). Кроме того, были выявлены высокозначимые положительные зависимости между интенсивностью специфического окрашивания Bcl-2 и концентрациями IL-4 (г = 0,899; p = 0,015) и IL-17 (г = 0,886; p = 0,019).
Изменения концентрации цитокинов в сыворотке крови у экспериментальных животных, выявленные в настоящем исследовании, подтверждают то положение, что, являясь начальным звеном активации иммунного ответа, они не только определяют эффективность и тип иммунного реагирования на инфекционные агенты, принимая непосредственное участие в иммунологической защите, но и участвуют в регуляции апоптоза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, полученные данные могут свидетельствовать, с одной стороны, о том, что члены семейства белков Bcl-2 непрерывно взаимодействуют друг с другом, находясь в динамическом равновесии между гомо- и гетеродимерами, что может служить причиной высвобождения митохондриальных факторов с активацией в конечном итоге каспазы-9 и развития апоп-тотических изменений клеточных элементов печени. С другой стороны, о возможной зависимости этих процессов от уровня «цитокиновой среды», представляющей собой матрицу взаимодействующих и часто меняющихся сигналов, носящих сложный характер из-за большого разнообразия цитокиновых рецепторов, и из-за того, что каждый цитокин может активировать или подавлять несколько процессов, включая свой собственный синтез и синтез других цитокинов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Жураковский И. П., Архипов С. А., Пустоветова М. Г. и др. // Сибирский медицинский журнал. — 2011. — Т 26, № 3 (вып. 2). — С. 140—144.
2. Akhtar R. S., Geng Y., Klocke B. J, Latham C. B., et at. // J Neurosci. — 2006. — Vol. 26. — Р 7257—7264.
3. Akhtaг R. S., Geng Y, Klocke B. J., et at. // Cell Death Differ. — 2006. — Vol. 13. — Р 1727—1739.
4. Dmkopanagiotakis F., Xifteh A., Polychmnopoulos V., et at. // Eur Respir J. — 2008. — Vol. 32. — Р 1631—1638.
5. Fmnke C., Noldneг M., Abdel-Kadeг R., et at. // Neurobiol Dis. — 2007. -Vol. 25, Iss. 2. — Р 438—445.
6. Kim R., Emi M., Tanabe K. // Cancer Chemother. Pharmacol. — 2005. — Vol. 21. — Р 1—9.
Контактная информация
Жураковский Игорь Павлович — к. м. н., ст н. с.,
ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития РФ, e-mail: murash2003@yandex. ru
Выпуск 4 (44). 2012
73
