CC BY
34
№ 3 - 2014 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 611.778:612.014.44]:616.94-022.7
ВЛИЯНИЕ НАРУШЕНИЯ СВЕТОВОГО РЕЖИМА НА ВТОРИЧНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ДЕРМЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ СТАФИЛОКОККОВОЙ
ИНФЕКЦИИ
И. П. Жураковский. С. А. Архипов, М. В. Битхаева, М. Г. Пустоветова
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск)
У 24-х крыс-самцов Wistar с остеомиелитом и 6-ти контрольных животных изучена экспрессия маркеров р53, Ю-67 в фибробластах сетчатого слоя кожи, а также коллагенов I и II типа, фибронектина и фибулина-2. Животных содержали при обычном и круглосуточном освещении. Полученные данные свидетельствовали о более выраженном увеличении содержания фибронектина и фибулина-2 при сочетанном воздействии, что сопровождалось менее выраженным снижением содержания в сетчатом слое дермы коллагена как I, так и II типа. Данные изменения наблюдались на фоне снижения пролиферативной способности фибробластов.
Ключевые слова: хроническая стафилококковая инфекция, круглосуточное освещение, фибробласты кожи, внеклеточный матрикс, коллаген, фибронектин, фибулин-2, р53, Ю-67.
Жураковский Игорь Павлович — доктор медицинских наук, старший научный сотрудник ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]
Архипов Сергей Алексеевич — доктор биологических наук, старший научный сотрудник ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]
Битхаева Мария Вячеславовна — научный сотрудник ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]
Пустоветова Мария Геннадьевна — доктор медицинских наук, профессор, заведующий ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]
Введение. Циркадный (суточный) ритм в физиологии и поведении является филогенетически древним и присутствует почти у всех растений и животных [9]. Нарушения светопериодичности в связи с изменившимися социально-экономическими условиями (вахтовый режим работы, смена часовых поясов при перелетах и т.п.) ведет к изменению биологических ритмов в работе органов и систем организма [10]. Однако влияние десинхронизации на организм полностью не исследовано, несмотря на многочисленные доказательства отрицательных последствий для здоровья [5].
В последние десятилетия наблюдается широкое распространение воспалительных заболеваний. Многие исследователи связывают высокую частоту хронических заболеваний различных органов и систем с воздействием неблагоприятных экологических факторов, несвоевременным и неадекватным лечением острых инфекционно-воспалительных процессов, развивающихся на фоне несовершенного иммунного ответа на этиологический фактор [3]. Метициллин-устойчивые штаммы Staphylococcus аиге^ являются одной из основных причин заболеваемости и смертности во многих странах [7, 8].
Несмотря на имеющиеся данные о развитии вторичной системной дезорганизации соединительной ткани при хронической стафилококковой инфекции [1, 4], вопрос развития рассматриваемой патологии на фоне нарушения светового режима остается неизученным.
Целью настоящего исследования являлось изучение влияния круглосуточного освещения на вторичные изменения сетчатого слоя дермы при моделировании хронической стафилококковой инфекции.
Материал и методы. Эксперимент проведен на 30-ти половозрелых крысах-самцах Вистар с массой тела 180-220 г. У 24-х животных под общим ингаляционным наркозом проведена трепанация большеберцовой кости с последующим тампонированием отверстия хлопчатобумажной нитью, находившейся 30 минут в смыве суточной культуры золотистого стафилококка (штамм 209). Предварительное исследование позволило установить, что при подобной обработке нити на ней содержится 1 х 107 колониеобразующих единиц. В последующем у крыс развивался остеомиелит большеберцовой кости. Животных выводили из эксперимента декапитацией под эфирным наркозом через 2 (2-я группа) и 3 мес (3-я группа) с момента воспроизведения модели. В качестве контроля использовали 6 интактных животных (1-я группа). Для изучения влияния светового десинхроноза в 4-й группе забор гистологического материала осуществляли сразу после окончания двухнедельного содержания животных при круглосуточном освещении, что соответствовало 2 мес с момента инфицирования; в 5-й группе — через 1 мес после окончания двухнедельного содержания животных при круглосуточном освещении, что соответствовало 3 мес с момента инфицирования.
Кожу хвоста фиксировали в 12 % формалине. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм, которые для обзорной световой микроскопии окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином. Для изучения изменений, происходящих во внеклеточном матриксе, оценивали характер распределения коллагенов I и II типа, фибронектина и фибулина-2 с помощью непрямого двухэтапного
стрептавидин-пероксидазного иммуногистохимического метода. Кроме того с помощью данного метода была исследована экспрессия в фибробластах сетчатого слоя кожи белков р53 и Ki-67. Анализ площади, занимаемой изучаемым маркером, а также интенсивности окрашивания проводился с помощью светооптического микроскопа и морфометрического комплекса на базе микроскопа Micros MC 300A, цифровой камеры CX 13c (фирма Baumer
Optronic GmbH, Германия) и программного обеспечения ImageJ 1.42g (Национальный институт здоровья, США). Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «SPSS 11.5 for Windows». Сравнение независимых групп проводили с использованием критерия Крускала-Уоллиса с последующим межгрупповым сравнением с помощью критерия Манна-Уитни при 95 % уровне значимости.
Результаты и обсуждение. Результаты морфометрического анализа, отражающие изменения клеточных элементов сетчатого слоя кожи в динамике стафилококковой инфекции при разных режимах освещения животных, представлены в табл. 1. При этом обращал на себя внимание тот факт, что световой десинхроноз не вызвал статистически значимого изменения пула клеточных элементов, экспрессирующих белок р53, задерживающего клетку в фазе G1/S клеточного цикла. Более того уровень продукции данного белка снизился, о чем свидетельствовало уменьшение интенсивности «специфического» окрашивания фибробластов. Изучение относительной площади фибробластов, экспрессирующих белок Ki-67, выявляющихся во всех клетках, кроме находящихся в фазе G0 клеточного цикла, не выявило статистически значимой разницы между инфицированными животными, содержащимися при различных режимах освещения. Однако, учитывая, что интенсивность окрашивания фибробластов, экспрессирующих Ki-67, в группе с дополнительным дестабилизирующим фактором была ниже в 1,7 раза, можно говорить об уменьшении продукции данного белка в клеточных элементах сетчатого слоя кожи этих животных.
Таблица 1
Морфометрические показатели, отражающие изменения клеточных элементов сетчатого слоя кожи в динамике стафилококковой инфекции при разных режимах освещения животных (И ± m)
Показатель Интактные Воспаление Воспаление + круглосуточное освещение
2 мес 3 мес 2 мес 3 мес
Относительная площадь ядер фибробластов, % 4,32 ± 0,06 3,91 ± 0,05# 2,18 ± 0,11# 3,04 ± 0,16#* 3,01 ± 0,08#*
Интенсивность окрашивания ядер фибробластов, у. е. 135,08 ± 1,39 139,58 ± 1,03# 139,73 ± 1,74 118,20 ± 1,75#* 127,92 ± 1,29#*
Относительная площадь фибробластов, экспрес- сирующих р53, % 0,80 ± 0,04 1,31 ± 0,10# 1,97 ± 0,10# 1,46 ± 0,12# 1,50 ± 0,14#*
Интенсивность окрашивания фибробластов, экспрес- сирующих р53, у. е. 60,54 ± 2,02 60,71 ± 1,30 46,87 ± 1,50# 31,43 ± 2,87#* 56,63 ± 1,84*
Относительная площадь фибробластов, экспрес- сирующих Ю-67, % 1,29 ± 0,06 0,84 ± 0,06# 0,54 ± 0,05# 1,13 ± 0,10 0,56 ± 0,05#*
Интенсивность
окрашивания фибробластов, 51,79 ± 1,50 75,50 ± 1,09# 53,83 ± 1,91 45,39 ± 2,57#* 35,53 ± 1,19#*
экспрес- сирующих Ю-67, у. е.
Примечание: * — статистически значимые различия с аналогичным сроком групп животных без десинхроноза при 95 % уровне значимости (р < 0,05); # — с интактными животными
Данные иммуногистохимического изучения внеклеточного матрикса сетчатого слоя кожи в динамике стафилококковой инфекции при разных режимах освещения животных представлены в табл. 2. Учитывая, что при хронической стафилококковой инфекции наблюдается вторичная системная дезорганизация соединительной ткани, проявляющаяся, в том числе изменениями волокнистого компонента и аморфного вещества внеклеточного матрикса сетчатого слоя дермы [2], нарушение светового режима приводит к более выраженным изменениям нейтральных гликопротеинов. Так, отмечалось статистически значимое возрастание относительной площади, занимаемой фибронектином и фибулином-2. Это заслуживает внимания, поскольку фибронектин, наряду с интегринами, играет важную роль в формировании фибрилл коллагена [6]. Вполне вероятно, что именно с этим связано менее выраженное снижение коллагена как I, так и II типа при сочетанном воздействии хронической стафилококковой инфекции и круглосуточного освещения.
Таблица 2
Морфометрические показатели внеклеточного матрикса сетчатого слоя кожи в динамике стафилококковой инфекции при разных режимах освещения
животных (И ± m)
Показатель Интактные Воспаление Воспаление + круглосуточное освещение
2 месяца 3 месяца 2 месяца 3 месяца
Коллагеновые волокна I типа
Относительная площадь, % 40,33 ± 2,38 71,09 ± 0,98# 59,60 ± 2,34# 71,49 ± 1,23# 65,26 ± 1,79#*
Интенсивность окрашивания, у. е. 60,10 ± 1,65 81,53 ± 2,15# 46,72 ± 1,85# 61,17 ± 3,29* 74,30 ± 1,62#*
Коллагеновые волокна II типа
Относительная площадь, % 72,57 ± 0,83 70,48 ± 0,83# 65,15 ± 0,56# 73,42 ± 0,63* 72,57 ± 0,74*
Интенсивность окрашивания, у. е. 71,07 ± 1,54 49,19 ± 1,64# 50,69 ± 1,98# 36,19 ± 1,93#* 48,22 ± 1,34#*
Фибронектин
Относительная площадь, % 84,15 ± 0,75 69,71 ± 0,51# 69,44 ± 0,58# 78,95 ± 0,66#* 84,90 ± 0,59*
Интенсивность окрашивания, у. е. 37,82 ± 1,47 79,61 ± 1,53# 36,59 ± 2,02 36,91 ± 1,31* 17,40 ± 1,20#*
Фибулин-2
Относительная площадь, % 65,57 ± 1,72 61,56 ± 1,73# 60,55 ± 1,90# 73,84 ± 1,88#* 75,40 ± 1,06#*
Интенсивность окрашивания, у. е.
69,92 ± 2,65
68,44 ± 1,39
54,00 ± 1,48#
58,29 ± 3,05#*
55,65 ± 2,67#*
Примечание: * — статистически значимые различия с аналогичным сроком групп животных без десинхроноза при 95 % уровне значимости (р < 0,05); # — с интактными животными
Заключение. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что нарушение светового режима у крыс Вистар с хронической стафилококковой инфекцией оказывает влияние на внеклеточный матрикс сетчатого слоя дермы. Эти изменения затрагивают как волокнистый компонент, так и аморфное вещество. Причем более выраженное увеличение содержания фибронектина и фибулина-2 при сочетании круглосуточного освещения с хронической стафилококковой инфекцией сопровождается менее выраженным снижением содержания в сетчатом слое дермы коллагена как I, так и II типа. Изменение характера распределения коллагеновых волокон и нейтральных гликопротеинов при совместном воздействии нарушения светового режима и хронической бактериальной инфекции сопровождается снижением популяции фибробластов, готовящихся или вступивших в митоз. Выявленные изменения функционального состояния клеточных элементов кожи и связанную с ними перестройку внеклеточного матрикса при хронической стафилококковой инфекции необходимо учитывать в практике дерматологии.
Список литературы
1. Гистохимическое и иммуногистохимическое исследование внеклеточного матрикса фиброзного кольца межпозвонковых дисков при моделировании стафилококковой инфекции / И. П. Жураковский [и др.] // Бюл. СО РАМН. — 2013. — Т. 33, № 6. — С. 25-30.
2. Жураковский И. П. Вторичная системная дезорганизация соединительной ткани как одно из проявлений синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных : монография / И. П. Жураковский, М. В. Битхаева, М. Г. Пустоветова. — LAP LAMBERT Academic Publishing, 2012. — 168 с.
3. Карпин В. А. Общая теория патологии : хронический инфекционный процесс / В. А. Карпин // Успехи современного естествознания. — 2005. — № 4. — С. 17-20.
4. Особенности развития фиброза печени на фоне формирования синдрома дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе / И. П. Жураковский [и др.] // Сиб. мед. журн. (г. Томск). — 2011. — Т. 26, № 3-2. — С. 140-143.
5. Bechtold D. A. Circadian dysfunction in disease / D. A. Bechtold, J. E. Gibbs, A. S. Loudon // Trends Pharmacol. Sci. — 2010. — Vol. 31. — P. 191-198.
6. Kadler K. E. Collagen fibrillogenesis : fibronectin, integrins, and minor collagens
as organizers and nucleators / K. E. Kadler, A. Hill, E. G. Canty-Laird // Cur. Opin. Cel. Biol. — 2008. — Vol. 20, N 5. — P. 495-501.
7. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States / R. M. Klevens [et al.] // JAMA. — 2007. — N 15 (298). — Р. 1763-1771.
8. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an overview for manual therapists / Green B.N. [et al.] // J. Chiropr. Med. — 2012. — Vol. 11, N 1. — P. 64-76.
9. Roenneberg T. Circadian clocks-the fall and rise of physiology / T. Roenneberg, M. Merrow // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. — 2005. — Vol. 6. — P. 965-971.
10. The genetics of mammalian circadian order and disorder : implications for physiology and disease / J. S. Takahashi [et al.] // Nat. Rev. Genet. — 2008. — Vol. 9, N 10. — P. 764-775.
INFLUENCE OF LIGHT REGIMEN DISTURBANCE ON SECONDARY
CHANGES OF DERMA AT CHRONIC STAPHYLOCOCCAL
INFECTION
I. P. Zhurakovsky. S. A. Arkhipov. M. V. Bitkhayeva. M. G. Pustovetova
SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (Novosibirsk c.)
The expression of p53and Ki-67 markers in fibroblasts of reticular dermis and also collagens of I and II type, fibronectin and fibulin-2 is studied at 24 Wistar males with osteomyelitis and 6 control animals. Animals were maintained at usual and 24-hour lighting. The obtained data testified to more expressed augmentation of maintenance of fibronectin and fibulin-2 at the combined influence that was accompanied by less expressed depression of the contents in reticular dermis of collagen both, I and II types. These changes were observed against depression of proliferative ability of fibroblasts.
Keywords: chronic staphylococcal infection, 24-hour lighting, skin fibroblasts, extracellular matrix, collagen, fibronectin, fibulin-2, p53, Ki-67.
About authors:
Zhurakovsky Igor Pavlovich — candidate of medical science, senior scientific worker of CSRL at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]
Arkhipov Sergey Alekseevich — doctor of biological science, senior scientist of CSRL at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», contact phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]
Bitkhayeva Maria Vyacheslavovna — scientist of CSRL at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]
Pustovetova Maria Gennadievna — doctor of medical science, professor of pathological physiology chair, head of CSRL at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]
List of the Literature:
1. Histochemical and immunohistochemical research of extracellular matrix of fibrous ring of intervertebral disks when modeling staphylococcal infection / I. P. Zhurakovsky [etc.] // Bulletin of RAMS. — 2013. — V. 33, № 6. — P. 25-30.
2. Zhurakovsky I. P. Secondary systemic disorganization of connecting tissue as one of implications of syndrome of the combined dystrophic and degenerative changes
of mesenchymal derivatives: monograph / I. P. Zhurakovsky, M. V. Bitkhayeva, M. G. Pustovetova. — LAP LAMBERT Academic Publishing, 2012. — 168 P.
3. Karpin V. A. General theory of pathology: chronic infectious process / V. A. Karpin // Achievements of modern natural sciences. — 2005. — № 4. — P. 17-20.
4. Features of development of fibrosis of liver against formation on syndrome of dystrophic and degenerative changes of mesenchymal derivatives at local chronic inflammatory process / I. P. Zhurakovsky [etc.] // Sib. medical journ. (Tomsk). — 2011. — V. 26, № 3-2.
— P. 140-143.
5. Bechtold D. A. Circadian dysfunction in disease / D. A. Bechtold, J. E. Gibbs, A. S. Loudon // Trends Pharmacol. Sci. — 2010. — Vol. 31. — P. 191-198.
6. Kadler K. E. Collagen fibrillogenesis : fibronectin, integrins, and minor collagens
as organizers and nucleators / K. E. Kadler, A. Hill, E. G. Canty-Laird // Cur. Opin. Cel. Biol.
— 2008. — Vol. 20, N 5. — P. 495-501.
7. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States / R. M. Klevens [et al.] // JAMA. — 2007. — N 15 (298). — Р. 1763-1771.
8. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an overview for manual therapists / Green B.N. [et al.] // J. Chiropr. Med. — 2012. — Vol. 11, N 1. — P. 64-76.
9. Roenneberg T. Circadian clocks-the fall and rise of physiology / T. Roenneberg, M. Merrow // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. — 2005. — Vol. 6. — P. 965-971.
10. The genetics of mammalian circadian order and disorder : implications for physiology and disease / J. S. Takahashi [et al.] // Nat. Rev. Genet. — 2008. — Vol. 9, N 10. — P. 764-775.
