Экспрессия белков семейства Bcl-2 и белка p53 в фибробластах кожи при длительном течении стафилококковой инфекции

Жураковский Игорь Павлович; Архипов Сергей Алексеевич; Пустоветова Мария Геннадьевна; Маринкин Игорь Олегович

№ 2 - 2013 г.

14.00.00 медицинские и фармацевтические науки

УДК 616.94-022.7:576.31

ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА BCL-2 И БЕЛКА P53 В ФИБРОБЛАСТАХ КОЖИ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ТЕЧЕНИИ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ

И. П. Жураковский, С. А. Архипов, М. Г. Пустоветова, И. О. Маринкин

ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава

России (г. Новосибирск)

У 18-ти крыс-самцов Wistar с остеомиелитом большеберцовой кости и 6-ти контрольных животных изучена экспрессия маркеров р53, Bax, Bad, Bcl-2 в фибробластах сетчатого слоя кожи. Исследования проводили через 1, 2 и 3 месяца после воспроизведения стафилококковой инфекции. Выявлено усиление экспрессии белка р53, повышение уровня экспрессии проапоптотического белка Ваd, преимущественно на ранних этапах, а также прогрессирующее усиление экспрессии Bax на фоне снижения экспрессии белка Bcl-2, что свидетельствует о высокой вероятности активации митохондриального пути индукции апоптоза фибробластов сетчатого слоя дермы при длительном течении стафилококковой инфекции.

Ключевые слова: персистенция бактериальной инфекции, Staphylococcus аureus,

фибробласты кожи, апоптоз, р53, Bax, Ваd, Bcl-2.

Жураковский Игорь Павлович — кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]

Архипов Сергей Алексеевич — доктор биологических наук, старший научный сотрудник ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]

Пустоветова Мария Г еннадьевна — доктор медицинских наук, профессор, заведующий ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]

Маринкин Игорь Олегович — доктор медицинских наук, профессор, ректор ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 222-32-04, e-mail: [email protected]

Введение. В последние десятилетия наблюдается широкое распространение воспалительных заболеваний. Многие исследователи связывают высокую частоту

хронических заболеваний различных органов и систем с воздействием неблагоприятных экологических факторов, несвоевременным и неадекватным лечением острых инфекционно-воспалительных процессов, развивающихся на фоне несовершенного иммунного ответа на этиологический фактор [1, 4, 5]. Одним из наиболее

распространенных микроорганизмов, занимающим одну из центральных позиций среди причин заболеваемости и смертности, является Staphylococcus аигеш [9, 12].

По современным представлениям апоптоз играет жизненно важную роль как в процессе эмбрионального развития, так и в онтогенезе в целом [7, 11]. Реализация

запрограммированной гибели клеток происходит при различных патологических состояниях. Имеются работы, в которых показана роль персистирующей бактериальной инфекции в развитии апоптоза в различных органах и тканях [2, 3], однако данные, раскрывающие возможность инициации и пролонгации апоптотического процесса в фибробластах кожи при длительной стафилококковой инфекции, отсутствуют.

Целью настоящего исследования являлось изучение экспрессии белков семейства Bcl-2 и белка p53 в фибробластах сетчатого слоя дермы при длительном течении стафилококковой инфекции.

Материал и методы. Эксперимент проведен на 24-х половозрелых крысах-самцах Вистар с массой тела 180-220 г. У 18-ти животных под общим ингаляционным наркозом проведена трепанация большеберцовой кости с последующим тампонированием отверстия хлопчатобумажной нитью, находившейся 30 мин в смыве суточной культуры Золотистого стафилококка (штамм 209). Предварительное исследование позволило

у

установить, что при подобной обработке нити на ней содержится 1 х 10 колонеобразующих единиц. В последующем у крыс развивался остеомиелит большеберцовой кости. Животных выводили из эксперимента декапитацией под эфирным наркозом через 1, 2 и 3 месяца с момента воспроизведения модели. В качестве контроля использовали 6 интактных животных. Эксперимент выполняли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей.

Материал фиксировали в 12 % формалине. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм, которые для обзорной световой микроскопии окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином. Для изучения экспрессии в фибробластах кожи белков, принимающих участие в механизмах инициации и пролонгирования апоптотического процесса в клетках (р53, Bcl-2, Bax, Bad), использовали непрямой двухэтапный стрептавидин-пероксидазный иммуногистохимический метод. Анализ экспрессии белков-регуляторов и площади, на которой она выявлялась, проводился с помощью светооптического микроскопа и морфометрического комплекса на базе микроскопа Micros MC 300A, цифровой камеры CX 13c (фирма Baumer Optronic GmbH, Германия) и программного обеспечения ImageJ 1.42g (Национальный институт здоровья, США). Для каждой экспериментальной группы оценивалось по 48 изображений. Площадь препарата, получаемого на одном изображении, составляла 21 455 мкм . Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «SPSS 11.5 for Windows». Сравнение независимых групп проводили с использованием критерия Крускала-Уоллиса с последующим межгрупповым сравнением с помощью критерия Манна-Уитни при 95 % уровне значимости.

Результаты и обсуждение. Изучение экспрессии белка p53, регулирующего экспрессию генов, участвующих в блокаде клеточного цикла, через месяц после создания отдаленного

очага хронического воспаления не позволило выявить статистически значимых изменений экспрессии и площади, занимаемой клеточными элементами, на которой она выявлялась. Вместе с тем отмечалось возрастание экспрессии и площади клеточных элементов, экспрессирующих Вах (табл. 1), что отражало увеличение популяции фибробластов сетчатого слоя кожи, продуцирующих данный белок. Кроме того выявлено усиление в 2,2 раза экспрессии Bad, сопровождающееся увеличением в 2,9 раза площади, на которой она выявлялась. Данные изменения сочетались со снижением экспрессии Bcl-2 в матрикс-продуцирующих клетках кожи.

В последующем, через 2 месяца после воспроизведения хронического воспаления, исследование экспрессии белка p53 в клеточных элементах сетчатого слоя дермы позволило выявить ее усиление в 1,6 раза по сравнению с интактными животными. Кроме того отмечалось дальнейшее нарастание пула фибробластов, экспрессирующих белок Вах, при сохранении статистически значимого увеличения площади клеток, экспрессирующих Bad. Данные изменения наблюдались на фоне снижения в 1,5 раза площади, занимаемой клеточными элементами, экспрессирующими Bcl-2.

Относительная площадь (в %) и экспрессия (в условных единицах) белков Bcl-2, Bax, Bad, р53 в фибробластах сетчатого слоя дермы (M ± m)

Показатель Интактные Воспаление

1 мес 2 мес 3 мес

Относительная площадь, занимаемая фибробластами, экспрессирующих Bcl-2 3,46 ± 0,21 3,77 ± 0,20 2,32 ± 0,11* 1,74 ± 0,07*

Относительная площадь, занимаемая фибробластами, экспрессирующих Bax 0,33 ± 0,03 0,78 ± 0,04* 1,27 ± 0,12* 2,15 ± 0,10*

Относительная площадь, занимаемая фибробластами, экспрессирующих Bad 0,64 ± 0,04 1,85 ± 0,13* 1,02 ± 0,08* 0,71 ± 0,04

Относительная площадь, занимаемая фибробластами, экспрессирующих р53 0,80 ± 0,04 1,00 ± 0,07 1,31 ± 0,10* 1,97 ± 0,10*

Экспрессия Bcl-2 в фибробластах кожи 173,93 ± 10,88 128,11 ± 7,54* 125,98 ± 6,11* 105,96 ± 4,66*

Экспрессия Bax в фибробластах кожи 22,71 ± 2,09 43,83 ± 2,62* 64,80 ± 6,95* 110,46 ± 5,98*

Экспрессия Bad в фибробластах кожи 44,86 ± 3,16 98,93 ± 6,84* 54,58 ± 4,79 47,67 ± 2,79

Экспрессия р53 в фибробластах кожи 47,66 ± 2,84 57,31 ±4,41 78,19 ± 5,40* 92,07 ± 5,13*

Примечание: * — достоверные отличия по сравнению с показателями интактной группы.

В настоящее время установлена возможность регуляции апоптотического процесса через белок р53, замедляющий в нормальных клетках митотическую активность [14]. Известно, что некоторые стимулы, например гипоксия, активируют ген р53, переводя клетку на апоптотический путь. Белок р53 задерживает клетку в фазе G1/S клеточного цикла

(через репрессию генов, регулирующих транскрипцию), чтобы дать время для работы репаративных систем. На уровне транскрипции фактор р53 регулирует экспрессию генов, участвующих в блокаде клеточного цикла, а также взаимодействует либо с комплексами, определяющими синтез и репарацию ДНК, либо с белками, модулирующими апоптоз. Если повреждение ликвидировать не удается, то р53 запускает апоптоз [6, 10, 13]. Происходит это через инактивирование Bcl-2 при связывании с белком Вах.

Исследование продукции белка p53 через 3 месяца после создания очага бактериальной инфекции позволило выявить прогрессирующее увеличение количества клеточных элементов, экспрессирующих данный маркер. Изучение продукции белка Bcl-2 позволило выявить прогрессирующее снижение количества клеточных элементов, экспрессирующих данный маркер. Это наблюдалось на фоне усиления экспрессии Вах и увеличения пула клеточных элементов, экспрессирующих данный белок, по сравнению с контролем в 6,5 раза.

В настоящее время известно, что белки Bcl-2 и Bax находятся в состоянии постоянного динамического равновесия, образуя гомо- и гетеродимеры. Последние не обладают проапоптогенной активностью. При доминировании продукции проапоптотического белка Bax такое равновесие нарушается и смещается в сторону образования большого количества гомодимеров, обладающих высокой проапоптогенной активностью [8].

Заключение. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что длительное течение стафилококковой инфекции не ограничивается только местным воздействием, но и оказывает влияние, в частности, на клеточные элементы сетчатого слоя дермы. Это проявляется усилением экспрессии белка р53, способного задерживать клетку в фазе G1/S клеточного цикла. Кроме того, учитывая отмеченное повышение уровня экспрессии проапоптотического белка Ваd преимущественно на ранних этапах, а также прогрессирующее усиление экспрессии Bax, что приводит к связыванию их с белком Bcl-2, соответственно имеется высокая вероятность активации митохондриального пути индукции апоптоза на фоне сниженной регенераторной способности фибробластов. Морфофункциональные изменения клеточных элементов кожи, наблюдаемые при наличии отдаленного очага бактериальной инфекции, необходимо учитывать в практике косметической дерматологии.

Список литературы

1. Бухарин О. В. Значение персистенции бактериальных патогенов для клинической практики / О. В. Бухарин // Рос. мед. вести. — 2000. — Т. 5, № 3. — С. 18-25.

2. Активация митохондриального пути апоптоза гепатоцитов при персистенции бактериальной инфекции / И. П. Жураковский, С. А. Архипов, М. Г. Пустоветова [и др.] // Забайкальский мед. вестн. — 2011. — № 2. — С. 125-131.

3. Изменения экспрессии белков семейства Bcl-2 в печени крыс и уровень цитокинов в сыворотке крови при персистенции бактериальной инфекции / И. П. Жураковский, М. В. Битхаева, С. А. Архипов [и др.] // Кубанский научный мед. вестн. — 2012. — № 2. — С. 84-88.

4. Карпин В. А. Общая теория патологии: хронический инфекционный процесс / В. А. Карпин // Успехи современного естествознания. — 2005. — № 4. — С. 17-20.

5. К вопросу об активности иммуновоспалительного процесса у детей с хроническим пиелонефритом в стадии клинической ремиссии / Н. А. Пекарева, Л. А. Трунова, Т. В. Белоусова [и др.] // Бюл. СО РАМН. — 2008. — Т. 131, № 3. — С. 52-55.

6. Neural precursor cells possess multiple p53-dependent apoptotic pathways / R. S. Akhtar, Y. Geng, B. J. Klocke, K. A. Roth // Cell. Death. Differ. — 2006. — Vol. 13. — P. 1727-1739.

7. Apoptosis in lung injury and fibrosis / F. Drakopanagiotakis, A. Xifteri, V. Polychronopoulos, D. Bouros // Eur. Respir. J. — 2008. — Vol. 32. — P. 1631-1638.

8. Bcl-2 upregulation and neuroprotection in guinea pig brain following chronic simvastatin treatment / C. Franke, M. Noldner, R. Abdel-Kader [et al.] // Neurobiology of Disease. — 2007. —Vol. 25, Iss. 2. — P. 438-445.

9. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an overview for manual therapists / B. N. Green, C. D. Johnson, J. T. Egan [et al.] // J. Chiropr. Med. — 2012. — Vol. 11, N.1. — P. 64-76.

10. Harris S. L. The p53 pathway : positive and negative feedback loops / S. L. Harris, A. J. Levine // Oncogene. — 2005. — Vol. 24. — P. 2899-2908.

11. Hengartner M. O. The biochemistry of apoptosis / M. O. Hengartner // Nature. — 2000.

— Vol. 407. — P. 770-776.

12. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States / R. M. Klevens, M. A.Morrison, J. Nadle [et al.] // JAMA. — 2007. — Vol. 298, N 15. — P.1763-1771.

13. Schuler M. Transcription, apoptosis and p53 : Catch-22 / M. Schuler, D. R. Green // Trends Genet. — 2005. — Vol. 21. — P. 182-187.

14. Yu J., Zhang L. The transcriptional targets of p53 in apoptosis control / J. Yu, L. Zhang // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2005. — Vol. 331. — P. 851-858.

EXPRESSION OF BCL-2 PROTEIN FAMILY AND P53 PROTEIN IN DERMAL FIBROBLASTS AT THE LONG COURSE OF STAPHYLOCOCCAL INFECTION

I. P. Zhurakovsky, S. A. Arkhipov, "№.. G. Pustovetova, I. О. Marinkin

SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University ofMinistry of Health» (Novosibirsk c.)

The expression of markers such as p53, by Bax, Bad, Bcl-2 in dermal fibroblasts of reticular dermis is studied at 18 Wistar males rats with osteomyelitis of tibial bone and at 6 control animals. Researches were conducted in 1, 2 and 3 months after procreation of staphylococcal infection. Intensifying of expression of p53 protein, rising of expression level of pro-apoptotic Bad protein, mainly at early stages, and also progressing intensifying of Bax expression against depression of Bcl-2 protein expression that testifies the high probability of activation on mitochondrial way of induction in dermal fibroblasts of reticular dermis at the long course of staphylococcal infection is revealed.

Keywords: persistence of bacterial infection, Staphylococcus aureus, dermal fibroblasts, apoptosis, p53, Bax, Bad, Bcl-2.

About authors:

Zhurakovsky Igor Pavlovich — candidate of medical sciences, senior scientific worker of CSRL at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]

Arkhipov Sergey Alekseevich — doctor of biological sciences, senior scientist of CSRL at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», contact phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]

Pustovetova Maria Gennadievna — doctor of medical sciences, professor of pathological physiology chair, head of CSRL at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: [email protected]

Marinkin Igor Olegovich — doctor of medical sciences, professor, rector of SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», contact phone: 8 (383) 222-3204, e-mail: [email protected]

List of the Literature:

1. Bukharin O. V. Value of persistence of bacterial pathogens for clinical practice / O. V. Bukharin // Rus. medical messages. — 2000 . — V. 5, № 3. — P. 18-25.

2. Activation of mitochondrial way of hepatocytes apoptosis at persistence bacterial infection / I. P. Zhurakovsky, S. A. Arhipov, M. G. Pustovetova [etc.] // Transbaikal medical bull. — 2011. — № 2. — P. 125-131.

3. Changes in expression of Bcl-2 family proteins in rats’ liver and level of cytokines in blood serum at persistence of bacterial infection / I. P. Zhurakovsky, M. V. Bitkhayeva, S. A. Arkhipov [etc.] // Kuban scientific medical bull. — 2012 . — № 2. — P. 84-88.

4. Karpin V. A. General theory of pathology: chronic infectious process / V. A. Karpin // Successes of modern natural sciences. — 2005. — № 4. — P. 17-20.

5. To a question of activity of immunoinflammatory process at children with chronic pyelonephritis at clinical remission / N. A. Pekarev, L. A. Trunov, T. V. Belousov [etc.] // Bulletin of SB RAMS. — 2008 . — V. 131, № 3. — P. 52-55.