CC BY
78
№ 5 - 2012 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки УДК 611.36.018.53+616.15:616.9]-612.014.44
СИСТЕМА МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ ПЕЧЕНИ И ЦИТОКИНЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ ПЕРСИСТЕНЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ФОНЕ СВЕТОВОГО
ДЕСИНХРОНОЗА
И.О. Маринкин, И.П. Жураковский, М.В. Битхаева, С.А. Архипов, М.Г. Пустоветова
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития (г. Новосибирск)
Изучены особенности экспрессии маркеров макрофагов/моноцитов (клон ГС7), активации клеток (CD25), регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bad) в синусоидных клетках печени, а также уровень цитокинов в сыворотке крови 18-ти половозрелых крысах-самцах Вистар, у 12-ти из которых с помощью Золотистого стафилококка (штамм 209) был воспроизведен остеомиелит большеберцовой кости. Световой десинхроноз вызывали содержанием крыс при круглосуточном освещении в течение двух недель через 1,5 месяца после момента инфицирования. Отмечены некоторые особенности активации системы мононуклеарных фагоцитов печени на фоне светового десинхроноза, которые обусловлены инициацией апоптотического процесса в части Купферовских клеток.
Ключевые слова: система мононуклеарных фагоцитов, клетки Купфера, бактериальная инфекция, CD25, клон IC7, цитокины, апоптоз, световой десинхроноз.
Маринкин Игорь Олегович — доктор медицинских наук, профессор, ректор ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», контактный телефон: 8 (383) 222-32-04, e-mail: rectorngmu@ yandex.ru
Жураковский Игорь Павлович — кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский
университет», контактный телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: murash2003@yandex.ru
Битхаева Мария Вячеславовна — научный сотрудник ЦНИЛ ГБОУ ВПО
«Новосибирский государственный медицинский университет», контактный телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: zueva-mar13@yandex.ru
Архипов Сергей Алексеевич — доктор биологических наук, старший научный сотрудник ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский
университет», контактный телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: arhipowsergei@yandex.ru
Пустоветова Мария Геннадьевна — доктор медицинских наук, профессор, заведующий ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», контактный телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: patophisiolog@mail.ru
Введение. Система мононуклеарных фагоцитов в печени представлена клетками Купфера, которые составляют примерно 10 % от общей численности клеточных элементов в этом органе [9] и 80-90 % всех тканевых макрофагов в организме [1]. Имеются работы, в которых обращается внимание на роль, которую играют мононуклеарные фагоциты при патологии печени. При этом отмечается, что активированные клетки Купфера запускают целый ряд процессов: осуществляют взаимодействие с гепатоцитами и другими клетками печени, секретируя различные биологически активные медиаторы, в том числе цитокины, хемокины, эйкозаноиды, протеолитические ферменты, активные формы кислорода и оксид азота; привлечение и удерживание нерезидентных клеток в печень, таких как нейтрофилы, Т-лимфоциты, NK-клетки, моноциты; осуществляют функцию фагоцитоза, способствуя индукции активации и регуляции иммунитета к различным инфекционным агентам [4; 7; 8]. Вместе с тем взаимосвязи между макрофагальной системой печени и изменениями цитокинового профиля при персистенции бактериальной инфекции вне печени до конца остаются еще не изученными. Особенный интерес в этой связи представляет изучение своеобразия течения хронического воспалительного процесса на фоне воздействия различных дополнительных дестабилизирующих факторов, одним из которых является световой десинхроноз.
Целью настоящего исследования являлось выявление особенностей активации системы мононуклеарных фагоцитов печени и уровень цитокинов в сыворотки крови у половозрелых крыс-самцов Wistar при персистенции бактериальной инфекции на фоне светового десинхроноза.
Материал и методы. Эксперимент проведен на 18-ти половозрелых крысах-самцах Вистар с исходной массой 180-220 г. У 12-ти животных с помощью Золотистого стафилококка (штамм 209) был воспроизведен остеомиелит большеберцовой кости. Световой десинхроноз вызывали содержанием крыс при круглосуточном освещении в течение двух недель через 1,5 месяца после момента инфицирования. Животных выводили из эксперимента через 2 и 3 месяца с момента воспроизведения модели (соответственно группы 2 и 3). В качестве контроля использовали 6 интактных животных (группа 1). Материал фиксировали в 12 % формалине. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм, которые для обзорной световой микроскопии окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином. Для изучения экспрессии в синусоидных клетках печени белков Bcl-2, Bad, маркера моноцитов/макрофагов (клон IC7 — аналог CD68), маркера активированных клеток (CD25) использовали двухэтапный иммуногистохимический метод. Анализ интенсивности специфического окрашивания и площади, на которой они выявлялись, проводился с помощью светооптического микроскопа и морфометрического комплекса на базе микроскопа Micros MC 300A, цифровой камеры CX 13c фирмы Baumer и программного обеспечения ImageJ 1.42g. Исследование цитокинового профиля проводилось наборами реагентов для иммуноферментного определения концентрации (IL-1P, IL-1P RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IL-18, TNF-a, INF-g, TGF-P) в сыворотке крови производства ЗАО «Вектор Бест» (г. Новосибирск) с использованием Wellwasf 4 Mk2 фирмы Thermo scientific (Finland) и спектрофотометра Multiscan Spectrum фирмы Thermo scientific (Finland). Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного пакета для статистической обработки SPSS v 13.0 for Windows. Сравнение независимых групп
проводили с использованием критерия Крускала-Уоллиса с последующим межгрупповым сравнением с помощью критерия Манна-Уитни. Различия между значениями сравниваемых параметров расценивались как статистически значимые при достижении уровня статистической значимости (р) менее чем 0,05 (р < 0,05). Полученные в ходе исследования данные представлены как средняя (M) ± стандартная ошибка средней (m).
Результаты и обсуждение. В результате проведенного исследования было установлено, что персистенция бактериальной инфекции в большеберцовой кости сопровождается развитием признаков неспецифического реактивного гепатита, который сохранял свою активность на протяжении всего эксперимента. Проведенное на этом фоне изучение экспрессии белков-регуляторов апоптоза позволило выявить определенную динамику изменений, касающихся экспрессии белков семейства Bcl-2, от соотношения которых зависит вероятность индукции апоптоза. При этом были отмечены следующие изменения относительной площади синусоидных клеток, экспрессирующих проапоптотический маркер Bad: контроль — 16,5 ± 0,57; группа 2 — 23,1 ± 0,61, р < 0,05; группа 3 — 22,9 ±
0,71, р > 0,05. Относительная площадь аналогичных клеточных элементов,
экспрессирующих антиапоптотический белок Bcl-2, изменялась следующим образом: контроль — 18,5 ± 0,66; группа 2 — 19,5 ± 0,39, р > 0,05; группа 3 — 12,4 ± 0,48, р < 0,05. Известно, что фактор Bcl-2 поддерживает инактивированное состояние проапоптотического белкового комплекса, в то время как белок Bad относят к группе апоптозопосредующих факторов (наряду с Bax, Bak, Bik, Bid). Для переключения клетки в режим апоптоза необходимо связывание Bcl-2, что нейтрализует ингибирующее действие последнего. Полученные данные указывают на возможность индукции апоптотического процесса в эндотелиоцитах и клетках Купфера.
Клетки Купфера играют центральную роль в регуляции цитокинов печени при инфекционном процессе [5; 6], однако при персистенции бактериальной инфекции на фоне светового десинхроноза не наблюдается увеличения пула мононуклеарных фагоцитов в печени, напротив, имеется тенденция к его снижению (табл. 1).
Таблица 1
Относительная площадь, занимаемая синусоидными клетками, экспрессирующими маркеры макрофагов/моноцитов (клон IC7) и активированных клеток (CD25), и интенсивность окрашивания клеточных элементов, экспрессирующих эти
маркеры (M ± m)
Показатель Инт ВД 2 мес ВД 3 мес
Площадь, занимаемая синусоидными клетками, экспрессирующими маркер макрофагов/моноцитов 1С7, % 12,6 ± 0,94 11,6 ± 0,27 9,7 ± 0,76*
Площадь, занимаемая синусоидными клетками, экспрессирующими маркер активированных клеток CD25, % 9,1 ± 0,54 11,1 ± 0,71 8,2 ± 0,46
Отношение относительной площади синусоидных клеток, экспрессирующих маркер макрофагов/моноцитов к относительной площади активированных клеток 1,4 ± 0,08 1,1 ± 0,06* 1,2 ± 0,10
Интенсивность окрашивания клеточных элементов, экспрессирующими маркер макрофагов/моноцитов 1С7, 32,6 ± 1,97 59,4 ± 1,43* 62,4 ± 1,22*
усл. ед.
Интенсивность окрашивания клеточных элементов, экспрессирующими маркер активированных клеток CD25, усл. ед. 27,7 ± 1,79 36,9 ± 2,51* 49,0 ± 2,60*
Примечание: инт — интактные животные, ВД 2 мес — через 2 месяца после создания очага хронической инфекции на фоне светового десинхроноза, ВД 3 мес — через 3 месяца после создания очага хронической инфекции, восстановительный период после светового десинхроноза, * — достоверные отличия по сравнению с показателями интактной группы
Вполне вероятно, что инициация апоптотического процесса объясняет отсутствие увеличения цитокинов секретируемых клетками Купфера во второй группе, несмотря на то, что имеется возможность запуска как классического пути активации этих клеточных элементов продуцируемым ТЫ лимфоцитами и МК клетками Ш№у, так и альтернативного, осуществляемого через ^2, благодаря секреции ими ГЬ-4 (табл. 2). Возможность увеличения количества активированных мононуклеарных фагоцитов в печени подтверждается усилением интенсивности специфического окрашивания, возрастанием относительной площади клеточных элементов, экспрессирующих СБ25, а также уменьшением отношения всех моноцитов/макрофагов к активированным клеточным элементам.
Таблица 2
Концентрация цитокинов в сыворотке крови пг/мл ^ ± m)
Цитокины Инт ВД 2 мес ВД 3 мес
1Ь-1Р 3,9 ± 0,33 5,2 ± 0,83 4,3 ± 0,21
1Ь-1Р ЯЛ 110,3 ± 8,56 134,0 ± 17,30 162,1 ± 16,51*
1Ь-2 19,7 ± 3,37 16,3 ± 1,05 14,5 ± 0,56
1Ь-4 3,2 ± 0,05 3,8 ± 0,03* 3,5 ± 0,11
1Ь-6 5,0 ± 0,12 5,8 ± 0,43* 5,7 ± 0,07*
1Ь-10 23,6 ± 0,70 31,6 ± 4,46 26,5 ± 0,88*
1Ь-17 16,5 ± 0,46 19,9 ± 1,61 19,0 ± 0,68*
1Ь-18 19,8 ± 0,39 22,0 ± 1,55 21,8 ± 0,88*
№N-8 17,5 ± 0,90 32,6 ± 4,36* 19,2 ± 0,64
ТОТ-а 5,8 ± 0,21 6,0 ± 0,39 6,5 ± 0,23*
Примечание: инт — интактные животные, ВД 2 мес — через 2 месяца после создания очага хронической инфекции на фоне светового десинхроноза, ВД 3 мес — через 3 месяца после создания очага хронической инфекции, восстановительный период после светового десинхроноза, * — достоверные отличия по сравнению с показателями интактной группы
В дальнейшем (группа 3 — период восстановления после спровоцированного светового десинхроноза), несмотря на то, что относительная площадь клеточных элементов, экспрессирующих клон IC7 стала достоверно меньше по отношению к контролю, наблюдалось усиление интенсивности специфического окрашивания клеточных элементов, экспрессирующих CD25, а также сохранение статистически значимого по отношению к интактным животным уменьшения отношения всех моноцитов/макрофагов к активированным формам клеток. Вполне вероятно, что ликвидация последствий спровоцированного светового десинхроноза привела к восстановлению роли мононуклеарных фагоцитов, характерной для этих клеточных элементов при инфекционном процессе. Очевидно, именно поэтому наблюдается статистически значимое повышение в сыворотке концентраций IL-18, IL-6, IL-10, TNFa, поскольку именно клетки Купфера служат значительным источником последних трех цитокинов [2; 3].
Заключение. Таким образом, состояние системы мононуклеарных фагоцитов печени при персистенции бактериальной инфекции на фоне светового десинхроноа характеризуется определенным своеобразием. Оно обусловлено инициацией апоптотического процесса в части Купферовских клеток, из-за чего нарушается их функционирование, в частности секреция ими цитокинов. Период восстановления после спровоцированного светового десинхроноза, несмотря на сокращение пула моноцитов/макрофагов печени, характеризуется, увеличением доли активированных клеточных элементов и восстановлением секреторной функции мононуклеарных фагоцитов, характерной для этих клеточных элементов при инфекционном процессе.
Полученные данные свидетельствуют о неоднозначной направленности реакции иммунной системы в условиях персистенции бактериальной инфекции: происходит динамическая балансировка между про- и противовоспалительными цитокинами, осуществляющими взаимодействие с системой мононуклеарных фагоцитов печени. Процесс активации клеток Купфера зависит от состояния «цитокиновой сети», в которой часто меняющиеся сигналы носят сложный характер из-за большого разнообразия цитокиновых рецепторов и из-за того, что каждый цитокин может активировать или подавлять несколько процессов, включая свой собственный синтез и синтез других цитокинов.
Список литературы
1. Bouwens L. Quantitation, tissue distribution and proliferation kinetics of Kupffer cells in normal rat liver / L. Bouwens [et al.] // Hepatology. — 1986. — N 6. — P. 718-722.
2. Canbay A. Kupffer cells engulment of apoptotic bodies stimulates death ligand and cytokine expression / А. Canbay [et al.] // Hepatology. — 2003. — Vol. 38. — P. 11881198.
3. Decker K. Biologically active products of stimulated liver macrophages (Kupffer cells) / K. Decker // Eur. J. Biochem. — 1990. — Vol. 192. — P. 245-261.
4. Gao B. Liver : An organ with predominant innate immunity / В. Gao [et al.] // Hepatology. — 2008. — Vol. 47. — P. 729-736.
5. Holub M. Neutrophils Sequestered in the Liver Suppress the Proinflammatory Response of Kupffer Cells to Systemic Bacterial Infection / M. Holub [et al.] // J. Immunol. — 2009. — Vol. 183, N 5. — P. 3309-3316.
6. Jacques A. Lamontagne L Intrahepatic endothelial and Kupffer cells involved in immunosuppressive cytokines and natural killer (NK)/NK T cell disorders in viral acute hepatitis / A. Jacques [et al.] // Clin. Exp. Immunol. — 2008. — N 2. — P. 298310.
7. Maher J. J. Beyond insulin resistance: Innate immunity in nonalcoholic steatohepatitis / J. J. Maher [et al.] // Hepatology. — 2008. — Vol. 48. — P. 670-678.
8. Racanelli V. The liver as an immunological organ / V. Racanelli, B. Rehermann // Hepatology. — 2006. — Vol. 43. — P. 54-62.
9. Wake K. Cell biology and kinetics of Kupffer cells in the liver / K. Wake [et al.] // Int. Rev. Cytol. — 1989. — Vol. 118. — P. 173-229.
SYSTEM OF MONONUCLEAR PHAGOCYTES OF LIVER AND BLOOD SERUM CYTOKINES AT PERSISTENCE OF BACTERIAL INFECTION AGAINST LIGHT DESYNCHRONOSIS
^. Marinkin, I.P. Zhurakovsky, M.V. Bitkhayeva, S.A. Arkhipov, M.G. Pustovetova
SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment» (Novosibirsk c.)
Features of marker expression of macrophages/monocytes (IC7 clone), activation of cells (CD25), apoptosis regulators (Bcl-2, Bad) in sinusoid cells of liver, and also the level of cytokines in blood serum are investigated at 18 Vistar puberal male rats. An osteomyelitis of shin bone was reproduced with S. aureus (the strain 209) at 12 of these rats. Light desynchronosis was caused by maintenance of rats at round-the-clock lighting within two weeks in 1,5 months after becocoming infected. Some features of activation of mononuclear phagocytes system of liver against light desynchronosis, which are caused by apoptotic process initiation regarding the Kupffer’s cells, are registered.
Keywords: system of mononuclear phagocytes, Kupffer’s cell, bacterial infection, CD25, IC7 clone, cytokines, apoptosis, light desynchronosis.
About authors:
Marinkin Igor Olegovich — doctor of medical sciences, professor, rector at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», contact phone: 8 (383) 22232-04, e-mail: rectorngmu@yandex.ru
Zhurakovsky Igor Pavlovich — candidate of medical sciences, senior scientist of CSRL at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», contact phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: murash2003@yandex.ru
Bitkhayeva Maria Vyacheslavovna — scientist of CSRL at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», contact phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: zueva-mar13@yandex.ru
Arkhipov Sergey Alekseevich — doctor of biological sciences, senior scientist of CSRL at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», contact phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: arhipowsergei@yandex.ru
Pustovetova Maria Gennadievna — doctor of medical sciences, professor, head of CSRL at SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Minhealthsocdevelopment», contact phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: patophisiolog@mail.ru
List of the Literature:
1. Bouwens L. Quantitation, tissue distribution and proliferation kinetics of Kupffer cells in normal rat liver / L. Bouwens [et al.] // Hepatology. — 1986. — N 6. — P. 718-722.
2. Canbay A. Kupffer cells engulment of apoptotic bodies stimulates death ligand and cytokine expression / А. Canbay [et al.] // Hepatology. — 2003. — Vol. 38. — P. 11881198.
3. Decker K. Biologically active products of stimulated liver macrophages (Kupffer cells) / K. Decker // Eur. J. Biochem. — 1990. — Vol. 192. — P. 245-261.
4. Gao B. Liver : An organ with predominant innate immunity / В. Gao [et al.] // Hepatology. — 2008. — Vol. 47. — P. 729-736.
5. Holub M. Neutrophils Sequestered in the Liver Suppress the Proinflammatory Response of Kupffer Cells to Systemic Bacterial Infection / М. Holub [et al.] // J. Immunol. — 2009. — Vol. 183, N 5. — P. 3309-3316.
6. Jacques A. Lamontagne L Intrahepatic endothelial and Kupffer cells involved in immunosuppressive cytokines and natural killer (NK)/NK T cell disorders in viral acute hepatitis / А. Jacques [et al.] // Clin. Exp. Immunol. — 2008. — N 2. — P. 298310.
7. Maher J. J. Beyond insulin resistance: Innate immunity in nonalcoholic steatohepatitis / J. J. Maher [et al.] // Hepatology. — 2008. — Vol. 48. — P. 670-678.
8. Racanelli V. The liver as an immunological organ / V. Racanelli, B. Rehermann // Hepatology. — 2006. — Vol. 43. — P. 54-62.
9. Wake K. Cell biology and kinetics of Kupffer cells in the liver / K. Wake [et al.] // Int. Rev. Cytol. — 1989. — Vol. 118. — P. 173-229.
