CC BY
86
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 4
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 615.384.015.44.076.9
ВЛИЯНИЕ ПЛАЗМОЗАМЕНЯЮЩИХ ПОЛИМЕРОВ ДЕКСТРАНА И ПОЛИВИНИЛПИРРОЛИДОНА НА МАКРОФАГИ ПЕЧЕНИ И МОНОЦИТЫ КРОВИ КРЫС
А.Б. Пупышев, С.В.Позднякова, С.А. Архипов
ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России
Резюме. Представлены результаты экспериментального изучения реакции системы мононуклеар-ных фагоцитов крыс на однократное введение декстрана (реополиглюкина) (30—40 кД) и поливинилпир-ролидона (24 кД) в дозе 50 мг на 1 кг массы тела животного. Установлено, что декстран вызывает раннюю (1-е сутки) стимуляцию купферовских макрофагов печени (по накоплению акридинового оранжевого, росту активности в-галактозидазы) без видимой стимуляции моноцитов (содержание в крови, фагоцитарный индекс). Обнаружены поздний (7-е сутки) рост фагоцитарной активности моноцитов и фагоцитозиндуци-руемой хемилюминесценции клеток крови. Содержание моноцитов в костном мозге характеризовалось «волной» ответа в промежуточный срок (3-и сутки), что указывает на вероятность формирования позднего ответа моноцитов через зависимую от клеток Купфера стимуляцию образования моноцитов в костном мозге. Поливинилпирролидон вызывал снижение накопления акридинового оранжевого макрофагами печени (1-е сутки), уменьшение содержания в крови моноцитов и их фагоцитарной активности (3-и и 7-е сутки), что можно трактовать как депрессивное воздействие на систему мононуклеарных фагоцитов.
Ключевые слова: декстран; поливинилпирролидон; плазмозаменители; печень; система мононуклеарных фагоцитов; лизосомы.
EFFECTS OF DEXTRAN AND POLYVINYLPYRROLIDONE PLASMA SUBSTITUTING POLYMERS ON THE RAT LIVER MACROPHAGES AND BLOOD MONOCYTES
A.B. Pupyshev, S.V. Pozdnyakova, S.A. Arkhipov
Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia
Summary. The reactions of the rat mononuclear phagocyte system to a single injection of dextran (rheopolygluquine; 30—40 kD) and polyvinylpyrrolidone (24 kD) in a dose of 50 mg/kg were studied. Dextran induced early (day 1) stimulation of the liver Kupffer's macrophages (evaluated by accumulation of Acridine Orange and increase of в-galactosidase activity) without apparent stimulation of monocytes (blood counts, phagocytic index). Delayed (day 7) increase of the monocyte phagocytic activity and of phagocytosis-induced chemiluminescence of blood cells were detected. Bone marrow monocyte counts were characterized by a "wave" response during the intermediate period (day 3), this indicating the probability of a delayed response of monocytes, mediated by Kupffer's cell-dependent stimulation of monocyte formation in the bone marrow. Polyvinylpyrrolidone caused a lesser accumulation of Acridine Orange by liver macrophages (day 1) and reduced blood counts of monocytes and their phagocytic activity (days 3 and 7), which could be regarded as depression of the mononuclear phagocyte system.
Key words: dextran; polyvinylpyrrolidone; plasma substitutes; liver; mononuclear phagocyte system; lysosomes.
Используемые в трансфузиологической практике плазмозаменители в своей основе имеют полимерную компоненту: декстран, гидрооксиэтилкрахмал, желатин, поливинилпирролидон — ПВП и др. Наличие полимерной компоненты обусловливает взаимодействие плазмозаменителей с клетками, поглощающими полимерные субстраты, что может привести к синдрому лизосомного накопления [1—3]. Патогенный эффект многократных инфузий ПВП, описанный как болезнь накопления ПВП [4], привел в 2005 г. к снятию с производства в России гемодеза, основанного на высокополимерном ПВП. В настоящее время производится только гемодез-Н с молекулярной массой ПВП
Для корреспонденции:
Пупышев Александр Борисович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, руководитель биохимической группы Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России.
Адрес: 630091, Новосибирск, Красный проспект, д. 52. Телефон/факс: +7(383)226-35-60.
E-mail: apupyshev@mail.ru
12 600 Д. Именно поэтому важными требованиями к синтетическим плазмозаменителям являются их биоинертность, низкая распознаваемость контактирующими клетками и отсутствие клеточных ответов.
Декстран и ПВП — основные компоненты плазмозаменителей реополиглюкина и гемодеза соответственно. Они являются классическими субстратами/марке-рами жидкостного пиноцитоза [5, 6] и, как правило, не распознаются клетками, так как не связываются с их поверхностными рецепторами. Однако существуют и различия в поглощении декстрана и ПВП клетками. Если декстран накапливается как в макрофагах печени или клетках Купфера (КК), так и в гепатоцитах, то ПВП, по-видимому, захватывается преимущественно КК [7, 8]. Поглощение декстрана гепатоцитами в какой-то мере может быть обусловлено его низкородственным связыванием с рецепторами, специфичными к остаткам концевой галактозы [9]. Аналогично захват декстрана системой мононуклеарных фагоцитов (СМФ) может частично усиливаться благодаря связыванию с рецепторами, специфичными к концевой маннозе [10].
53
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 4
Рис. 1. Накопление АО (количество клеток в поле зрения микроскопа) в переживающих срезах печени крыс после введения in vivo декстрана и ПВП (M ± т).
Здесь и на рис. 2—5: * — p < 0,05 — вероятность по /-критерию Стьюдента.
Внутри клетки оба субстрата подвергаются везикулярному транспорту в лизосомы. Накопление ПВП и декстрана внутри лизосом происходит вследствие почти полной или очень высокой их устойчивости к внутрилизосомному перевариванию [11]. Однако взаимоотношения между их клеточной и субклеточной тропностью к лизосомам макрофагов, мерой распознавания этих субстратов неизвестными цитоплазматическими «сенсорами», с одной стороны, и индукцией клеточных ответов макрофагов и моноцитов, с другой — остаются неясными.
Цель настоящей экспериментальной работы — исследование динамики реакций лизосомного аппарата моноцитов/макрофагов и популяционных сдвигов СМФ при введении декстрана и ПВП. Для решения этой задачи оценивали их действие на накопительную способность кислого компартмента КК печени в отношении акридинового оранжевого (АО), реакцию лизосомных ферментов клеток печени, фагоцитарную и окислительную активность моноцитов крови, динамику популяционного ответа моноцитов крови и костного мозга.
Материалы и методы
Эксперименты выполнены на крысах линии Вистар массой тела 200—300 г. В качестве декстрана использовали реополиглюкин (молекулярная масса 30—40 кД) и ПВП (Loba Feinbiochemica, молекулярная масса около 24 кД). Препараты вводили в бедренную вену в дозе 50 мг
Рис. 2. Содержание моноцитов в крови крыс после введения декстрана и ПВП (M ± т).
на 1 кг массы тела. Животных декапитировали. Гомогенат печени готовили на 0,25 М растворе сахарозы, 1 мМ ЭДТА рН 7,4. Активность лизосомных ферментов кислой фосфатазы (КФ), р-галактозидазы (БГ), катепсина D и кислой РНКазы (КР) определяли по ранее описанной методике [12]. Накопление АО в переживающих срезах печени оценивали с помощью люминесцентной микроскопии [13]. Фагоцитарную активность моноцитов определяли после инкубации цельной крови (10 мин) с частицами стафилококка, содержащего протеин А, путем подсчета фагоцитирующих моноцитов (фагоцитарный индекс) и количества поглощенных частиц на клетку (фагоцитарное число). Окислительный стресс оценивали по хемилюминесценции цельной крови под действием частиц стафилококка, являющейся суммарной характеристикой моноцитов и нейтрофилов крови. Клеточный состав костного мозга подсчитывали после его суспендирования в 5% уксусной кислоте [14].
Статистическую обработку результатов выполняли с помощью /-критерия Стьюдента для малых выборок.
Результаты и обсуждение
При оценке накопления АО в переживающих срезах печени выявлено, что в основном накопление маркера происходит в лизосомах КК. При этом декстран рано (в 1-е сутки) стимулирует накопление АО (на 41%; рис. 1). При динамическом наблюдении за изменениями КК установлено, что они соотносятся с активностью лизосомных ферментов в клетках печени. Обнаружено (см. таблицу), что декстран вызывал раннее (1-е сутки) увеличение активности КФ (на 42%), превалирующей в гепатоцитах, и БГ
Активность лизосомных ферментов печени крыс после введения декстрана и ПВП (M ± т)
Воздействие Время после введения, дни Кислая РНКаза, нмоль • ч'1 • (мг белка)'1 Кислая фосфатаза, мкмоль • ч-1 • (мг белка)-1 р-Г алактозидаза, нмоль • ч-1 • (мг белка)-1 Катепсин D, (мкг азоказеина) • ч-1 • (мг белка)-1
Контроль — 0,41 ± 0,04 (15) 9,9 ± 0,2 (15) 56,5 ± 2,8 (15) 59,1 ± 3,4 (16)
Декстран i 0,41 ± 0,12 (3) 14 ± 0,8** (3) 85,8 ± 5** (3) 75 ± 4,6 (3)
3 0,35 ± 0,11 (3) 11,4 ± 0,7* (3) 49,1 ± 8,2 (3) 58,4 ± 3,8 (3)
7 0,38 ± 0,04 (5) 11,4 ± 0,4** (6) 53,4 ± 2,1 (6) 59,1 ± 4,1 (6)
ПВП i 0,35 ± 0,09 (5) 11 ± 0,5 (4) 75,8 ± 6,0 (5) 70,4 ± 6,0 (5)
3 0,42 ± 0,09 (3) 10,9 ± 0,7 (3) 68,6 ± 1,9 (3) 61,3 ± 7,8 (3)
7 0,35 ± 0,15 (4) 11,5 ± 0,4** (7) 62,5 ± 4,8 (7) 66,8 ± 8,9 (6)
Примечание. Вероятность по /-критерию Стьюдента: * —p < 0,05; ** — p < 0,01. В скобках — количество животных в серии.
54
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 4
а
о
5
У
Ф
О
X
Q.
Р
S
2
со
е
Рис. 3. Фагоцитарная активность моноцитов крови крыс после введения декстрана и ПВП (M ± m). а — фагоцитарный индекс (количество моноцитов, поглотивших частицы стафилококка, содержащие белок А, %); б — фагоцитарное число (количество поглощенных частиц стафилококка в расчете на 1 клетку).
(на 52 %), но не катепсина D или КР (три последних превалируют в синусоидальных клетках печени [15]). Эта активация БГ и рост числа КК с «активным» кислым компартментом (судя по захвату АО), по-видимому, отражают процессы стимуляции КК и, возможно, связаны с вкладом распознавания декстрана рецепторами концевой маннозы КК [10]. Следует отметить также, что активированные КК способны освобождать сигнальные факторы регуляции гемопоэза — колониестимулирующие факторы, эритропоэтин и др. [16, 17].
Рис. 4. Величина хемилюминесценции цельной крови (количество импульсов в 1 мин), индуцированной частицами стафилококка, у крыс после введения декстрана и ПВП (M ± m).
Рис. 5. Количество моноцитов в костном мозге крыс после введения декстрана и ПВП (M ± m).
В отличие от декстрана ПВП в 1-е сутки подавлял накопление АО в КК (см. рис. 1) и оказывал лишь небольшое раннее стимулирующее действие на активность БГ в печени (см. таблицу).
Декстран не вызывал выраженных ранних клеточных ответов моноцитов крови (рис. 2, 3, а), за исключением снижения фагоцитарного числа моноцитов (рис. 3, б). В то же время зарегистрировано стимулирующее действие декстрана на СМФ на 7-е сутки, особенно заметное по росту фагоцитарного индекса (см. рис. 3, а) и величине хемилюминесценции цельной крови, стимулируемой частицами стафилококка (рис. 4). Отсроченный эффект декстрана декстрана на СМФ побудил нас исследовать возможность стимуляции образования моноцитов в костном мозге, вероятно, под действием гемопоэзрегулирующих цитокинов КК [16, 17].
При исследовании клеточного состава костного мозга установлено, что под действием декстрана содержание моноцитов костного мозга существенно и волнообразно возрастало на 3-и сутки (рис. 5), что можно объяснить связью между ранним обнаружением признаков стимуляции декстраном КК (1-е сутки) и поздним (7-е сутки) ответом мононуклеарных фагоцитов крови в виде роста их фагоцитарной активности (см. рис. 2, 3) и стимулированной хемилюминесценции (см. рис. 4).
Выявленный эффект ПВП заключался в тенденции к уменьшению содержания в крови моноцитов (на 3-и и 7-е сутки) (см. рис. 2) и их фагоцитарной активности (см. рис. 3), но без угнетения стимулированной хемилюминесценции (см. рис. 4) или влияния на содержание моноцитов в костном мозге.
Итак, исследованные плазмозаменяющие препараты оказывают различное действие на СМФ. В 1-е сутки эффект декстрана связан, вероятно, со стимулирующим действием на КК, регистрируемым по накоплению АО и индукции БГ, характерной для синусоидальных клеток печени. Позднее (7-е сутки) проявляется позитивное воздействие на фагоцитарную активность моноцитов крови и их стимулированную хемилюминесценцию. Поскольку и то и другое активирующие воздействие на КК и моноциты крови разделено временными рамками и клеточной локализацией, мы предположили, что есть связующее звено, заключающееся в образовании «активированных» моноцитов в костном мозге. Пик увели-
55
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 4
Гематол. и трансфузиол., 2013, т. 58, № 4
чения числа моноцитов находится в промежуточной точке (3-и сутки). Скорее всего, декстран запускает следующую регуляторную цепочку СМФ: КК печени, моноциты миелоидного ростка костного мозга, моноциты крови.
При динамическом наблюдении за взаимодействием ПВП и лизосомным аппаратом моноцитов (макрофагов) обнаружено противоречивое действие. Во влиянии на СМФ превалировали депрессивные признаки (снижение накопления АО в КК, количества и фагоцитарной активности моноцитов крови), но при этом отмечен рост активности БГ в печени. Вероятно, ПВП оказывает негативное действие на КК и моноциты крови генерацией повреждающих продуктов из-за окислительной атаки ПВП внутри лизосом [18]. Наши данные совпадают с данными литературы [19] о сокращении популяции КК под действием ПВП. По-видимому, ПВП способен вызывать повреждение СМФ, несмотря на то что не распознается поверхностными рецепторами клеток СМФ, локализуется в эндолизосомном клеточном компартменте и трудно метаболизируется.
Таким образом, плазмозаменители на основе дек-страна и ПВП, накапливающиеся в лизосомах и способные вызывать проявления синдрома лизосомного накопления [1, 5, 8], оказывают различное действие на СМФ. Основное воздействие декстрана состоит в его раннем (1-е сутки) клеточном распознавании и ответе КК, сопровождающемся признаками поздней активации моноцитов крови (7-е сутки), вероятно, благодаря стимуляции новообразования моноцитов в костном мозге (3-и сутки). ПВП, напротив, оказывает депрессивное повреждающее действие на КК, что является неблагоприятным фактором при повторных трансфузиях.
REFERENCES [ЛИТЕРАТУРА]
1. Klotz U., Kroemer H. Clinical pharmacokinetic considerations in the use of plasma expanders. Clin. Pharmacokinet. 1987; 12(2): 123—35.
2. Bergonzi G., Paties C., Vassallo G., Zangrandi A., Poiset-ti P.G., Ballocchi S., et al. Dextran deposits in tissues of patients undergoing haemodialysis. Nephrol. Dial. Transplant. 1990; 5(1): 54—8.
3. BallabioA., Gieselmann V. Lysosomal disorders: from storage to cellular damage. Biochim. Biophys Acta. 2009; 1793(4): 684—96.
4. Huang W.C., Chang C.H., Tsai C.C. Polyvinylpyrrolidone storage disease presenting as pathologic fracture and anemia: report of a case with imprint cytology. Diagn. Cytopathol. 2012; 40(1): 69—72.
5. De Duve C., de Barsy T., Trouet A., Trouet A., Tulkens P., Van Hoof F. Lysosomotropic agents. Biochem. Pharmacol. 1974; 23(18): 2495—531.
6. LeSage G.D. Fluid-phase endocytosis. In: Tavoloni N., BerkP. V., eds. Hepatic transport and bile secretion: physiology and pathophysiology. New York: Raven Press; 1993: 501—15.
7. Meijer A.E., Willighagen R.G. The activity of glucoso-6-phos-phate adenosine triphosphatase, succinic dehydrogenase, and acid phosphatase after dextran of polyvinylpyrrolidone uptake by liver in vivo. Biochem. Pharmacol. 1963; 12: 973—80.
8. Praaning-van Dalen D.P., Brouwer A., Knook D.L. Clearance capacity of rat liver Kupffer, endothelial, and parenchymal cells. Gastroenterology. 1981; 81(6): 1036—84.
9. NishikawaM., Yamashita F., Takakura Y., HashidaM., Sezaki H. Demonstration of the receptor-mediated hepatic uptake of dex-tran in mice. J. Pharm. Pharmacol. 1992; 44(5): 396—401.
10. Noorman F., Barrett-Bergshoeff M.M., Bekkers M., Emeis J.J., Rijken D.C. Inhibition of mannose receptor-mediated clearance of tissue-type plasminogen activator (t-PA) by dextran: a new explanation for its antithrombotic effect. Thromb. Haematol. 1997; 78(4): 1249—54.
11. Vercauteren R., Schacht E., Duncan R. Effect of the chemical modification of dextran on the degradation by rat liver lysosomal enzymes. J. Bioactive Compatible Polym. 1992; 7(4): 346—54.
12. Pupyshev A.B., Malygin A.E., Korolenko T.A. The influence of suramin on cleavage of 14C-labeled albumin in heterolysosomes of subcellular fractions of rat liver (Vlijanie suramina na rassh-heplenie 14C-mechenogo albumina v geterolizosomah subklet-ochnyh frakcij pecheni krys). Biochemistry. 1981; 7: 1167—74. (in Russian)
[Пупышев А.Б., Малыгин А.Е., Короленко Т.А. Влияние сура-мина на расщепление 14С-меченого альбумина в гетеролизо-сомах субклеточных фракций печени крыс. Биохимия. 1981; 7: 1167—74].
13. Freidlin I.S. System of mononuclear phagocytes (Sistema mononuklearnyh fagocitov). Moscow: Medicine; 1984. (in Russian)
[Фрейдлин И.С. Система мононуклеарных фагоцитов. М.: Медицина; 1984].
14. GoldbergE.D., Dygaj A.M., Shakhov V.P. Methods of tissue culture in hematology (Metody kultury tkani v gematologii). No-vitskij V.V., ed. Tomsk: Izd-vo Tomsk state University; 1992. (in Russian)
[Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Новицкий В. В., ред. Томск: Изд-во Томского государственного университета; 1992].
15. Knook D.L., Sleyster E.C. Isolated parenchymal, Kupffer and endothelial rat liver cells characterized by their lysosomal enzyme contents. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980; 96(1): 250—7.
16. MayanskyA.N., MayanskyD.N. Essays on neutrophil and macrophage (Ocherki o nejtrofile i makrofage). Kaznacheev B.N., red. Novosibirsk: Nauka; 1989 V P. Kaznacheev, red. Novosibirsk: Nauka; 1989. (in Russian)
[Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Казначеев В.П., ред. Новосибирск: Наука; 1989].
17. Kmiec Z. Cooperation of liver cells in health and disease. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 2001; 161: III—XIII; 1—151.
18. Sutherland K., Mahoney J.R., Coury A.J., Eaton J.W. Degradation of biomaterials by phagocyte-derived oxidants. J. Clin. Invest. 1993; 92(5): 2360—7.
19. Gavrilin V.N., Shkurupij V.A., Vasylyev V.N. Morphometric study of rat liver after the introduction of polyvinylpyrrolidone. Bulletin of the Siberian Department of RAMS (Morfometricheskoe issledovanie pecheni krys posle vvedenija polivinilpirrolidona. Bjulleten Sibirskogo otdelenija RAMN.). 1988; 2: 56—9. (in Russian)
[Гаврилин В.Н., Шкурупий В.А., Васильев В.Н. Морфометрическое исследование печени крыс после введения поливи-нилпирролидона. Бюллетень Сибирского отделения РАМН. 1988; 2: 56—9].
Поступила 03.12.12
56
