CC BY
45
ИССЛЕДОВАНИЕ
Экспериментальное изучение специфической активности противодифтерийных препаратов Коливак и АД-М-анатоксин
■ Г.Я. Ценева1, В.В. Лебедева2, Е.А. Шмелева3, В.Е. Виноградова1, О.В. Перелыгина4, Л.А. Краева1, Е.Е. Шедеркина1
1 ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л. Пастера»
2 ФГУП «Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов»
3 ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского»
4 ФГУН «НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича», Москва
Введение
Борьба с дифтерийной инфекцией основывается на создании напряженного антитоксического иммунитета у населения. В то же время очевидно, что по-ствакцинальный антитоксический иммунитет, спасая от тяжелых, не защищает от легких форм заболевания, а также от носительства возбудителя [1].
В экспериментах было установлено, что вакцинация морских свинок малыми дозами анатоксина (от 0,5 до 1 1_0 с добавлением к ним клеточных стенок токсигенных или нетоксигенных коринебактерий дифтерии индуцирует у них образование гомологичных специфичных антител и повышает их резистентность к заражению живой культурой С. diphtheriae Ох+ [3].
На основе антигенов клеточных стенок нетокси-генного штамма коринебактерий дифтерии был разработан бактериальный препарат Кодивак (вакцина дифтерийная субклеточная) для коррекции антибактериального противодифтерийного иммунитета у длительных носителей возбудителя дифтерии [3]. Эффективность препарата подтверждена государственными клиническими испытаниями, получено разрешение Комитета МИБП на его внедрение в практику здравоохранения.
Цель настоящей работы: оценить безвредность, иммуногенные, а также антигенные свойства препарата Кодивак, а также Кодивака в сочетании с АЛ-М-анатоксином в производственных условиях на лабораторных животных в соответствии с требованиями ФСП на АЛ-М-анатоксин.
Материалы и методы
В работе использовали противодифтерийные препараты: АЛ-М-анатоксин (анатоксин дифтерийный очищенный, адсорбированный, с уменьшенным содержанием антигена, жидкий), изготовленный ФГУП «Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов»; экспериментально-производственную серию (е59) препарата Кодивак (вакцина дифтерийная субклеточная, лиофилизированный порошок для приготовления инъекционного раствора) Московского ГУП по производству бактерийных препаратов им. Г.Н. Габричевского.
Опыты проводили на морских свинках массой 300 - 350 г и белых мышах массой 17 - 20 г, полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.). Всего использовано 60 морских свинок и 30 мышей. Определение безвредности (специфической безопасности), токсичности, иммуногенносги (специфической активности) проводили в соответствии с фармакопейной статьей предприятия на АЛ-М-анатоксин.
Безвредность определяли при подкожном введении морским свинкам 10 прививочных доз (используемых для человека) АЛ-М-анатоксина и Кодивака (табл. 1). Препараты считали безопасными, если через 30 суток все животные оставались живыми и у них не отмечалось потери в массе тела.
Токсичность выявляли на белых мышах и морских свинках (см. табл. 1). Мышам вводили внутрибрю-шинно 2 человеческих дозы АЛ-М-анатоксина (10 1_А и 2 человеческих дозы Кодивака (6 мг), а морским
[Эпидемиология и Вакцинопрофилактика 26 (25)/2005
Эпидемиология и Вакиинопрофилактика <6 (25)/2005
ИГГЛ-ЛОВАЯИТ
Таблица 1.
Опрелеление специфической безопасности и токсичности лифтерийных препаратов *
Препараты Специфическая безопасность Токсичность
морские свинки мыши морские свинки
кол-во введение кол-во введение кол-во введение
подкожно, мл доза внутрибрю-шинно, мл доза подкожно, мл доза
АЛ-М-анатоксин 2 5 50 и 10 1,0 10 и 2 5 50 и
Кодивак 2 5 30 мг 10 1,0 6 мг 2 5 15 мг
Кодивак + АЛ-М-анатоксин 2 5 50 и + 30 мг 10 1,0 10 и + 6 мг 2 5 50 и + 15 мг
* Потери в массе тела животных и их гибели в течение 7 (токсичность) и 30 (безврелность) суток после ввеления препаратов не наблюлалось.
свинкам - подкожно по 10 человеческих доз АЛ-М-анатоксина (50 1_0 и по 5 человеческих доз (15 мг) Ко-дивака. Все животные после введения препаратов должны остаться живыми, прибавлять в весе, быть активными в поведении.
Иммуногенную (специфическую) активность определяли по показателю выживаемости предварительно иммунизированных подкожно животных (6 и анатоксина или 3 мг Кодивака) после введения им через 30 суток подкожно дифтерийного токсина в дозе 100 01_М (минимальная летальная доза) в 1,0 мл. За животными наблюдали в течение 7 суток. Все привитые АД-М-анатоксином животные должны остаться живыми. Контрольные (неиммунизированные) животные должны погибнуть в течение 5 суток (табл. 2).
Антигенные свойства препаратов контролировали на 25-й день после вакцинации путем определения в сыворотках крови иммунизированных животных специфических антител. Антитоксические антитела выявлялись с помощью РПГА с эритроцитарным диагностикумом предприятия «Микроанализ», Москва. Антитоксические и антибактериальные антитела определяли с помощью ИФА, разработанного в НИИЭМ им. Л. Пастера, Санкт-Петербург (табл. 3).
Таблица 2.
Опрелеление специфической активности лифтерийных препаратов
Кодивак и АЛ-М-анатоксин совместно вводили в виде жидкой смеси: АЛ-М-анатоксин добавляли в ампулу с лиофильно высушенным препаратом Кодивак.
Результаты и обсуждение
Результаты проведенных исследований по оценке безвредности и токсичности препаратов показали, что при подкожном и внутрибрюшинном введении в увеличенной дозе (10 человеческих доз) и объеме (5 мл) они не вызывали гибели животных, потери в массе, изменения поведенческих реакций (аппетит, подвижность и т.д.). В течение 7 и 30 суток наблюдения все животные оставались здоровыми, прибавляли в весе (см. табл. 1).
Сведения об иммуногенных свойствах изученных препаратов представлены в таблице 2. Иммунизация АЛ-М-анатоксином и АЛ-М-анатоксином вместе с Кодиваком защищала морских свинок от заражения 100 01_М дифтерийного токсина. Все животные остались живыми, здоровыми в течение 7 суток наблюдения. В контрольной группе от введения 1 01_М токсина к 3 - 5-м суткам наблюдения погибли все животные. В группе морских свинок, иммунизированных Кодиваком (без АЛ-М-анатоксина), после введения
Препараты Морские свинки
вакцинация, подкожно введение анатоксина, подкожно количество выживших животных
кол-во, шт. мл доза доза
АЛ-М-анатоксин 4 0,6 6 и 100 Э1_М 4
Кодивак 4 1,0 3 мг 100 Э1_М 0
Кодивак + АЛ-М-анатоксин 4 0,6 6 и + 3мг 100 Э1_М 4
Контроль (неиммунные) 3 - - 1,0 Э1_М 0
Таблица 3.
Антигенные свойства лифтерийных препаратов*
Препараты Морские свинки Специфические антитела
антитоксические антибактери- альные
кол-во, шт. подкожно, мл доза РПГА ИФА ИФА
АЛ-М-анатоксин 10 0,6 6 и 1,3 - 1,6 1,9 0
Кодивак 9 0,6 3 мг 0 0 2,5 - 2,8
Кодивак + АЛ-М-анатоксин 14 0,6 6 и + 3 мг 2,2 - 2,5 - 2,5 - 2,8
* Показатели антител прелставлены в логарифмах титра; забор сывороток на 25-и лень после ввеления препаратов.
ИГГЛЕЛС )ВЛНИТ
100 01_М токсина к 7-м суткам наблюдения также отмечена гибель всех животных.
Лифтерия - токсикоинфекция, и наличие определенного уровня антитоксина в крови оказывается достаточным, чтобы предохранить человека от заболевания. Экспериментальная модель для воспроизведения дифтерийного инфекционного процесса и его бессимптомной формы - бактерионосительства - отсутствует. Морские свинки являются классической моделью для создания только антитоксического иммунитета и антитоксической резистентности. В данной работе иммуногенные свойства препаратов характеризовались согласно требованиям ФСП на АЛ-М-анатоксин в опытах «прямой» защиты морских свинок в ответ на введение больших доз (100 01_М) дифтерийного токсина. Использование в эксперименте аналогичных доз для выявления специфической активности бактериальных препаратов является неоправданным, так как гибель всех животных заранее очевидна. Лля определения хотя бы потенциальной возможности участия бактериальных антигенов (Кодивак) в защите от токсина следовало бы вводить его в меньшей дозе, например в такой, которую использовали для животных контрольной группы, т.е. 1 01_М. Понятно, что для выявления иммуногенных свойств бактериальных препаратов более корректным является заражение экспериментальных животных живой культурой С. diphtheriae Ох+ [2, 3].
Изучение антигенных свойств Кодивака и Коди-вака вместе с АЛ-М-анатоксином подтвердило участие бактериальных антигенов в иммуногенезе дифтерийной инфекции [3]. В сыворотках животных, иммунизированных АЛ-М-анатоксином, определялись антитоксические антитела, антибактериальные антитела отсутствовали (см. табл. 3).
В сыворотках морских свинок, иммунизированных Кодиваком, выявлялись только антибактериальные антитела. Совместное введение животным Кодивака и АЛ-М-анатоксина вызывало образование как антитоксических, так и антибактериальных антител, при этом зарегистрированы более высокие показатели антитоксина в крови.
Таким образом, накопленные за последние годы данные о том, что в условиях массовой иммунизации населения дифтерийным анатоксином продолжается беспрепятственная циркуляция С. diphtheriael обусловили необходимость изучения не только антитоксического, но и антибактериального иммунитета. Настоящее исследование проведено в услови-
ях предприятия по производству бактериальных препаратов. К сожалению, в этих экспериментах не удалось продемонстрировать иммуногенные свойства бактериального препарата Кодивак из-за неадекватности проявления на модели морских свинок антибактериальной защиты (активности)на введение дифтерийного токсина. Однако особый интерес представляют сведения об антигенных свойствах Кодивака. Так, под влиянием монопрепаратов (Кодивака и АЛ-М-анатоксина в отдельности) у морских свинок образуются гомологичные противодифтерийные антибактериальные и антитоксические антитела. При совместном введении Кодивака и АЛ-М-анатоксина синтез антибактериальных антител не угнетался, а продукция антитоксических антител усиливалась. Этот феномен, продемонстрированный на животных, определяет перспективность использования в дальнейшем Кодивака вместе с малыми дозами анатоксина для иммунизации людей.
Выводы
1. На морских свинках и мышах показаны специфическая безопасность и атоксичность противодифтерийных препаратов Кодивак и Кодивак вместе с АЛ-М-анатоксином.
2. В сыворотках крови морских свинок после введения Кодивака определяются противодифтерийные антибактериальные антитела.
3. Совместное введение животным Кодивака и АЛ-М-анатоксина стимулирует образование у них как антибактериальных, так и антитоксических антител.
4. Специфическая активность Кодивака вместе с АЛ-М-анатоксином соответствует специфической активности одного АЛ-М-анатоксина, т.е. присоединение к АЛ-М-анатоксину Кодивака не снижает протективной активности первого.
Литература
1. Маркина С.С., Максимова Н.М., Лазикова Г.Ф. Заболеваемость дифтерией в России в настоящее время // Журн. ми-кробиол. 2005. <1. С. 31 - 37.
2. Шмелева Е.А., Мазурова И.К., Бочкова В.А., Филиппова Л.М. Сравнительное изучение иммуногенных свойств трех антигенных препаратов из дифтерийного микроба // Журн. микробиол. 1975. <7. С. 122 - 125.
3. Шмелева Е.А. Биологическая функция антигенов клеточной стенки С. diphtheriae и научно-производственная разработка иммуномодулирующего препарата Кодивак / Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М., 1991.
[Эпидемиология и Вакцинопрофилактика 26 (25)/2005
