CC BY
98
ПРЕПАРАТЫ
s
й
2
U
Q)
•Q
I
4
с;
се
1
IE
5
Доклинические исследования новой пятикомпонентной Вакцины АКДС-ГЕП В+ХИБ
Николаева А.М., Петровских В.П., Соснина О.Ю., Белякова О.В., Вязникова Т.В., Афанасьева Т.М.
Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед», г. Пермь
Preclinical research of the new pentavalent DTP-HBV+HIB (Haemophilus influenzae type b) vaccine
Nikolaeva A.M., Petrovskikh V.P., Sosnina O.Yu., Belyakova O.V., Vyaznikova T.V., Afanasyeva T.M.
«Biomed» - Perm Branch of the Federal State Unitary Company "Microgen", of the Ministry of Health of the Russian Federation, Perm
К
Проведены доклинические исследования новой пятикомпонентной вакцины против коклюша, дифтерии, столбняка, гепатита В, гемофильной инфекции тип b (вакцины АКДС-Геп В+ХИБ) производства ФГУП НПО «Микроген». Установлено, что вакцина не обладает токсическими свойствами и формирует напряженный иммунитет в отношении всех компонентов, входящих в ее состав.
Ключевые слова: вакцина, доклинические исследования, острая и хроническая токсичность, специфическая активность.
Библиографическое описание: Николаева А.М., Петровских В.П., Соснина О.Ю., Белякова О.В., Вязникова Т.В., Афанасьева Т.М. Доклинические исследования новой пятикомпонентной Вакцины АКДС-ГЕП В+ХИБ// Биопрепараты. 2013. № 3. С. 41-44.
Preclinical research of the new pentavalent vaccine against pertussis, diphtheria, tetanus, hepatitis B, haemophilus influenzae type b (DTP-HBV+HIB) developed at FSUC «Microgen» has been carried out. It has been demonstrated that the vaccine doesn’t possess toxicity properties and provides a strong immune response to each antigen comprising the vaccine.
Key words: vaccine, preclinical research, acute and chronic toxicity, specific activity.
Bibliographical entry: Nikolaeva A.M., Petrovskikh V.P., Sosnina O.Yu., Belyakova O.V., Vyaznikova T.V., Afanasyeva T.M. Preclinical research of the new pentavalent DTP-HBV+HIB (Haemophilus influenzae type b) vaccine//Biopreparations. 2013. № 3. P. 41-44.
Для корреспонденции:
Николаева А.М. - заместитель директора по науке и инновационному развитию филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед».
Адрес: 614089, г Пермь, ул. Братская, 177 e-mail: a.m.nikolaeva@perm.microgen.ru
Статья поступила 05.04.2013 г., принята к печати 22.08.2013 г
Разработка комбинированных вакцин является приоритетным направлением современной вакционологии. Комбинированные вакцины, включающие цельноклеточный антиген Bordetella pertussis, дифтерийный и столбнячный анатоксины занимают центральное место в Расширенной программе иммунизации ВОЗ. Включение новых антигенов в существующие комбинированные вакцины позволяет не только уменьшить стрессовую нагрузку на прививаемых, но и более успешно реализовать про-
ведение вакцинации в сроки, определенные календарем прививок, снизить загруженность медицинских работников и соответственно уменьшить стоимость программ иммунизации. Тем не менее, важно иметь доказательства, что комбинированное введение нескольких вакцинных антигенов не снижает безопасность и эффективность иммунизации по сравнению с их введением по отдельности [3].
Цель работы: разработка и проведение лабораторно-экспериментального (доклинического) иссле-
С41
дования иммунобиологических свойств новой пятикомпонентной вакцины против коклюша, дифтерии, столбняка, гепатита В и гемофильной инфекции тип Ь (вакцины АКДС-Геп В+ХИБ).
Материалы и методы
При конструировании комбинированных вакцин были использованы следующие препараты: анатоксин дифтерийный очищенный концентрированный (ФСП №002161-060612), анатоксин столбнячный очищенный концентрированный (ФСП Р№001040/01-060712), нативная коклюшная суспензия (ФСП №42-8909-07) производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России Пермское НПО «Биомед»; поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) и синтетический поли-рибозилрибитолфосфат, конъюгированный со столбнячным анатоксином, производства Эбер Биотек, Куба.
В качестве препаратов сравнения использовали вакцины: АКДС и АКДС-Геп В (Пермское НПО «Биомед»); моновакцины против ХИБ инфекции - АКТ-ХИБ (Сано-фи Пастер, Франция) и Кими-ХИБ (Эбер Биотек, Куба).
Экспериментальные исследования выполнены на 72 белых беспородных крысах массой 160-220 г, 312 морских свинках массой 250-350 г 40 кроликах шиншилла массой 2,0-2,5 кг, 390 мышах белых беспородных массой 16-18 г 340 мышах гибридах F1 (C57BL/6JxCBA) массой 10-12 г, 365 мышах линии BALB/c массой 12-14 г.
Опыты по исследованию токсичности препарата проводили согласно действующим методическим документам [1, 4-6]. Общетоксическое действие пентавакцины исследовали на крысах и морских свинках.
Препарат вводили в дозе, эквивалентной предлагаемой для человека в пересчете на 1 кг массы животного. Исходя из дозы для ребенка 0,5 мл на 7 кг: 1 доза для крысы составила 40,9 мкл/190 г кр., 1 доза для морской свинки - 63,6 мкл/300 г м.св.
Для изучения острой токсичности крысам вводили испытуемый препарат внутримышечно однократно в объеме 5 мл (120 доз), морским свинкам - однократно в объеме 5 мл (80 доз). Животным контрольной группы водили внутримышечно аналогичное количество 0,9% раствора натрия хлорида
В опыте хронической токсичности - внутримышечно по одной дозе в течение 10 сут. Контрольным животным вводили в том же количестве физиологический раствор. Наблюдение за животными при изучении острой токсичности вели в течение 14 суток, при хронической -в течение 31 суток. Ежедневно регистрировали следующие показатели: гибель животных, их вес, наличие или отсутствие клинических симптомов интоксикации. Через 24 часа, 7 суток и 14 суток (21 сутки для хронической токсичности) после последнего введения препарата у 6 крыс (3 самцов и 3 самок) и 12 морских свинок (6 самцов и 6 самок) из опытных и контрольных групп отбирали кровь для определения биохимических и гематологических показателей, затем животных подвергали эвтаназии. Патоморфологическое исследование включало в себя макроскопическое и гистологическое исследование внутренних органов. Для проведения ги-
стологических исследований фиксировали следующие органы: головной мозг, сердце, печень, селезенку, почки, надпочечники, тимус, лимфатические узлы (паховый, брыжеечный).
Определение иммуногенности компонентов вакцин (дифтерийного, столбнячного, коклюшного и гепатитного), контроль безвредности комбинированных вакцин на белых мышах и морских свинках, определение полноты сорбции компонентов комбинированных вакцин проводили в соответствии с действующими фармакопейными статьями на АКДС и АКДС-Геп В вакцины.
Иммуногенную активность ХИБ-компонента оценивали в опытах на кроликах. Иммунизацию проводили двукратно в дозе 0,5 мл внутримышечно с интервалом
14 суток. Отбор сывороток осуществляли до иммунизации, перед второй иммунизацией и на 7 сутки после второй иммунизации. Определение антител к полисахариду H. influenzae тип b проводили с помощью тест-системы «Rabbit Anti-Haemophilus influenzae type b IgG ELISA Assay» («XpressBio», США), в которой в качестве положительного контроля использовали кроличью сыворотку, откалиброванную нами относительно международного стандарта Anti-ХИБ Human Reference Serum (NIBSC, 96/536). Кроме того, в сыворотках иммунизированных кроликов титр специфических антител определяли для каждого антигена, входящего в состав вакцин, методом иммуноферментного анализа (ИФА): к коклюшным антигенам Bordetella pertussis, дифтерийному и столбнячному анатоксинам с помощью тест-систем (НПО «Биомед», г. Пермь) с использованием коммерческого конъюгата анти-IgG кролика (SDT, Германия); анти-HBs с помощью тест-системы «Микрат Анти-HBs» («Имбио», Н-Новгород).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов описательной статистики. Достоверность различий между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. В работе использовали пакеты статистических программ MS Excel, «DIASTA» (МГУ, Россия), программу статистической обработки результатов ИФА методом параллельных линий, программу «Биостат».
Результаты и обсуждение
Комбинированные вакцины представляют собой препараты, состоящие из двух или более различных иммуногенов, скомбинированных в одной лекарственной форме. Трудности создания сложной вакцины связаны, прежде всего, с решением проблем совместимости ее компонентов, стабильности и сохранения достаточной иммуногенности препарата. Иммуногенная активность компонентов сложных вакцин может зависеть от многих факторов: методов изготовления компонентов, качественных характеристик адъювантов, консервантов, стабилизаторов. Кроме того, химическое или физическое взаимодействие между компонентами вакцины может привести к нарушению иммунного ответа на них.
Представлялось целесообразным изучить совместимость синтетического ХИБ-компонента с составляющими вакцины АКДС-Геп В. Конструирование
ПРЕПАРАТЫ
Таблица 1. Иммунный ответ на компоненты экспериментальных серий комбинированных вакцин в опытах на кроликах (средняя геометрическая титра)
Компоненты вакцин
Наименование препарата Дифтерийный, МЕ/мл Столбнячный, МЕ/мл Коклюшный, ИЕ/мл** Гепатитный, мМЕ/мл Гемофильный, мкг/мл
АКДС-Геп В+ ХИБ 3,5 2,4-5,1 3,6 2,5-5,3 608,2 350,2-1056,4 1442,5 590,7-3522,4 58,1 29,3-115,2
АКДС+ ХИБ 2,5 1,4-4,4 2,7 1,8-4,1 694,3 295,0-1633,6 - 72,4 49,7-105,3
АКДС* 2,7 1,6-4,5 2,4 1,5-3,8 761,2 382,4-1515,1 - -
АКДС-Геп В* 2,5 1,8-3,6 2,9 1,8-4,7 855,9 615,5-1190,3 867,1 235,7-3190,1 -
Кими-ХИБ, лиофилизиро-ванная форма - - - - 12,4 4,8-32,2
АКТ-ХИБ* - - - - 18,2 1,0-97,5
Кими-ХИБ* - - - - 15,3 7,3-32,0
*Препараты сравнения.
**Условные иммуноферментные единицы.
пятивалентной вакцины АКДС-Геп В+ХИБ проводили, исходя из мирового опыта, т.е. предварительно была разработана технология получения лиофилизирован-ной ХИБ-вакцины, для которой в качестве растворителя использовали вакцину АКДС-Геп В, безопасность и эффективность которой была подтверждена нами ранее [2].
Одна доза вакцины после приготовления содержала
15 Lf дифтерийного анатоксина, 5 Lf столбнячного анатоксина, 10 млрд. коклюшных бактерий2, 5 мкг HBsAg, 10 мкг полирибозилрибитола фосфата, конъюгированного со столбнячным анатоксином, а так же вспомогательные вещества: алюминия гидроксид, формальдегид, тиомерсал, сахарозу, натрия хлорид, однозамещенный натрия фосфат, двузамещенный натрия фосфат.
Результаты изучения совместимости ХИБ-
1 Здесь и далее мутность микробной взвеси определяют по от-
калиброванному в международных единицах референс-препарату
мутности. 1 МЕ условно принята за 1 млрд. коклюшных бактерий.
компонента с компонентами АКДС-Геп В вакцины представлены в таблице 1.
Из представленных данных видно, что введение в состав комбинированных вакцин ХИБ-компонента ни в одном из изученных вариантов не приводило к снижению гуморального иммунного ответа на дифтерийный, столбнячный, коклюшный и гепатитный компоненты. В случае использования комбинированных вакцин, содержащих ХИБ-компонент, наблюдался более высокий уровень антител к полисахариду H. influenzae тип b по сравнению с моновакцинами против ХИБ-инфекции.
Таким образом, была продемонстрирована полная иммунологическая совместимость компонентов дифтерийного, столбнячного, коклюшного, гепатитного и ХИБ компонентов в составе предлагаемых комбинированных вакцин АКДС+ХИБ и АКДС-ГепВ+ХИБ.
Одним из важнейших этапов доклинической оценки новых вакцинных препаратов является изучение их безопасности. В связи с этим целью следующего этапа работы явилось изучение острой и хронической ток-
Таблица 2. Динамика изменения веса лабораторных животных при изучении острой и хронической токсичности вакцины АКДС-Геп В+ХИБ
Время наблюдения Крысы Морские свинки
Опыт Контроль Опыт Контроль
Острая токсичность
24 ч 183,8±10,2 183,6±11,3 286,25±24,75 289,16±19,55
7 сут 194,2±20,1 225,0±20,7 325,85±17,9 320,85±18,05
14 сут 206,3±46,4 231,7±19,9 334,5±30,4 352,1±29,25
Хроническая токсичность
24 ч 224,2±28,7 226,7±25,0 326,5±27,4 327,05±33,1
7 сут 234,2±34,6 229,2±38,3 372,9±21,5 357,5±32,7
21 сут 274,2±48,8 276,7±47,5 404,15±28,05 424,55±25,0
Примечание. Достоверных отличий между опытом и контролем не было (р>0,05).
О3
Таблица 3. Результаты изучения иммуногенных свойств экспериментальных серий комбинированных вакцин в опытах на животных
Наименование Компоненты
препарата Дифтерийный, МЕ/мл (> 60 МЕ/мл)* Столбнячный, МЕ/мл (а 120 МЕ/мл)* Коклюшный, МЕ/мл (а 8 МЕ/мл)* Гепатитный, относительная потенция (а 0,5)* Гемофильный, % сероконверсии (а 50)*
АКДС 132,0 245,5 13,6 - -
АКДС+ ХИБ 100,0 283,9 11,4 - 100
АКДС-Геп В + ХИБ 93,3 206,2 13,0 1,7 100
АКДС-Геп В 123,13 228,2 10,89 1,09 -
*Требования ВОЗ.
сичности вакцины АКДС-Геп В+ХИБ.
При изучении пятикомпонентной вакцины АКДС-Геп В+ХИБ в тестах острой и хронической токсичности не наблюдалось снижения массы тела (табл. 2), гибели животных, изменения поведенческой и двигательной активности.
Патологических изменений внутренних органов и значимых изменений биохимических и гематологических показателей крови не выявлено, что свидетельствует об отсутствии токсического действия препарата.
Проведенные исследования, доказавшие безопасность и эффективность вакцины АКДС-Геп В+ХИБ в отношении формирования гуморального иммунитета, послужили основанием для разработки технологии ее изготовления и оформления проектов нормативно-технической документации (регламент производства, ФСП).
В производственных условиях по разработанной технологии приготовлено 3 серии вакцины АКДС-Геп В+ХИБ.
Изучение физико-химических свойств, стерильности, специфической безвредности, подлинности и специфической безопасности, иммуногенности (табл. 3) показало, что пятикомпонентная вакцина АКДС-Геп В+ХИБ для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша, гепатита В и гемофильной инфекции тип Ь, полученная в производственных условиях, полностью соответствует требованиям, предъявляемым к препаратам такого класса отечественными нормативными документами и ВОЗ [7-9].
Таким образом, проведенные доклинические исследования показали, что пентавакцина АКДС-Геп В+ХИБ безопасна, обладает выраженными иммуногенными свойствами и может быть рекомендована для клинического изучения.
Литература:
1. Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических препаратов». М. 2010.
2. Николаева А.М. Конструирование комбинированных вакцин и иммуноферментных тест-систем для профилактики и диагностики управляемых инфекций (дифтерия, столбняк, коклюш, гепатит В): ав-тореф. дис.... докт. биол. наук. Ч. 2003. 43 с.
3. Плоткин С. Вакцина АбКДС-ИПВ//PRP~T: обзор 16-летнего опыта клинического применения //Вопросы современной педиатрии. 2012. № 1. С. 1836.
4. РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения». М. 1989.
5. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ Минздрава РФ / Под общей редакцией чл.-корр. РАМН, проф. Хабриева Р.У. М. 2005.
6. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая. М.: Гриф и К, 2012. 536 с.
7. Diphtheria, tetanus and pertussis (adsorbed) // European Pharmacopeia, 6th Edition, 2008 P. 768769;
8. Haemophilus influenzae type b conjugate //European Pharmacopeia, 6th Edition. 2008. P. 792-794;
9. Hepatitis B vaccine (rDNA)//European Pharmacopeia, 6th Edition, 2008. P. 800-801.
