CC BY
43
j§ Разработка тест-набора для определения
{2 дифтерийного, столбнячного и коклюшных
ф антигенов в реакции коагглютинации
| и его экспериментальная оценка
-о
^ Калашникова Е.А., Николаева А.М., Сперанская В.Н., Соснина О.Ю.
5 Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед», г. Пермь
5
s The development and experimental
о evaluation of the test kit for detection
of diphtheria, tetanus and pertussis antigens in the coagglutination test
Kalashnikova E.A., Nikolaeva A.M., Speranskaya V.N., Sosnina O.Yu.
«Biomed» - Perm Branch of the Federal State Unitary Company "Microgen", of the Ministry of Health of the Russian Federation, Perm
Представлены данные по разработке тест-набора для определения дифтерийного, столбнячного и коклюшных антигенов в реакции коагглютинации, включающего окрашенные диа-гностикумы на основе бактериально-клеточного реагента с белком А и аффинноочищенных антител. Определены основные валидационные характеристики набора реагентов. Показана возможность применения тест-набора для контроля подлинности, полноты сорбции и содержания антигенов в вакцинных препаратах.
Ключевые слова: коагглютинация, белок А, диагностикумы дифтерийный, столбнячный, коклюшный, комбинированные и конъюгированные вакцины.
Библиографическое описание: Калашникова Е.А., Николаева А.М., Сперанская В.Н., Соснина О.Ю. Разработка тест-набора для определения дифтерийного, столбнячного и коклюшных антигенов в реакции коагглютинации и его экспериментальная оценка // Биопрепараты. 2013. № 4. С. 18-23.
The article presents the data on the development of the Test Kit for the detection of diphtheria, tetanus and pertussis antigens in the coagglutination test. The Kit comprises colored diagnostic preparations based on staphylococcal reagent containing protein A and affinity-purified antibodies. The main validation characteristics of the Test Kit have been evaluated. The study demonstrates a possibility of using the Test Kit for identification, detecting completeness of sorption and antigen content in vaccines.
Key words: coagglutination, protein A, diphtheria, tetanus and pertussis diagnostic preparations, combined and conjugated vaccines.
Bibliographic description: Kalashnikova E.A., Nikolaeva A.M., Speranskaya V.N., Sosnina O.Yu. Development and experimental evaluation of the test kit for identifying diphtheria, tetanus and pertussis antigens in the coagglutination test The development and experimental evaluation of the test kit for detection of diphtheria, tetanus and pertussis antigens in the coagglutination test // Biopreparation (Biopharmaceuticals). 2013. № 4. P. 18-23.
Для корреспонденции:
Николаева А.М. - зам. директора по науке и инновационному развитию Филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед». Адрес: 614089, г Пермь, ул. Братская, 177 e-mail: a.m.nikolaeva@perm.microgen.ru
Статья поступила 05.04.2013 г, принята к печати 20.08.2013 г
ПРЕПАРАТЫ
Серологический анализ, с помощью которого осуществляется специфическая детекция антигенов и антител, широко используется в лабораторной диагностике и в научных исследованиях. Вместе с тем, в производстве вакцинных препаратов набор применяемых серологических методов очень ограничен. Традиционно используется реакция флоккуляции при получении анатоксинных компонентов вакцин и реакция агглютинации для оценки коклюшного компонента. Очень широко в производственной практике применяются методы титрования на животных. В то же время при изготовлении важнейших вакцинных препаратов необходимо постоянное слежение за специфическим продуктом, поэтому задача расширения возможностей иммуноспецифической детекции бактериальных антигенов является весьма актуальной. Очевидно, что эти методы должны быть высокочувствительными, оперативными, экспрессными, экономичными, легко выполнимыми в условиях реального производства. Одним их таких методов является реакция коагглютинации (РКОА). По данным литературы коагглютинационные препараты разработаны для идентификации большой группы микроорганизмов [1-7, 9]. В частности, шведской фирмой «MKL Diagnostics AB» выпускаются наборы Phadebact для определения стрептококков, сальмонелл, пневмококков, гемофильной палочки, стафилококков, менингококков и ряда возбудителей других инфекций.
Цель работы - разработка тест-набора для определения дифтерийного, столбнячного и коклюшных антигенов в реакции коагглютинации и оценка возможности его применения в технологии получения вакцинных препаратов.
Материалы и методы
В экспериментах по приготовлению диагностикумов применяли стафилококковый бактериально-клеточный реагент (БКР), содержащий белок А, приготовленный по оригинальной технологии, разработанной в Филиале ФГУП «НПО Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед». Для иммунизации кроликов, иммуноглобулины которых обладают высоким сродством к белку А [8], использовали дифтерийный (ОКДА), столбнячный анатоксины (ОКСА) и коклюшную суспензию (КС). При выделении антител применяли антигенные сорбенты на основе цианбромированной сефаро-зы. Специфическую активность антител определяли в реакциях флоккуляции и ИФА. Специфическую активность антигенов оценивали в реакции флоккуляции. РКОА для определения антигенов выполняли в капельном варианте по типу микроагглютинации на стекле, используя разведения исследуемого материала. Результаты учитывали в пределах 5-10 мин визуально по образованию агглютинатов. Реакцию оценивали по четырехкрестной системе. Определение компонентов в исследуемых препаратах проводили в сравнении с контрольными образцами. Содержание антигенов в препаратах рассчитывали по следующей формуле:
Y = X х Z,
где Y - содержание определяемого компонента;
X - знаменатель последнего двукратного разведения исследуемого материала, в котором наблюдалась положительная реакция;
Z - показатель чувствительности диагностикума.
Результаты и обсуждение
При выполнении работы по конструированию ко-агглютинационных диагностикумов использовали экспериментально-производственные серии стафилококкового бактериально-клеточного реагента. Специфическую основу таких диагностикумов составляют иммуноглобулины, фиксированные на белке А стафилококка штамма Cowan I. При этом антительная молекула соединяется с поверхностным белком А через Fc-фрагмент, а Fab-фрагменты остаются свободными, приобретая пространственную ориентацию, благоприятную для связывания гомологичного антигена. При получении диагностикумов для реакции коагглютинации по классической технологии используют нативные иммунные сыворотки. Известно, что в нативных сыворотках антитела заданной специфичности составляют около 20% от общего количества иммуноглобулинов. Поэтому и на поверхности клеток стафилококка они будут фиксироваться в эквивалентной дозе. Следовательно, повысить информативность теста можно при использовании для сенсибилизации стафилококковых клеток иммуноглобулинов одной специфичности - аф-финноочищенных антител.
В связи с этим нами были выполнены исследования по выделению высокоочищенных специфических иммуноглобулинов с помощью аффинной хроматографии из противодифтерийной, противостолбнячной и противококлюшной кроличьих сывороток. В предварительных модельных экспериментах с дифтерийными гипериммунными сыворотками было установлено, что иммуносорбент на основе цианбромированной сефа-розы 4В оказался наиболее пригодным для выделения антител (выход 30-40%), в том числе и из относительно низкотитровых сывороток, при этом сорбент на основе геля гидроксида алюминия обеспечивал выход антител около 10%. Поэтому в последующих экспериментах в качестве матрицы использовали цианбромированную сефарозу 4В.
В качестве лигандов применяли производственные серии очищенных концентрированных анатоксинов (ОКДА, ОКСА) и комплекс коклюшных антигенов. В данных опытах степень связывания использованных антигенов с цианбромированной сефарозой 4В не превышала 50-60%. С целью получения более емких сорбентов в дальнейших экспериментах проводили дополнительную очистку антигенов путем изоосаждения. Показано, что предварительное изоосаждение антигенов обеспечивало повышение уровня связывания с матрицей до 95-98%.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработана оптимальная схема иммуноаффин-ного выделения специфических антител из гиперим-мунных кроличьих сывороток, включающая следующие
С9
Специфичность № сыво- Удельная активность исходной Удельная активность аффинноочищен- Коэффициент
ротки сыворотки, мМЕ/мг белка ных антител, мМЕ/мг белка очистки
1 1020 22700 22
2 1200 27000 23
3 1100 25000 23
Противодифтерийные 4 1380 27000 20
5 550 28000 50
6 570 33000 58
7 430 17000 40
8 350 14300 40
M + m 825,0+394,0 24250+6100,0 34,5+14,6
1 840 22700 27
2 1010 27000 27
3 1280 29000 23
Противостолбнячные 4 1030 23000 22
5 600 21000 35
б 1350 28600 21
7 450 12500 27
8 590 17400 28
M + m 894,0+310,0 22650+5340,0 26,3+4,2
УИЕ* на 1 мг белка УИЕ на 1 мг белка
1 6153,8 68922,7 11,2
2 5970,3 63285,2 10,6
3 5556,0 53893,2 9,7
Противококлюшные 4 5128,2 62051,2 12,1
5 5714,3 60000,2 10,5
б 6349,0 55236,3 8,7
7 6259,0 56956,9 9,1
8 6061,0 52730,7 8,7
M+m 5899,0+409,6 59134,5+5486,5 10,08+1,24
*УИЕ - условные иммуноферментные единицы.
этапы: получение гипериммунной сыворотки, подготовка сефарозной матрицы, иммобилизация лиганда, иммуносорбция, отмывание комплекса сефароза-анти-ген-антитело от неспецифических белков сыворотки, элюция антител. Предложенная схема позволила увеличить удельную активность очищенных дифтерийных и столбнячных антител по сравнению с исходной сывороткой в 20-50 раз, коклюшных - в 10-12 раз (табл. 1). Кроме того, высокая степень очистки и монофракционность выделенных антител была подтверждена методами гель-хроматографии на ультрагеле АсА-44 и высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Su-perdex 200 10/300 GL. Из представленных данных видно, что разработанная технология обеспечивает получение аффинноочищенных антител с высокой удельной активностью, что позволило использовать их при конструировании коагглютинационных диагностикумов.
В дальнейших исследованиях были отработаны условия приготовления специфических коагглютинационных препаратов. Для этого нами проведен ряд
экспериментов по подбору концентрации кроличьих противодифтерийных, противостолбнячных и противо-коклюшных аффинноочищенных антител, обеспечивающей максимально возможное насыщение рецепторного аппарата стафилококковых клеток. Показано, что оптимальная концентрация антител для конструирования диагностикумов в зависимости от их удельной активности составляла 0,7-1,8 мг по белку на 1 мл 10% суспензии БКР Полученые диагностикумы обладали гомогенностью, а при их взаимодействии с гомологичными антигенами наблюдалось быстрое формирование агглютинатов.
При разработке тест-набора нами были учтены современные тенденции по цветовой идентификации реагентов набора, обеспечивающие удобство работы потребителя и оптимизацию учета результатов реакции с использованием диагностикумов различной специфичности. На данном этапе работы были проведены исследования по окрашиванию стафилококкового БКР: подбору красителей и отработке вариантов окраски.
го
ПРЕПАРАТЫ
№ п/п Наименование образца Серия Результаты тестирования тест-набора
Серия 4 Серия 5
ДД ДС ДК ДД ДС ДК
1 2 3 6 7 8 9 10 11
1 Инфанрикс, компания «ГлаксоСмитКляйнБайолоджикалзс.а.», Бельгия 18050711 + + + + + +
2 Вакцина для профилактики инфекций, вызываемых Haemophilus influenzae типа b, конъюгированной синтетической (Кими-Хиб), Центр Генной Инженерии и Биотехнологии, Куба 9H1201/0 - + - - + -
3 Вакцина АКДС-Геп В* П1 + + + + + +
4 Экспериментально-производственная серия вакцины аАКДС* П3 + + + + + +
5 АДС-М-анатоксин* П39 + + - + + -
6 АД-М-анатоксин* П59 + - - + - -
7 АС-анатоксин* П42 - + - - + -
8 АКДС-вакцина* П23 + + + + + +
9 Экспериментально-производственная серия лиофилизированной вакцины для профилактики инфекций, вызываемых Haemophilus influenzae типа b, конъюгированной синтетической* П1 - + - - + -
10 АКТ-ХИБ, «Санофи Пастер С.А.», Франция G1012-2 - + - - + -
11 Пентаксим, «Санофи Пастер С.А.», Франция H2240-1 + + + + + +
12 Гриппол * У70 - - - - - -
13 Вакцина гепатита В рекомбинантная дрожжевая суспензия для внутримышечного введения, ЗАО «Комбиотех», Россия 005-0710 - - - - - -
14 Энджерикс В, компания «ГлаксоСмитКляйнБайолоджикалзс.а.», Бельгия 30141211 - - - - - -
15 Хаврикс, компания «ГлаксоСмитКляйнБайолоджикалзс.а.», Бельгия 70080411 - - - - - -
16 Вакцина против краснухи культуральная живая аттенуированнаяли-офилизат для приготовления раствора для подкожного введения, 1 доза - 0,5 мл* М412 - - - - - -
17 Экспериментально-производственная серия бесклеточной коклюшной вакцины* 19 - - + - - +
18 20 - - + - - +
19 21 - - + - - +
Примечание. (+) - положительная реакция (реакция не менее чем на три креста);
(-) - отрицательная реакция.
*Препараты производства Филиала ФГУП «НПО Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед».
В качестве красителей применяли окрашивающие агенты из анилиновой группы с контрастными цветами: сафранин, метиленовый синий, бриллиантовый зеленый. Наиболее удовлетворительные результаты были получены при окраске стафилококковых клеток 1-2% раствором красителя, приготовленным на гипотоническом растворе (20 мМ фосфата натрия и 20 мМ бикарбоната натрия). После перемешивания суспензии с раствором красителя смесь кратковременно прогревали на кипящей водяной бане, охлаждали и добавляли глутаровый альдегид до конечной концентрации его в
смеси 0,01%. Затем для предотвращения возможной агрегации микробных клеток добавляли 0,1 М трис-НС1-буферный раствор, рН (8,0 ± 0,1).
Далее на основе окрашенного БКР и полученных антител были приготовлены диагностикумы для выявления дифтерийного, столбнячного анатоксинов и коклюшных антигенов. Полученные окрашенные диагностикумы обладали чувствительностью такой же, как и реагенты, приготовленные на неокрашенной суспензии. Для контроля специфичности диагностикумов использовали контрольные положительные образцы дифтерийного
О1
№ п/п Наименование образца Серия Результаты тестирования тест-набора
Серия 4 Серия 5
ДД, Lf /мл ДС, Lf /мл ДК, КЕ/мл ДД, Lf /мл ДС, Lf /мл ДК, КЕ/мл
1 2 5 8 9 10 11 12 13
1 Вакцина АКДС-Геп В П1 0,124 - - 0,124 - -
2 Экспериментально-производственная серия вакцины аАКДС П3 0,124 ' 0,62 0,124 0,62
3 АДС-М-анатоксин П39 0,062 - - 0,062 -
4 АД-М-анатоксин П59 - - - - -
5 АС-анатоксин П42 - - - - -
6 АКДС-вакцина П23 0,062 - - 0,062 -
Примечание. (-) - отрицательная реакция. и столбнячного анатоксинов (несорбированных) в разведении с 1 Lf/мл, коклюшный антиген с концентрации 20 КЕ/мл (коагглютинационные единицы). Диагностикумы выявляли гомологичные антигены и не давали перекрестных реакций с гетерологичными антигенами, что свидетельствовало о специфичности метода.
Помимо специфических диагностикумов в комплектацию набора реагентов был включен контрольный образец для исследования адсорбированных препаратов АДСК (комплекс дифтерийного, столбнячного и коклюшных антигенов, адсорбированный на геле гидроксида алюминия).
Для увеличения срока хранения диагностикумы и контрольные образцы подвергали лиофильному высушиванию. Сухой препарат растворялся в фосфатно-солевом буферном растворе, с образованием гомогенной взвеси, при нанесении капли реагента на предметное стекло гомогенность взвеси сохранялась при покачивании стекла в течение не менее 10 минут.
Тест-набор укомплектован концентратом для приготовления 0,01 М фосфатно-солевого буферного раствора, рН (7,3 ± 0,1).
При определении срока годности было показано, что компоненты набора сохраняли свою стабильность в процессе хранения в течение 16 месяцев (срок наблюдения).
На разработанный набор реагентов для определения дифтерийного, столбнячного и коклюшных антигенов в реакции коагглютинации («ТН-ДСК-КОА») составлен пакет документов, включающий инструкцию по применению и технические условия.
Далее проводили оценку основных валидационных характеристик тест-набора: прецизионности (сходимости и воспроизводимости), специфичности и чувствительности.
Определение чувствительности разработанного набора реагентов показало, что минимально определяемая концентрация дифтерийных антигенов составила
0,03 Lf/мл, столбнячных - 0,06 Lf/мл, коклюшных - 0,63 КЕ/мл. При этом ни в одной из постановок не было получено ложноположительных результатов для отрицательного контрольного образца (ФСБ).
При исследовании прецизионности было показано, что тест-набор достоверно подтверждает подлинность дифтерийного, столбнячного, коклюшного компонентов в составе вакцинных препаратов. При оценке полноты сорбции адсорбированных препаратов было показано, что содержание свободных дифтерийного, столбнячного и коклюшного компонентов в адсорбированных вакцинах находится в пределах нормы и соответствует требованиям нормативных документов.
При определении специфичности было установлено, что тест-набор обеспечивает положительную реакцию (образование агглютинатов) с гомологичными положительными образцами, при этом сохраняя гомогенность при добавлении отрицательного контрольного образца (ФСБ), а также образцов вакцинных препаратов, не содержащих гомологичных антигенов, а именно: Грип-пол, Энжерикс В, Хаврикс, вакцина гепатита В рекомбинантная, вакцина против краснухи.
Таким образом, в процессе валидации была подтверждена заявленная чувствительность диагностику-мов, а также определена пригодность применения набора «ТН-ДСК-КОА» для оценки подлинности и полноты сорбции дифтерийного, столбнячного, коклюшного компонентов в составе комбинированных и конъюгированных вакцинных препаратов.
В ходе завершающего этапа разработки тест-набора на базе Пермского «НПО «Биомед» с участием ЗАО «Вымпел-Медцентр» были проведены технические и медицинские испытания. Для проведения испытаний набор реагентов «ТН-ДСК-КОА» взят в количестве 3 комплектов. Панель образцов для проведения испытаний позволяла провести исследование чувствительности набора, определить подлинность, полноту сорбции и содержание антигенов.
В результате проведения технических испытаний было показано, что данный набор реагентов соответствует требованиям технических условий по всем показателям: внешний вид, растворимость, рН, микробиологическая чистота, потеря в массе при высушивании, специфичность, чувствительность, упаковка, комплектность, маркировка.
гг
ПРЕПАРАТЫ
С целью экспериментальной апробации представленных проектов нормативных документов в соответствии с программой медицинских испытаний были проведены исследования положительных и отрицательных образцов вакцин по показателю «Подлинность» (табл. 2). Из представленных данных видно, что тест-набор для проведения реакции коагглютинации достоверно подтверждает подлинность компонентов положительных образцов, при этом реакция с отрицательными образцами отсутствовала.
Кроме того, в рамках медицинских испытаний была подтверждена возможность использования тест-набора для оценки полноты сорбции компонентов вакцинных препаратов. Результаты, полученные в РКОА, согласуются с результатами регламентированных тестов: реакции флоккуляции и реакции нейтрализации на животных (табл. 3). Также с помощью РКОА возможно ориентировочно определять содержание антигенов (используя двукратные разведения), что позволяет оперативно следить за целевым продуктом на стадиях технологического процесса получения анатоксинных препаратов и бесклеточной коклюшной вакцины.
Таким образом, результатом проведенных исследований явилась разработка тест-набора с окрашенными ди-агностикумами, позволяющего в течение 5-10 мин без сложного аппаратурного обеспечения определять дифтерийные, столбнячные и коклюшные антигены. Применение «ТН-ДСК-КОА» возможно при проведении научных исследований в области иммунологии и микробиологии, для экспрессного определения бактериальных токсинов и анатоксинов (дифтерийных и столбнячных), коклюшных антигенов (клеточного и бесклеточного), при производстве иммунобиологических препаратов на разных стадиях технологического процесса.
Отдельно следует указать, что впервые показана возможность применения разработанного тест-набора для контроля подлинности конъюгированных вакцин, содержащих в качестве белка-носителя столбнячный анатоксин, в РКОА, что является весьма актуальным в связи с расширением спектра используемых вакцин этой группы. Кроме того, тест-набор может быть использован для контроля подлинности зарубежных комбинированных и конъюгированных вакцин, поступающих на отечественный рынок.
Оценка подлинности и полноты сорбции компонентов с использованием набора реагентов «ТН-ДСК-КОА» включена в проект фармакопейной статьи «Вакцина про-
тив коклюша, дифтерии, столбняка, гепатита В адсорбированная, инфекции, вызываемой Haemophilus influenzae типа b, конъюгированная (Вакцина АКДС-Геп В+Hib)».
Литература
1. Белая Ю.А., Вахрамеева М.С., Белый Ю.Ф., Белая О.Ф., Петрухин В.Г. Способ получения тест-системы для определения антигенов цитокинассоциирован-ных белков Helicobacter pylori в биологическом материале инфицированных лиц реакцией агглютинации. Патент № 2232989, 2004.
2. Карбышев Г.Л. Совершенствование серологической диагностики легионеллеза: автореф. дис. ... докт. мед. наук. Ростов н/Д, 2007. 38 с.
3. Пагнуева Л.Ю. Сперанская В.Н., Авдеева Н.С., Ме-хоношина Л.П., Баева Р.А. Реакция коагглютинации и иммуноферментный анализ в комплексной диагностики кампилобактериоза // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов: материалы конференции / Под ред. Катлинского А.В. Пермь, 2008. С. 65-66.
4. Тарасенко В.И. Экспресс-метод диагностики вируса клещевого энцефалита // Наука о человеке. Сб. статей молодых ученых и специалистов. Томск: СГМУ, 2010. 268 с.
5. Chattopadhyay U.K. Coagglutination test for rapid non-cultural diagnosis of human campylobacteriosis // European Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2002. V. 6. P. 9-11.
6. Datta S., Janes M.E., Simonson J.G. Immunomagnetic separation and coagglutination of Vibrio parahaemo-lyticus with anti-flagellar protein monoclonal antibody// Clin. Vaccine Immunology. 2008. V. 15. No. 10. P. 15411546.
7. Del Rio M.L., Guitierrez C.B., Rodriguez Ferri E.F. Value of indirect hemagglutination and coagglutination tests forserotyping Haemophilusparasuis//J. Clin. Microbiol. 2003. V. 41. No. 2. P 880-882.
8. Lindmark R., Thoren-Tolling K., Sjoquist J. Binding of immunoglobulin levels in mammalian sera // J. Immunol. Methods. 1983. V. 62. P. 1-13.
9. Ribeiro M.C.M., Araujo J.P. Coagglutination for viral DNA preparation of canine parvovirus for molecular diagnosis //J. Virol. Methods. 2009. V. 161. No. 2. P. 305-307.
03
