CC BY
221
НОВЫЙ ПОДХОД К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПОДЛИННОСТИ КОМБИНИРОВАННЫХ ВАКЦИН ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ДИФТЕРИИ, СТОЛБНЯКА И КОКЛЮША
А.М. Николаева, В.Н. Сперанская, О.Ю. Соснина, Е.А. Калашникова, Д.В. Грязнова, Е.В. Пушкарева
Филиал ФГУП "НПО "Микроген" Минздравсоцразвития России в г. Пермь "Пермское НПО "Биомед"
E-mail: a.m.nikolaeva@mail.ru
NEW APPROACH FOR DETERMINATION OF THE IDENTITY OF THE COMBINED VACCINES FOR DIPHTHERIA, TETANUS AND PERTUSSIS PROPHYLAXIS
A.M. Nikolaeva, V.N. Speranskaya, O.Yu. Sosnina, E.A. Kalashnikova, D.V. Gryaznova, E.V. Pushkareva
"Biomed" - Perm Branch of the Federal State Unitary Company "Microgen" of the Ministry of Health and Social Development
of the Russian Federation
Разработаны оригинальные диагностические препараты на основе стафилококкового реагента, содержащего белок А, и аффинноочищенных антител для определения дифтерийного, столбнячного анатоксинов и коклюшных антигенов в реакции коагглютинации. Реакция коагглютинации информативна, легко выполнима и может быть
рекомендована для включения в нормативно-техническую документацию на комбинированные вакцины, что позволит гармонизировать методы контроля по показателю “Подлинность” с требованиями Европейской Фармакопеи.
Ключевые слова: комбинированные адсорбированные вакцины, реакция коагглютинации, стафилококковый реагент, содержащий белок А, диагностикумы.
Special diagnostic preparations based on a staphylococcal reagent containing protein A, and affinity-purified antibodies have been developed for the purpose of identifying pertussis antigens, tetanus and diphtheria toxoids in the coagglutination test. The coagglutination reaction is informative and easy to perform; it can be recommended to be included into specifications and technical documentation on combined vaccines, which makes it possible for the vaccine producer to harmonize verification methods of acquiring identity index to meet the European Pharmacopoeia requirements.
Key words: combined adsorbed vaccines, coagglutination test, staphylococcal reagent containing protein A, diagnosticums.
Введение
В настоящее время в России для профилактики дифтерии, столбняка и коклюша используются как отечественные (АДС-М, АКДС), так и зарубежные препараты (Инфанрикс, Пентаксим). Одним из главных показателей качества вакцин являются подлинность и специфическая активность. В нормативных документах на отечественные комбинированные вакцины показатели “Подлинность” и “Специфическая активность” трактуются однозначно и определяются по иммуногенной активности в тестах “in vivo”. В Европейской Фармакопее для контроля “Подлинности” вакцинных препаратов рекомендуется использовать тесты “in vitro” [4]. Для обеспечения качества выпускаемых отечественных вакцинных препаратов необходимо совершенствование их стандартизации и контроля на основе международных требований. В связи с этим разработка простых экспрессных методов контроля подлинности комбинированных вакцин является актуальной.
Одним из экспрессных и легко выполнимых в лабораторной практике методов является реакция коагглютинации (РКОА). Первые работы по РКОА были выполнены G. Kronvall в начале 70-х гг. До настоящего времени не ослабевает интерес к этому методу. По данным литературы, коагглютинационные препараты разработаны для идентификации большой группы микроорганизмов в том числе легионелл, кампилобактеров, хеликобакте-ров [2, 3].
Цель исследования: разработка тест-набора, включающего диагностикумы для выявления дифтерийного, столбнячного анатоксинов и коклюшных антигенов в реакции коагглютинации (РКОА), и оценка возможности его применения для контроля подлинности вакцин.
Материал и методы
При выполнении настоящей работы использовали стафилококковый реагент, содержащий белок А [1]. Для получения гипериммунных сывороток кроликов иммунизировали дифтерийным анатоксином (ОКДА), столбнячным анатоксином (ОКСА), коклюшной суспензией (КС). Определение специфической активности сывороток проводили в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с помощью эритроцитарных антигенных диагно-стикумов соответствующей специфичности, которые готовили глютаральдегидным методом.
Для выделения антител применяли антигенные сор-
бенты на основе цианбромированной сефарозы и геля гидроксида алюминия. Полученные антительные препараты изучали методом гельхроматографии на сефадексе G-200. Экспериментальные серии диагностикумов на основе стафилококкового реагента, содержащего белок А, получали с использованием кроличьих аффиноочищен-ных антител соответствующей специфичности. Приготовленные диагностикумы применяли для оценки полноты сорбции и антигенной активности адсорбированных препаратов. В качестве контрольных образцов использовали очищенные концентрированные столбнячный и дифтерийный анатоксины, коклюшную суспензию, АКДС-вакцину, отконтролированную по показателю специфической активности в тесте “in vivo”. Реакцию коагглютинации (РКОА) выполняли на стекле. Приготовленные разведения исследуемого материала переносили на стекло по одной капле (10 мкл). Затем к этим разведениям добавляли соответствующий диагностикум в равном объеме и перемешивали, осторожно покачивая стекло в руках. Результаты РКОА учитывали в пределах 5-10 мин визуально по образованию агглютинатов. Каждое исследование сопровождалось постановкой контроля на специфичность реакции.
Содержание компонентов в вакцинах определяли в сравнении с контрольными образцами. Расчет содержания антигенов в препаратах проводили по следующей формуле: Y = X x Z, где: Y - содержание определяемого компонента; X - обратная величина последнего разведения исследуемого материала, в котором наблюдалась положительная реакция; Z - показатель чувствительности диагностикума.
Результаты и обсуждение
Для приготовления коагглютинационных диагности-кумов важным моментом является получение и подбор иммунных сывороток, активно взаимодействующих с белком А. Основное требование к таким сывороткам -высокая специфическая активность, обеспеченная преимущественно иммуноглобулином класса G. Известно, что высоким сродством к белку А обладают иммуноглобулины кроликов. В этой связи для получения гиперим-мунных сывороток были апробированы различные схемы иммунизации кроликов на модели дифтерийного очищенного анатоксина. Применяли цикловую иммунизацию с предварительным грундированием, а также использовали адъюванты (полный или неполный адъювант Фрейнда, гель гидроксида алюминия). Наши данные ох-
ватывают наблюдения более чем на 100 животных. Испытаны различные схемы иммунизации (табл. 1).
Лучшие показатели продукции антител были у кроликов, иммунизированных по схемам 1 и 3, причем в ряде групп отмечалась положительная сероконверсия у 100% животных. При иммунизации по схеме 1 после второго цикла средняя геометрическая титра антител у 40% животных составляла 1:135353,26. При этом высокие титры оставались в течение длительного времени на стабильном уровне, что позволяло использовать этих животных в качестве продуцентов гипериммунных сывороток. Отдаленная реиммунизация, как правило, давала выраженный “бустер”-эффект, но дозы анатоксина при каждой инъекции необходимо было подбирать в зависимости от индивидуальной реактивности кроликов. Высокие титры были получены при иммунизации кроликов по схеме 3. Однако на последующих циклах при введении как малых, так и больших доз анатоксина титры антител у животных стабилизировать не удавалось. У этих животных отмечался и слабый “бустер”-эффект. После окончания иммунизации средняя геометрическая титра антител составляла 1:25600. Достоинство этой схемы заключалось в относительно быстром нарастании титров, хотя срок полезной эксплуатации животных этой группы был небольшим. В последующих опытах для получения противостолбнячных и противококлюшных сывороток, предназначенных для приготовления коагглютинационных диагностикумов, брали за основу схемы 1 и 3. С помощью иммуноферментного анализа было установлено, что выбранные схемы иммунизации обеспечивают получение гипериммунных сывороток с высоким титром специфических антител.
Последующий анализ сывороток проводили на основании оценки их истощения белком А и изучения класс-принадлежности антител при фракционировании на се-фадексе G-200. При заключительном отборе сывороток использовали реакцию флокуляции. Высокоактивные сыворотки имели максимальные титры по флокуляции
50-100 МЕ/мл, среднетитровые - 10-40 МЕ/мл. В сыворотках после реиммунизации титр антител класса превышал титр ^М-антител в 8-16 раз, а их удельная активность была выше в среднем в 5 раз. Титры антител в гипериммунных кроличьих сыворотках снижались не менее чем в 32 раза уже после однократной адсорбции их стафилококковой суспензией. Десорбированные антитела при электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ) были гомогенными и соответствовали иммуноглобулину класса С. Анализируя механизм РКОА, мы пришли к выводу, что рутинная методика получения коагглю-тинационных диагностикумов с использованием нативных сывороток не обеспечивает полного выявления высоких потенциальных возможностей этой реакции, чувствительность которой может приближаться к ИФА и РИА. В гипериммунной сыворотке антитела заданной специфичности составляют около 20% от общего количества иммуноглобулинов, соответственно и на поверхности клеток стафилококка они могут фиксироваться в эквивалентной дозе. Следовательно, информативность теста может быть повышена при создании стафилококкового реагента с узконаправленной специфичностью за счет иммобилизации на клетках иммуноглобулинов только одной (заданной) специфичности. Практически это было возможно осуществить путем сенсибилизации стафилококка не нативной сывороткой, а очищенными антителами.
В этой связи нами были выполнены эксперименты по выделению высокоочищенных специфических иммуноглобулинов с помощью иммуносорбции из противодифтерийной, противостолбнячной и противоколюшной кроличьих сывороток. В работе были испытаны два вида иммуносорбентов: на основе геля гидроксида алюминия и на основе цианбромированной сефарозы 4В. В сравнительных экспериментах иммуносорбент на основе геля гидроксида алюминия, на котором антиген фиксирован за счет сорбционных связей, оказался менее пригодным для выделения антител, особенно из относительно низ-
Таблица 1
Схемы иммунизации кроликов
№ п/п Схема иммунизации Результаты титрования сывороток (РНГА)*
1 Адъювант: гель гидроксида алюминия
Грундирование: 30 ЛФ - 100 ЛФ анатоксина в/м.
I цикл иммунизации (через 3-4 недели): до 6 инъекций 135353,26
(подкожно) нарастающих доз анатоксина (10, 20, 30, 40, 50, 60 ЛФ), с интервалом в З-5 дней. [104631,52-175095,48]
ПЧУ цикл иммунизации (через 2 недели): по 2-4 инъекции (подкожно) в дозах анатоксина
20-50 ЛФ.
2 Адъювант: Полный адъювант Фрейнда (ПАФ).
I иммунизация: 3 инъекции (1-2 в /м, 3 - в/бр) в дозе анатоксина 75 ЛФ. 9050,97
II иммунизация (через 3-4 недели): 1 инъекция (в/м) в дозе анатоксина 150 ЛФ. [6971,91-11751,2]
3 I иммунизация: 2 инъекции (в/м) в дозе 40 ЛФ анатоксина с ПАФ и гелем гидроксида алюминия.
II иммунизация (через 4 недели): 2 инъекции (в/м) в дозе анатоксина 400 ЛФ с гелем гидроксида 25600
алюминия. [15186,7-43153,5]
4 Адъювант: ПАФ Грундирование: ПАФ в подушечку лапки.
I иммунизация (через 2-3 недели): 3 инъекций одновременно (в/м, в/бр., в подушечку лапки) 12800
в дозе анатоксина 50 ЛФ с ПАФ. [8541,81-19180,9]
II иммунизация (через 3 недели): 1 инъекция (в/м) в дозе анатоксина 80 ЛФ с ПАФ; 2 инъекция
20 ЛФ анатоксина (в/в).
Примечание: * - величина, обратная разведению сыворотки.
котитровых сывороток. В дальнейших опытах использовался иммуносорбент на основе цианбромированной сефарозы. Проведенными экспериментами была обоснована оптимальная схема иммуноаффинного выделения антител из противодифтерийных кроличьих сывороток. Далее она была распространена (с некоторыми коррективами) и на получение чистых антител из противостолбнячных и противококлюшных кроличьих сывороток. Анализ с помощью гельхроматографии на супердексе С-200 подтвердил высокую степень очистки и монофракционность выделенных антител.
В дальнейших исследованиях была проведена отработка условий приготовления специфических коагглю-тинационных препаратов, а также их оценка и стандартизация. При получении активного специфического ди-агностикума на основе дифтерийных, столбнячных, коклюшных антител было установлено, что в зависимости от удельной активности их оптимальная концентрация составляла 0,5-1,2 мг по белку на 1 мл 10% суспензии. Важно отметить, что установленные оптимальные концентрации антител обеспечивали достаточно полное насыщение рецепторного аппарата клеток стафилококка при однократном истощении раствора антител, благодаря чему ограничивались потери высокоочищенного антитоксина при получении диагносттикумов - специфически направленных стафилококковых реагентов. Полученные диагностикумы обладали гомогенностью и не давали спонтанной агглютинации. При взаимодействии с гомологичными антигенами в реакции коагглю-тинации наблюдалось быстрое формирование агглюти-натов. Для контроля специфичности диагностикумов использовали контрольные положительные образцы дифтерийного и столбнячного анатоксинов (несорбирован-ных) в рабочем разведении 1 Lf/мл и 1 ЕС/мл, коклюшную суспензию в концентрации 30 МОЕ. Диагностикумы выявляли искомые антигены и не давали перекрестных реакций с гетерологичными антигенами, что свидетельствовало о специфичности метода. При определении чувствительности РКОА показано, что минимально выявляемая концентрация для дифтерийного анатоксина составляла 0,052 Lf/мл, для столбнячного анатоксина -
0,052 ЕС/мл, коклюшного компонента - 0,32 МОЕ.
На следующем этапе работы в реакции коагглютинации с разработанными диаг-ностикумами нами были исследованы моно- и комбинированные препараты по показателю полноты сорбции. Чувствительность РКОА гарантировала выявление не-адсорбированных анатоксинов, содержание которых по нормативной документации (ФСП) должно быть для дифтерийного - не более 1 Lf и для столбнячного - не более 0,1 ЕС в 1 мл надосадочной жидкости. С помощью РКОА была подтверждена полнота сорбции антигенов непосредственно в процессе производства при получении 40 серий сорбированных вакцин (АКДС-Геп В, АДС-Геп В, АДС-М, АС, АД-М).
Данная реакция оказалась достаточно информативным методом при оценке полно-
ты сорбции антигенов на геле гидроксида алюминия. Мы имеем основание утверждать, что в этом случае ни один другой метод не может дать такой всесторонней количественной и качественной информации так же быстро, четко и оперативно, как РКОА.
Далее мы показали возможность использования РКОА для анализа готовых адсорбированных препаратов по показателю подлинности. В эксперименте были исследованы как отечественные вакцинные препараты, так и зарубежные (Инфанрикс, Пентаксим), а также экспериментальные серии, разрабатываемого нами комбинированного препарата с бесклеточным коклюшным компонентом (АаКДС). Всего изучено более 50 серий адсорбированных препаратов. В этих опытах в качестве контроля ставили реакцию с суспензией несенсибилизирован-ного стафилококка. Реакция была отрицательной, т.е. не отмечалось неспецифических взаимодействий за счет самого стафилококка и геля гидроксида алюминия. Использование РКОА как полуколичественного метода для анализа комбинированных вакцин позволило ориентировочно определять активность компонентов в составе препаратов. При определении подлинности адсорбированной вакцины достаточно выбрать ее рабочее разведение, дающее четко выраженную положительную реакцию с гомологичным диагностикумом. Достоверность результатов РКОА должна подтверждаться отрицательными контролями: на специфичность (диагностикум с ге-терологичным адсорбированным препаратом) и спонтанную агглютинацию (диагностикум с фосфатным буферным раствором). По результатам оценки адсорбированных препаратов в РКОА было показано, что антигенная активность дифтерийного, столбнячного и коклюшных компонентов в исследованных комбинированных препаратах (АКДС, АКДС-геп В) была равнозначной вакцинам Инфанрикс, Пентаксим и АаКДС. Отличия по активности препаратов АД-М и АКДС, АКДС-ГепВ; АС и АДС-М, выявленные в РКОА, соответствовали различному содержанию компонентов в изученных препаратах (табл. 2).
Реакция коагглютинации оказалась весьма удобной для проверки полноты сорбции и подлинности сорбированных препаратов. С одной стороны, - это экстрен-
Таблица 2
Оценка комбинированных вакцин по показателю “Подлинность” в реакции коагглютинации
Наименование препарата Кол-во серий Дифтерийный компонент, Lf/мл Столбнячный компонент, ЕС/мл Коклюшный компонент, УЕ/мл**
АДС-М 11 9,67+0,15 9,63+0,12 -
АКДС 15 29,97+0,33 9,68+0,16 19,73+0,39
АКДС-ГепВ 11 29,93+0,38 9,67+0,15 19,78+0,37
АД-М 5 9,68+0,17 - -
АС 5 - 19,52+0,44 -
КС 10 - - 59,53+0,66
АаКДС* 10 29,99+0,49 9,63+0,09 19,84+0,32
Инфанрикс* 5 29,77+0,55 9,68+0,15 19,64+0,49
Пентаксим* 5 29,80+0,56 9,83+0,21 19,52+0,44
Примечание: * - вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом; ** - условные коагглюти-национные единицы.
ная, практически моментальная регистрация полноты сорбции (или возможности десорбции) анатоксинов -одного из важнейших критериев качества моно- и комбинированных препаратов. Здесь РКОА может стать основным методом контроля, исключив трудоемкий и инертный в данном случае биологический тест. С другой стороны, нами впервые показана возможность оценки антигенной активности непосредственно сорбированного препарата. По-видимому, эта уникальная возможность РКОА обеспечивается тем, что иммобилизат антител на стафилококке по своим размерным характеристикам хорошо может сочетаться в “иммунологической сети” с иммобилизатом антигена на геле гидроксида алюминия.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали перспективность использования РКОА для контроля адсорбированых вакцин по показателю полноты сорбции и подлинности. Особо следует подчеркнуть возможность применения этой реакции для контроля вакцин без предварительной десорбции компонентов, что в значительной степени сокращает сроки проведения анализа. В то же время для оценки подлинности комбинированных вакцин методы, рекомендованные Европейской Фармакопеей, предусматривают предварительную десорбцию компонентов [4, 5]. При этом следует отметить, что последующие после десорбции преципитаци-онные методы (радиальная иммунодифузия, встречный иммуноэлектрофорез, двойная иммунодиффузия), используемые для оценки подлинности, требуют значительного времени как на подготовительные работы, так и на осуществление самого анализа (табл. 3).
Заключение
В заключение следует отметить, что реакция коагглю-тинации информативна, легко выполнима и может быть рекомендована для включения в нормативно-техническую документацию на вакцинные препараты, что позволит гармонизировать методы контроля по показателю
Таблица 3
Продолжительность методов анализа для оценки подлинности адсорбированных вакцинных препаратов
Тесты, используемые для оценки подлинности Продолжительность анализа с учетом десорбции компонентов вакцин
Биопроба (ФСП, Россия) 28-37 дней
Преципитационные методы 36-48ч
(Европейская Фармакопея)
Предлагаемая реакция коагглюти- 5-10 мин
нации
“Подлинность” с требованиями Европейской Фармакопеи. Кроме того, разработанный тест-набор может быть использован для контроля подлинности зарубежных адсорбированных вакцин, поступающих на отечественный рынок.
Литература
1. Грязнова Д.В., Сперанская В.Н., Курочкина О.М. К разработке технологии получения стафилококкового бактериально-клеточного реагента // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов: материалы конференции / под ред. А.В. Катлинского. -Пермь, 2008. - С. 59-61.
2. Карбышев ГЛ. Совершенствование серологической диагностики легионеллеза : автореф. дис. ... докт. мед. наук. - Ростов н/Д, 2007. - 38 с.
3. Пагнуева Л.Ю. Сперанская В.Н., Авдеева Н.С. и др. Реакция коагглютинации и иммуноферментный анализ в комплексной диагностики кампилобактериоза // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов: материалы конференции / под ред. А.В. Кат-линского. - Пермь, 2008. - С. 65-66.
4. Diphtheria and Tetanus vaccine (adsorbed). European Pharmacopeia, 6th Edition, 2007. - P. 763-764.
5. Pertussis vaccine (acellular, co-purified, adsorbed). European Pharmacopeia, 6th Edition, 2007. - P. 822-824.
Поступила 06.04.2011
