CC BY
555
УДК 615.371:578.74:615.322
ЛИПОСОМЫ КАК АДЪЮВАНТЫ КОМБИНИРОВАННЫХ ВАКЦИН
А. В. Иванов *, А. М. Николаева, И. В. Красильников
Пермская государственная фармацевтическая академия, г. Пермь, Россия
LIPOSOMES AS COMBINED VACCINE ADJUVANTS
A. V. Ivanov, A. M. Nikolaeva, I. V. Krasilnikov
Perm State Pharmaceutical Academy, Perm, Russia
Цель. Изучить возможность использования липосом в качестве адъюванта комбинированных вакцин. Материалы и методы. Инкапсулирование в липосомы дифтерийно-столбнячного анатоксина осуществляли методом дегидратации/регидратации, с последующей обработкой мультиламеллярных липосом ультразвуком. Оценку качества полученных липосомальных вакцин проводили по следующим показателям: иммуногенность, стерильность, специфическая безопасность, токсичность, пироген-ность.
Результаты. Разработана технология получения комбинированной липосомальной дифтерийно-столб-нячной вакцины для парентерального введения. В опытах на животных липосомальная вакцина проявила иммуногенные свойства, сопоставимые с коммерческим, адсорбированным на геле гидроксида алюминия, дифтерийно-столбнячным анатоксином.
Выводы. Липосомальная вакцина, полученная по разработанной технологии, по показателям иммуно-генности, пирогенности, стерильности, токсичности, специфической безопасности полностью отвечает требованиям, предъявляемым к вакцинным препаратам. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования липосом в качестве адъювантов комбинированных вакцин. Ключевые слова. Адъюванты, липосомы, комбинированные вакцины, столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, иммуногенность.
Aim. To study the possibility of using liposomes as combined vaccine adjuvants.
Materials and methods. Encapsulation of diphtheria-tetanus toxoid into liposomes was carried out with dehydration/rehydration method followed by ultrasonic treatment of multilamellar liposomes. The quality assessment of the received liposomal vaccines was performed by the following indications: immunogenicity, sterility, specific safety, toxicity and pyrogenicity.
Results. Technology of obtaining a combined liposomal diphtheria-tetanus vaccine meant for parenteral
introduction was developed. In animal experiments, the liposomal vaccine manifested immunogenic properties
comparable with commerce diphtheria-tetanus toxoid absorbed on aluminium hydroxide gel.
Conclusion. Liposomal vaccine obtained according to the developed technology completely meets
the requirements for vaccinal preparations by immunogenicity, pyrogenicity, toxicity, specific safety indices.
The obtained results are promising for using liposomes as combined vaccine adjuvants.
Key words. Adjuvants, liposomes, combined vaccines, tetanus toxoid, diphtheria toxoid, immunogenicity.
© Коллектив авторов, 2012 e-mail: Ivanoffal@yandex.ru тел. 8 (342) 236 42 78
[Иванов А. В. (* контактное лицо) — аспирант кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии; Николаева А. М. — доктор биологических наук, профессор кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии; Красильников И. В. — доктор биологических наук, кафедра промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии].
Введение
Разработка эффективных адъювантов — носителей антигенов, обеспечивающих формирование выраженного и длительно сохраняющегося иммунитета, является одной из сложнейших задач в производстве вакцинных препаратов. Адъюванты способны не только усиливать иммунный ответ на различные антигены, но и эффективно управлять им, избирательно воздействуя на ТЫ (клеточный иммунный ответ), ТЪ2 (гуморальный иммунный ответ), цитотоксический Т-кле-точный ответ, а также стимулируя неспецифический иммунитет [8, 9]. В настоящее время в качестве адъювантов в вакцинах наиболее широко используются соединения алюминия. Вместе с тем постоянно проводятся исследования по разработке нового поколения адъювантов, создаваемых на основе последних достижений современной иммуно-биотехнологии [6, 10].
Одним из перспективных направлений по поиску новых адъювантов является создание искусственных мембран — липосом. Ли-посомы — это сферические частицы, состоящие из бимолекулярного слоя липидов, удерживающего антиген в капсуле, и выполняющие двойное действие, выступая в качестве носителя антигена и адъюванта [1]. Адъю-вантность, повышенное сродство к клеткам ретикулоэндотелиальной системы, возможность доставки к иммунокомпетентным клеткам антигенов — все эти положительные свойства липосом были весьма эффективно реализованы при создании ряда вакцинных препаратов [2, 4].
Цель исследования — изучить возможность использования липосом в качестве адъюванта комбинированных вакцин.
Материалы и методы
исследования
Для получения липосомальной вакцины использовали лецитин, выделенный из желт-
ков куриных яиц, очищенный концентрированный столбнячный анатоксин (ОКСА) и очищенный концентрированный дифтерийный анатоксин (ОКДА) производства ФГУП «НПО «Микроген».
Получение липосом проводили следующим образом: спиртовой раствор лецитина концентрировали на роторном испарителе при температуре 41—43°С до образования на стенках колбы тонкой липидной пленки. К содержимому прибавляли буферный раствор трис-HCl (рН 7,0—7,2) с растворенными ОКДА 10 Lf/мл и ОКСА 10 Lf/мл. Полученную грубую липидную эмульсию перемешивали в течение 30—40 минут. Сформированные крупные липосомы обрабатывали ультразвуком при различных временных режимах на установке УЗВ-12. Липосомальную дисперсию подвергали стерилизующей фильтрации через мембрану с размером пор 0,22 мкм.
Определение степени включения ОКСА и ОКДА в липосомы осуществляли с помощью гель-фильтрации на геле АсА-34. Для определения специфической активности анатоксинов и их липосомальных дисперсий применяли реакцию коагглютинации (РКОА) с использованием аффинно-очищенных антител кролика против дифтерийного и столбнячного антигенов, сорбированных на белке А инактивированного стафилококка штамма Cowan I [3].
Размер фосфолипидных частиц определяли на приборе Zetasizer Nano фирмы Malvern методом лазерного корреляционного светорассеяния под углом 170°; зета-по-тенциал — методом электрофоретического рассеяния по изменению распределения частиц в электрическом поле.
Полученные образцы подвергали лиофи-лизации. Лиофилизацию проводили на аппарате для сублимирования ТГ-50 (Германия). В качестве криопротектора при лиофилиза-ции использовали сахарозу в различных концентрациях. Образцы в лиофилизированном виде исследовали в процессе хранения в течение 1 года.
Оценку качества полученной липосо-мальной дифтерийно-столбнячной вакцины (ЛДС-М) проводили в соответствии с Европейской Фармакопеей на дифтерийно-столб-нячную вакцину (АДС-М) по следующим показателям: иммуногенность, стерильность, безвредность, токсичность [5].
Для определения иммуногенной активности компонентов ЛДС-М-вакцины по показателю выживаемости определяли резистентность иммунизированных морских свинок (масса 300+50 г) к дифтерийному тест-токсину и резистентность иммунизированных белых мышей (масса 17±1 г) к столбнячному тест-токсину.
Уровень специфических антител, индуцируемых липосомальной вакциной, изучали в опытах на морских свинках. Иммунизацию проводили по следующей схеме: морским свинкам массой 300+50 г двукратно подкожно с интервалом 14 дней вводили ЛДС-М-вакцину (опытная группа) и АДС-М-анатоксин, адсорбированный на геле гидро-ксида алюминия (контрольная группа). Через 28 дней после первой инъекции в сыворотках морских свинок определяли антитела к дифтерийному и столбнячному анатоксинам методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Результаты и их обсуждение
При получении липосомальных дисперсий первоначально проводили исследование по подбору оптимального соотношения лецитин/смесь ОКДА + ОКСА. Интервал соотношений составил от 1:1 до 1:10. Липосо-мальные дисперсии используемых анатоксинов по внешнему виду представляли собой молочно-белые эмульсии с различной степенью расслоения. При этом наименьшая степень расслоения наблюдалась для липосомальной дисперсии с соотношением лецитин/смесь ОКДА + ОКСА 1:1.
В следующей серии экспериментов проводили подбор оптимального режима ультразвуковой обработки полученных липосо-мальных дисперсий дифтерийно-столбняч-ной вакцины (табл. 1).
Установлено, что по мере обработки ли-посомальных дисперсий ультразвуком показатели, характеризующие их качество, значительно улучшались. После 25 минут обработки дисперсии были прозрачны, обладали хорошей смачивающей способностью, имели голубоватый оттенок, т. е. визуально отвечали критериям истинных липосомальных дисперсий [11].
Доказательством включения смеси анатоксинов в липосомы явились результаты
Таблица 1
Отработка режимов ультразвуковой обработки липосомальных дисперсий дифтерийно-столбнячной вакцины
Характеристика Время обработки, мин
0* 5 10 15 20 25 30
Оптическая плотность при 400 нм да 1,200 0,375 0,160 0,080 0,050 0,045
Оптическая плотность при 540 нм 1,750 0,800 0,220 0,082 0,042 0,025 0,020
Средний размер частиц, нм 1442,0 241,4 167,8 160,2 133,6 125,6 118,9
Примечание. * — липосомальная дисперсия до обработки ультразвуком.
120
100
Л
80 / \
1 ^
§ 60 V
V
40
20
0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69
^^НОптическая плотность при 280 нм Активностьдифтерийного анатоксина
Активность столбнячного анатоксина
Рис. Хроматографический профильлипосомальной дифтерийно-столбнячной вакцины
гель-хроматографии липосомальной дисперсии на ультрагеле АсА-34 (см. рис.). Хро-матографическая кривая была представлена высоким четко выраженным пиком, соответствующим фракциям, содержащим липо-сомы, нагруженные антигенами. В данном варианте хроматографии не было выявлено пиков, соответствующих свободному дифтерийному и столбнячному анатоксинам. Специфическая активность липосомальных фракций подтверждена в реакции коагглю-тинации.
Таким образом, размеры полученных ли-пидных частиц, определенных методом лазерного корреляционного светорассеяния, и их способность включать в свою структуру анатоксины позволяют охарактеризовать полученные структуры как липосомы. Вместе с тем зета-потенциал, который является важным индикатором прогнозирования устойчивости липосом, составил минус 3,5 мВ, что свидетельствовало о недостаточной стабильности полученной липосомаль-ной дисперсии [7].
Известно, что основным технологическим приемом, обеспечивающим получение стабильных липосомальных препаратов, является лиофилизация. При этом от выбранного режима сублимации и использования криопротектора зависит стабильность липо-сом, количество включенного в липосомы лекарственного препарата, структура липо-сом и их размер [2]. В связи с этим были проведены эксперименты по стабилизации ли-
посомальных дисперсий с помощью лиофи-лизации. Отработку процесса высушивания проводили с учетом его влияния на физические свойства и специфическую активность липосомальной вакцины. В результате был отработан следующий режим лиофилизации: замораживание препарата ниже температуры минус 35°С и выдерживание при этой температуре не менее 4 часов; проведение стадии лиофилизации при температуре препарата минус 35°С, продолжительность стадии 15 часов; досушивание препарата при плюсовых температурах в течение 15 часов.
В качестве защитной среды использовали наиболее доступный углевод — сахарозу, которую добавляли в различных концентрациях (2%, 4%, 6%, 8%). Было установлено, что при использовании концентраций сахарозы 2—6% препарат обладал высокой гигроскопичностью, что приводило к плавлению массы и снижению активности дифтерийного и столбнячного компонентов. Использование сахарозы в концентрации 8% обеспечивало образование плотной пористой массы, сохранение специфической активности антигенов на исходном уровне. При этом были получены липосомы стандартного состава, основную массу которых составляли частицы размером 150—170 нм (до 100% всех ли-посом).
Установлено, что разработанный режим сублимации и концентрация криопротекто-ра (8%) обеспечивает остаточную влажность основной массы ЛДС-М-вакцины в диапазо-
не 3,5±0,5% и поддерживает стабильность препарата в течение 12 месяцев (срок наблюдения) (табл. 2).
Таблица 2
Изучение стабильности липосомальной лиофилизированной дифтерийно-столбнячной вакцины
Срок хранения рН Характеристика ЛДС-М-вакцины
средний размер, нм специфическая активность, Ц/мл
дифтерийный компонент столбнячный компонент
1 мес. 6,95 152,0 10 10
6 мес. 7,05 158,2 10 10
12 мес. 7,00 166,7 10 10
После определения основных технологических параметров получения лиофилизированной липосомальной дифтерийно-столб-нячной вакцины представлялось целесооб-
разным изучить качественные характеристики полученного препарата, из которых основной является иммуногенная активность. Результаты испытания иммуногенных свойств ЛДС-М-вакцины представлены в таблицах 3, 4.
Из представленных в таблицах данных видно, что разработанный липосомальный препарат обеспечивает резистентность иммунизированных морских свинок и белых мышей к дифтерийному и столбнячному токсинам. Показатель выживаемости в обеих группах животных составил 100% при регламентированных требованиях: 100% — для дифтерийного компонента и не менее 70% — для столбнячного компонента [5]. Дополнительные испытания липосомально-го препарата в опытах на морских свинках показали, что группы животных, в которых использовался ЛДС-М, имели уровень антител, сопоставимый с уровнем антител, инду-
Таблица 3
Результаты изучения протективных свойств ЛДС-М-вакцины в опытах на животных
Препарат Столбнячный компонент Дифтерийный компонент
Количество мышей до/после введения 50 LD100 столбнячного токсина Количество морских свинок до/после введения 100 Dlm дифтерийного токсина
ЛДС-М-вакцина 11/11 4/4
АДС-М-анатоксин, адсорбированный на геле гидроксида алюминия * 11/11 4/4
Примечание. * — контроль.
Таблица 4
Результаты изучения иммуногенных свойств липосомальной АДС-М-вакцины
в опытах на морских свинках
Препарат Средняя геометрическая титра (СГТ), мМЕ/мл
Дифтерийный компонент Столбнячный компонент
ЛДС-М-вакцина 3213,33** [881,97—8090,22] 3341,93 ** [316,48—6569,70]
АДС-М-анатоксин, адсорбированный на геле гидроксида алюминия * 3302,72 [746,92—14 604,05] 3441,33 [1164,04—10 173,86]
Примечание. * — контроль; ** — различия средних величин не существенны по сравнению с контролем.
цируемых АДС-М-анатоксином. Последний адсорбирован на геле гидроксида алюминия.
Кроме того, показано, что разработанный препарат по показателям стерильности, токсичности, специфической безопасности полностью соответствует требованиям, предъявляемым к коммерческому АДС-М-анатоксину. Полученная липосомальная вакцина не обладает пирогенными свойствами: максимальная сумма изменения температуры у кроликов при внутривенном введении составила 0,3°С. Таким образом, результаты проведенных исследований показали перспективность использования ли-посом в качестве адъюванта комбинированных вакцин. Необходимо дальнейшее углубленное изучение свойств липосомаль-ных форм вакцинных препаратов.
Выводы
Разработана технология получения ли-посомальной формы комбинированной вакцины для парентерального введения. Ли-посомальная вакцина, полученная по разработанной технологии, по показателям пирогенности, стерильности, токсичности, специфической безопасности полностью отвечает требованиям, предъявляемым к вакцинным препаратам.
Установлено, что липосомы обладают выраженными адъювантными свойствами. В опытах на животных липосомальная вакцина проявила иммуногенные свойства, сопоставимые с коммерческим, адсорбированным на геле гидроксида алюминия, дифте-рийно-столбнячным анатоксином.
Библиографический список
1. Адъюванты как важный компонент вакцин. Биопрепараты 2010; 4 (40): 37-39.
2. Краснопольский Ю. М, Степанов А Е, Швец В. И. Липидная технологическая платформа для создания новых лекар-
ственных форм и транспорта активных фармацевтических субстанций. Биофармацевтический журнал 2011; 3 (2): 10-18.
3. Николаева А. М, Сперанская В. Н, Сосни-на О. Ю. Новый подход к определению подлинности комбинированных вакцин для профилактики дифтерии, столбняка и коклюша. Сибирский медицинский журнал 2011; 26 (2): 70-75.
4. Швец В. И, Каплун А. П., Краснопольский Ю. М. От липосом семидесятых к на-нобиотехнологии XXI века. Российские нанотехнологии 2008; 3 (11-12): 6—20.
5. Diphteria and Tetanus vaccine (adsorbed). European Pharmacopeia, 6th Edition, 2007; 763—764.
6. Erxia Shen, Li Li et al. PIKA as an adjuvant enhances specific humoral and cellular immune responses following the vaccination of mice with HBsAg plus PIKA. Cellular and molecular immunology 2007; 4: 113—120.
7. Heurtault B, Saulnier P., Pech B. Physico-chemical of colloidal lipid particles. Biomaterials 2003; 24: 4283—4300.
8. Laura J. Peek, C. Russell Middaugh, Cory Berkland. Nanotechnology in vaccine delivery. Advanced drug delivery reviews 2008; 60: 915—928.
9. Manmohan S. Vaccine adjuvants and delivery systems. Hoboken, New Jersey, USA: John Wiley and Sons 2007; 457.
10. Nathalie Garcon, Oberdan Leo. Innate immunity and vaccine adjuvants: from concepts to the development of a unique adjuvant system AS04 used for the formulation of a human papillomavirus vaccine. Current cancer therapy reviews 2010; 6: 126—137.
11. Subroto Chatterjee, Dipak K. Banerjee. Preparation, isolation and characterization of liposomes containing natural and synthetic lipids. Methods in Molecular Biology 2007; 199: 3—16.
Материал поступил в редакцию 01.06.2012
