CC BY
58
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ и ммунология ♦
УДК 619: 616.98: 579.852.13
Интерференция компонентов в поливалентной вакцине против клостридиозов крупного и мелкого рогатого скота
О.Д. Скляров1, доктор ветеринарных наук, заведующий лабораторией качества и стандартизации бактерийных лекарственных средств (79169596530@ya.ru), А.В. Капустин2, кандидат ветеринарных наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии с музеем типовых культур (kapustin_andrei@mail.ru), А.И. Лаишевцев2, научный сотрудник лаборатории микробиологии с музеем типовых культур (a-laishevtsev@bk.ru), А.М. Гулюкин2, кандидат биологических наук, заместитель директора по инновационной работе (admin@viev.ru).
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский Государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (123022, Москва, Звенигородское шоссе д. 5).
2 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)» (109428, г. Москва, Рязанский проспект, д. 24, к. 1).
При разработке современных средств специфической профилактики инфекционных болезней животных особое внимание нужно уделять минимизации явлений интерференции.
Цель исследования. Определить наличие интерференции между антигенами в комплексной вакцине против анаэробных болезней жвачных животных «Клостбовак-8».
Материалы и методы. В работе использованы антигены, входящие в состав препарата «Клостбовак-8». Отсутствие интерференции определяли, сравнивая иммуногенную активность препаратов, выполненных в виде моновакцин, с аналогичным показателем ассоциированного препарата. Иммуногенную активность оценивали в ходе постановки реакции нейтрализации (РН) для компонентов Cl. perfringens типов А, С, D, Cl. tetani, Cl. novyi тип В, и при биологическом заражении вирулентными штаммами вакцинированных животных для компонента Cl. chauvoei и Cl. septicum. Критерием иммуногенной активности служила выживаемость животных. Результаты. Иммуногенная активность серий моновакцин из компонентов Cl. perfringens типов А, С, D и Cl. tetani при проведении РН и моновакцин из Cl. chauvoei при биологическом заражении животных позволила получить 100%-ю выживаемость лабораторных животных, как и в случае ассоциированного препарата. Иммуногенная активность компонента Cl. novyi тип В и Cl. septicum, выполненных в виде моновакцины, позволила получить 100%-ю выживаемость животных, в то время как значение данного показателя для ассоциированного препарата составило 80 % и 90 %, соответственно.
Заключение. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии взаимного отрицательного влияния любого из компонентов препарата. Иммунизация моновакцинами и вакциной «Клостбовак-8» индуцирует у лабораторных животных одинаково высокий уровень иммунитета, обеспечивающий выживаемость после заражения вирулентными штаммами 80...100 % подопытных животных.
Ключевые слова: интерференция, клостридии, анаэробные инфекции, вакцинация, иммунитет, безвредность, иммуногенность, отечественные препараты Сокращения: ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения, РН—реакция нейтрализации, DLM — dosis letalis minima (минимальная летальная доза), LD — dosis letalis (летальная доза)
Введение
Клостридиозы представляет серьезную проблему ветеринарной медицины, о чем свидетельствуют материалы ВОЗ и сообщения исследователей [7]. Анаэробные инфекции протекают с явлениями тяжелой интоксикации и почти всегда заканчиваются летально [3, 4]. Их развитию способствуют травмы с нарушением целостности кожных покровов или слизистых оболочек и загрязнение раны материалом, содержащим споры клостридий [6]. При этом поражение органов и тканей вызывается, как правило, ассоциацией нескольких видов клостридий, что значительно отягощает процесс. Специфическая профилактика остается единственным надежным способом
предупредить развитие анаэробных инфекций, а поскольку они вызываются, как правило, ассоциацией возбудителей, целесообразно использовать ассоциированные вакцины, включающие в себя широкий спектр клинически значимых возбудителей [1, 2].
Ученые-исследователи, занятые созданием новых иммунобиологических препаратов, должны стремиться к изобретению вакцины, которая при однократном введении не парентеральным методом обеспечит формирование пожизненного иммунитета к большинству клинически значимых инфекционных болезней без каких-либо побочных эффектов. В настоящее время не существует препарата, который бы соответствовал этим требованиям.
Один из способов достижения указанной цели — разработка ассоциированных вакцин на основе существующих монопрепаратов. При использовании ассоциированных вакцин удается оптимизировать схему вакцинаций, кроме того, в значительной степени снижаются количество стрессов у животных и нагрузка на ветеринарных врачей.
Теоретически число компонентов в ассоциированных вакцинах может быть неограниченным, однако следует учитывать, что между антигенами при их совместном введении возникает определенное взаимодействие, часто снижающее эффект вакцинации в сравнении с иммунизацией монопрепаратами. Однако при правильном подборе штаммов и концентраций антигенов в комплексных вакцинах можно избежать сильного отрицательного воздействия их друг на друга (отсутствие интерференции) [5]. В организме существует огромное разнообразие субпопуляций лимфоцитов с разными видами специфичности, в связи с чем, практически каждый антиген может найти соответствующий клон лимфоидных клеток, способных отвечать выработкой антител или обеспечивать формирование эффекторов клеточного иммунитета.
Одни антигены могут угнетать активность других не из-за количества в комплексном препарате, а вследствие своих иммунобиологических свойств. Это надо учитывать при компоновке препарата, вводя в его состав большее количество менее активных антигенов. Помимо отрицательного воздействия антигенов друг на друга в отдельных случаях может наблюдаться феномен синергии, когда один компонент вакцины стимулирует активность другого.
Цель исследования
Определить наличие интерференции между антигенами в комплексной вакцине против анаэробных болезней жвачных животных «Клостбовак-8».
Материалы и методы
Для изучения интерференции компонентов поливалентной вакцины против клостридиозов изготовили моновакцины из каждого вида клостридий, входящих в ее состав. Экспериментальные образцы антигенов готовили в лабораторных условиях, культивировали на стандартных питательных средах ведущих мировых производителей микробиологической продукции, что способствовало не только высокому уровню токси-нообразования, но и в значительной мере позволяло стандартизировать процедуру культивирования.
Полученные после культивирования, инактивации, очистки и концентрирования анатоксины клостридий адсорбировали на адъюванте гидроксида алюминия. Каждый из монопрепаратов (против эмфизематозного карбункула, злокачественного отека, анаэробной эн-теротоксемии, некротического гепатита, столбняка) проверяли по следующим показателям: внешний вид, рН, стерильность, безвредность введения в рекомендованной дозе, иммуногенная и антигенная активность.
С целью определения наличия интерференции между компонентами изготовили экспериментальную серию поливалентной вакцины, смешивая отдельные компоненты в эффективном количестве. Полученный образец препарата был исследован по тем же параметрам, что и моновакцины.
Иммуногенную активность компонентов определяли в соответствии с принятыми в РФ методами контроля: по результатам РН стандартизированных токсинов клостридий и по выживаемости после заражения иммунизированных и контрольных лабораторных животных.
• рвж •
Результаты и обсуждение
Для выполнения поставленных задач на первом этапе исследования подобрали питательные среды для культивирования производственных штаммов С1. рег-fringens типов А, С, О, С1. поуу! типа В, С1. ЬеЬат, на которых обеспечивалось максимальное накопление токсинов при соблюдении технологии выращивания. Также были подобраны среды для культивирования штаммов С1. septicum и С1. chauvoei, способствовавшие максимальному накоплению бактериальной массы.
Проведено глубинное культивирование штаммов клостридий, получены анатоксины и бактериальная масса. Культуры и токсины инактивировались путем дробного добавления формалина до конечной концентрации 0,5 %. Обезвреженные культуры токсиген-ных штаммов сепарировали для отделения бактериальных клеток, полученный супернатант концентрировали, проверяли на стерильность и адсорбировали путем добавления 15%-го раствора гидроксида алюминия.
Для проверки на безвредность экспериментальной серии вакцины использовали 10 белых мышей, 5 морских свинок и 2 ягнят. Мышам вакцину вводили подкожно в дозе 0,5 мл, морским свинкам подкожно в области спины в дозе 2,0 мл, ягнятам подкожно в области бесшерстной поверхности под локтевым суставом в дозе 5,0 мл. Срок наблюдения за животными составлял 10 суток.
Установлено, что в течение срока наблюдения все животные оставались живыми и клинически здоровыми. Образовавшиеся на месте инъекций у ягнят ограниченные безболезненные уплотнения самостоятельно рассасывались в течение 5...8 дней.
Отсутствие интерференции определяли в опыте изучения иммуногенной активности моновакцин в сравнении с иммуногенностью каждого компонента в комплексном препарате. Иммуногенность в отношении С1. ре^п^еш типов А, С, О, С1. tetani, С1. novyi типа В, оценивали путем постановки РН токсинов указанных видов клостридий антителами сыворотки крови вакцинированных кроликов.
С этой целью иммунизировали 8 кроликов массой 2,5.3,0 кг поливалентной экспериментальной вакциной и по 8 кроликов каждым монопрепаратом. Вакцину вводили двукратно подкожно с интервалом 25 дней в дозе 1,5 мл, моновакцины — в дозе 0,5 мл. Через 14 дней после второй вакцинации у кроликов брали кровь, получали пробы сыворотки, которые объединяли в равных объемах.
Для постановки РН использовали стандартизированные токсины С1. perfringens типов А, С, О и С1. novyi с установленной активностью 20 ОЬМ/мл для белых мышей массой 16.20 г и токсин С1. tetani с установленной активностью 100 ОЬМ/мл.
Общую пробу сыворотки разливали в 5 пробирок по 1,0 мл, после чего в них вносили рабочие растворы токсинов клостридий по 1,5 мл: в № 1 — С1. perfringens типа А, № 2 — С1. perfringens типа С, в № 3 — С1. perfringens типа О, № 4 — С1. novyi, № 5 — С1. tetani. Смесь токсинов с сывороткой перемешивали и прогревали 45 мин при 37 оС. Затем каждую пробу смеси вводили 5 мышам внутривенно в дозе 0,5 мл.
№ 1/2017 • 21
О.Д. Скляров, А.В. Капустин, А.И. Лаишевцев, А.М. Гулюкин
Для контроля активности токсинов каждый из них разводят так, чтобы в 1,0 мл раствора содержалось
2 ОЬМ для белых мышей массой 16.20 г. Растворы токсинов перемешивали, прогревали в термостате 45 мин при 37 оС и вводили внутривенно белым мышам в дозе 0,5 мл, используя по 5 мышей на каждую пробу
Критерием оценки служила выживаемость подопытных животных в течение 72 ч: вакцину считали активной, если после введения мышам смеси токсина с сывороткой живыми оставались не менее 4 из 5 животных при гибели не менее 4 контрольных белых мышей. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Для проверки активности компонента С1. оЬаиуов! экспериментальную вакцину вводили 10 морским свинкам двукратно подкожно с интервалом 18 дней в дозе 1,0 мл, моновакцину — в дозе 0,4 мл. Через 14 дней после второй вакцинации 10 иммунизированных и 10 контрольных морских свинок заражали ли-офилизированной споровой культурой вирулентного штамма С1. сЬапуов! в смертельной дозе. Заражающую культуру вводили внутримышечно в дозе 0,1 мл с добавлением 0,2 мл 10%-го раствора хлорида кальция.
Вакцину считали активной, если после заражения выживаемость подопытных морских свинок составляла не менее 80 % при гибели 80.100 % контрольных. Срок наблюдения за животными — 5 суток. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Иммуногенную активность вакцины в отношении С1. 8вр11спт проверяли путем заражения вакцинированных белых мышей контрольным штаммом С1. звр-Исит № 1098.
Моновакцину вводили 10 белым мышам массой 16.20 г двукратно подкожно с интервалом 25 дней в области холки в дозе по 0,2 мл, комплексный препарат — в дозе 0,5 мл. Через 14 дней после второй вакцинации 10 иммунизированных и 10 контрольных белых мышей заражали лиофилизированной споровой культурой контрольного штамма №1098 в дозе
3 Ь050. Заражающую культуру вводили внутрибрю-шинно по 0,5 мл.
Вакцину считали активной, если в течение 3 суток после заражения выживало не менее 80 % иммунизированных белых мышей при гибели 80.100 % контрольных животных. Результаты исследования представлены в таблице 3.
Как видно из приведенных в таблицах 1.3 данных, экспериментальная комплексная вакцина обеспечивала образование заявленного уровня напряженности иммунитета практически у 100 % подопытных животных. Эти показатели не имели существенных отличий от иммуногенности моновакцин, при этом следует учитывать, что в обоих случаях животных иммунизировали одинаковыми дозами действующих веществ, только в комплексной вакцине они были более концентрированы. Так, вакцина обеспечивала 90%-ю выживаемость против заражения С1. звр11сит, 100%-ю против заражения С1. сЬаиуов!, 90.100%-ю выживаемость мышей в тесте нейтрализации токсинов компонентов С1. perfringens, С1. novyi и С1. 1в1аш.
1. Результаты контроля иммуногенной активности компонентов Cl. perfringens типов А, С, D, Cl. novyi тип B, Cl. tetani The results of control of the immunogenic activity of components Cl. perfringens types A, C, D, Cl. novyi type B, Cl. tetani
Наимеиоваиие препарата Доза Число зараженных Выжившие
Наименование препарата Д°за животных животные, n/%
Моновакцина 0,5 5 5/100
С. perfringens тип А 0,5
«Клостбовак-8» 1,0 5 5/100
1,0
Контрольные - 5 0/0
Моновакцина 0,5 5 5/100
С. perfringens тип С 0,5
«Клостбовак-8» 1,0 5 5/100
1,0
Контрольные - 5 0/0
Моновакцина 0,5 5 5/100
С. perfringens тип Д 0,5
«Клостбовак-8» 1,0 5 5/100
1,0
Контрольные - 5 0/0
Моновакцина С1. tetani 0,5 5 5/100
«Клостбовак-8» 0,2 5 5/100
Контроль - 5 0/0
Моновакцина С1. почу\ тип В 0,5 5 5/100
«Клостбовак-8» 0,2 5 4/80
Контроль - 5 0/0
2. Результаты контроля иммуногенной активности компонента Cl. chauvoei The results of control of the immunogenic activity of component Cl. chauvoei
Группа животных Доза Число зараженных животных Выжившие животные, n/%
Вакцинированы 0,4 5 5/100
моновакциной 0,4
Вакцинированы 1,0 5 5/100
«Клостбовак-8» 1,0
Контрольные - 5 0/0
3. Результаты контроля иммуногенной активности компонента Cl. septicum The results of control of the immunogenic activity of component Cl. septicum
Группа животных Доза Число зараженных животных Выжившие животные, n/%
Моновакцина Cl. septicum 0,2 10 10/100
0,2
«Клостбовак-8» 0,5 10 9/90
0,5
Контрольные - 10 0/0
Полученные результаты позволяют считать, что компоновка экспериментальной вакцины однородными антигенами позволила избежать отрицательного влияния их друг на друга при индуцировании иммунитета против широкого спектра болезней, вызываемых клинически значимыми видами клост-ридий.
Заключение
Проведенные опыты по изучению интерференции между компонентами в поливалентной вакцине против клостридиозов животных подтвердили высокую им-муногенную активность комплексного препарата. Как видно из представленных в таблицах данных, между компонентами вакцины практически отсутствует отрицательное взаимное влияние, что проявляется выживаемостью 80.100 % иммунизированных лабораторных животных как в группах, вакцинированных моновакцинами, так и вакцинированных поливалентной вакциной «Клостбовак-8».
Библиография
1. Капустин, А.В. Эффективность применения вакцины «Клостбовак-8» против клостридиозов крупного рогатого скота, вызванных различными видами Clostridium spp. / А.В. Капустин // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. — 2016. — № 9. — С. 6-11.
2. Скляров, О.Д. Изучение иммуногенной активности столбнячного компонента в составе ассоциированной вакцины против клостридиозов крупного рогатого скота / О.Д. Скляров // Ветеринария Кубани. — 2016. — № 4. — С. 15-17.
3. Скородумов, Д.И. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных. / Д.И. Скородумов. — М.: ИзографЪ, 2005. — С. 344-346.
4. Сторожев, Л.И. Инфекционные болезни животных / Л.И. Сторожев. — М.: Агропро-миздат, 1987. — С. 228-229.
5. Kapustin, A.V. Pasteurellosis of cattle caused by Mannheimia haemolytica / A.V. Kapustin // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. — 2016. — Vol. 52. — No. 4. — pp. 3-12.
6. Kovaleva, E. Phage detection of pathogen microorganisms in agricultural ecosystems monitoring as part of sectoral foresight / E. Kovaleva // International Journal of Research in Ayurveda and Pharmacy. — 2016. — Vol. 7. — No. S2. — pp. 247-249.
7. Plmenov, N. Etiology and cllnico-morphologlcal manifestation of anaerobic enterotoxaemia of young cattle / N. Pimenov // International Journal of Research in Ayurveda and Pharmacy. — 2016. — Vol. 7. — No. S2. — pp. 228-231.
References
1. Kapustin A.V., Veterinariya, zootekhniya i biotekhnologiya, 2016, No. 9, pp. 6-11.
2. Sklyarov O.D., Veterinariya Kubani, 2016, No. 4, pp. 15-17.
3. Skorodumov D.I., Mikrobiologicheskaya diagnostika bakterial'nyh boleznej zhivotnyh (Microbiological diagnostics of the bacterial diseases of the animals), Moscow, 2005, pp. 344-346.
4. Storozhev L.I. Infekcionnye bolezni zhivotnyh (Infectious diseases of the animals), Moscow, Agropromizdat, 1987, pp. 228-229.
5. Kapustin A.V., Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences, 2016, Vol. 52, No. 4, pp. 3-12.
6. Kovaleva E., International Journal of Research in Ayurveda and Pharmacy, 2016, Vol. 7, No. S2, pp. 247-249.
7. Pimenov N., International Journal of Research in Ayurveda and Pharmacy. 2016. Vol. 7, No. S2, pp. 228-231.
ABSTRACT
O.D. Sklyarov1, A.V. Kapustin2, A.I. Laishevtcev2, A.M. Gulyukin2
1 The All-Russian State Center for Quality and Standardization of Veterinary Drugs and Feed (VGNKI) (123022, Russia, Moscow, Zvenigorodskoe shosse, 5).
2 All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Ya. R. Kovalenko (VIEV) (109428, Moscow, Ryazanskyi prospect, str. 24-1).
Interference of Components in a Polyvalent Vaccine against Clostridiosis of Cattle and Small Cattle. In the development of modern means for specific prevention of infectious diseases of animals, particular attention should be given to minimizing the interference.
Research objective. To determine the presence of interference between antigens in complex vaccine against anaerobic diseases of ruminants «Klostobovak-8».
Materials and methods. In this scientific work we used antigens included in the composition of the drug «Klostbovak-8». The lack of interference was determined by comparing the immunogenic activity of the preparations, in the form of monovalent vaccine, with the same indicator of the associated drug. Assessment of immunogenic activity was carried out during the production process the neutralization for components Cl. perfringens types A, C, D, Cl. tetani, Cl. novyi T., and the biological contamination with virulent strains of immunized animals for the component Cl. chauvoei and Cl. sep-ticum. Immunogenic activity criterion was the survival of animals.
Results. Immunogenic activity of a series of the monovalent vaccines from components Cl. perfringens types A, C, D, and Cl. tetani in conducting reaction of neutralization (RN) and of monovalent Cl. chauvoei during a biological contamination of the animals allowed us to obtain 100 % survival of laboratory animals, as in the case of associated drug. Immunogenic activity of a component CL. novyi type B and Cl. septicum is made in the form of a single or possible to obtain 100 % survival of animals, while the value of this indicator for the associated drug was 80 % and 90 %, respectively. Conclusion. Findings obtained indicate the absence of the lack of mutual negative influence of any component of the drug. Immunization of monovalent vaccine «Klostbovak-8» induces in laboratory animals the same high level of immunity, providing survival after infection with virulent strains of 80...100 % of the experimental animals. Key words: Interference, clostridium, anaerobic infections, vaccination, immune system, safety, immunogenicity, domestic medicines.
Эпидемиологические показатели в РФ
(по данным ФГБУ ВНИИЗЖ ИАЦ Управления ветнадзора за III квартал 2016 года)
Эпидемический порог был превышен по следующим заболеваниям
• в I квартале 2016 г. — по бруцеллезу КРС и болезни Ньюкасла;
• во II квартале 2016 г. — по бруцеллезу КРС, АЧС, нодулярному дерматиту, КЧС, болезни Ньюкасла;
• в III квартале 2016 r. — по нодулярному дерматиту, оспе овец, АЧС и сибирской язве
Эпидемический порог на основе ординарного неблагополучия — величина, превышение которой сообщает об эпизоотии. Расчет основан на выведении среднего показателя и стандартной ошибки среднего как минимум по 12 точкам (периодам времени). Порог устанавливают в две стандартные ошибки среднего (M + 2m). Если фактическое значение превосходит М + 2м, то можно утверждать, что ситуация ухудшилась и наблюдается эпидемическое нарастание процесса, во всех прочих случаях — следует считать, что ситуация относительно стабильна.
Информационно-аналитический центр Россельхознадзора http://www.fsvps.ru/fsvps/iac/rf/
