Деструкция хитозана в растворе под действием фермента гиалуронидазы Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 541.64:536

ДЕСТРУКЦИЯ ХИТОЗАНА В РАСТВОРЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФЕРМЕНТА

ГИАЛУРОНИДАЗЫ

© В. В. Чернова1, В. П. Володина2, Е. И. Кулиш1*, С. В. Колесов1

1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Тел.: +7 (340) 273 66 08.

2Институт органической химии Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.

Е-mail: alenakulish@rambler. ш

Рассмотрены особенности протекания ферментативной деструкции хитозана в растворах уксусной кислоты под действием фермента гиалуронидаза. Оценено влияние концентрации хитозана, концентрации фермента и концентрации уксусной кислоты в растворе, а также температуры процесса на степень ферментативного разложения хитозана в растворе. По степени падения молекулярных масс в ходе деструкции предполагается, что неспецифический фермент гиалуронидаза разрушает основную цепь хитозана.

Ключевые слова: хитозан, фермент, деструкция, молекулярная масса.

Уникальные свойства получаемого из возобновляемого природного сырья природного полисахарида хитозана (ХТ) - его совместимость с тканями человека, биоинертность и бактериостатич-ность, влагопроницаемость и другие свойства -делают его полимером, пригодным для использования в медицинских целях [1, 2]. Среди многочисленных достоинств ХТ - его биоразрушаемость до обычных для организма веществ. Это определяет возможность использования данного полимера при создании биодеградируемых полимерных носителей в виде пленок, например, в терапии ожоговых ран [3-5]. В условиях медицинского применения хитозановых материалов их биодеградация осуществляется под действием неспецифических ферментов (в том числе ферментов, присутствующих на коже - коллагеназы, гиалуронидазы и др.). В связи с этим рассмотрение факта деструктирующего влияния на ХТ неспецифических ферментов представляется важной задачей как с научной, так и с практической точек зрения.

В качестве объектов исследования был выбран образец ХТ (ТУ 6-09-05-296-76, фирма «Химмед» Россия), полученный щелочным дезацетилировани-ем крабового хитина (степень деацетилирования ~75% с Мп=120000), и ферментный препарат гиалуронидаза (ГУП «Иммунопрепарат», Уфа). Растворы ХТ готовили перемешиванием в течение 810 часов при комнатной температуре. В качестве растворителя была использована уксусная кислота концентрацией 1, 5 и 10 г/дл. Ферментный препарат, предварительно растворенный в небольшом количестве воды, вносили в раствор ХТ непосредственно перед началом изучения процесса деструкции. Температура проведения процесса составляла 25, 35 и 40 °С. Глубину деструктивного превращения ХТ в растворе оценивали по падению относительной вязкости раствора ХТ в присутствии фермента Д'Л по отношению к относительной вязкости исходного раствора ХТ ^о, (в %). Значение относительной вязкости раствора фермента составляло

менее 1% от вязкости раствора ХТ, и его вклад в значения вязкости раствора не учитывался. Характеристическую вязкость ХТ определяли вискози-метрически в буферном растворе, состоящем из 0.3 м. уксусной кислоты и 0.2 М ацетата натрия, согласно стандартной методике [6]. Ошибка эксперимента составляла не более 5%.

Фермент гиалуронидаза катализирует реакции гидролитического расщепления и деполимеризации основного компонента соединительной ткани - гиа-луроновой кислоты [7]. Гиалуроновые кислоты представляют собой высокомолекулярные линейные биополимеры, молекулы которых построены из чередующихся остатков Б-глюкуроновой кислоты и N ацетил-Б-гликозамина, соединенных р-(1—>4)- и р-(1—3)-связями (рис. 1.а). ХТ является аминополиса-харидом, т. е. веществом с близкой к гиалуроновой кислоте химической структурой (рис. 1. б), и, как оказалось, под действием гиалуронидазы в нем также протекает процесс ферментативного разложения.

Как показали вискозиметрические исследования, выдержка растворов ХТ в присутствии фермента в течение 26 часов сопровождается постепенным уменьшением относительной вязкости раствора, что свидетельствует о протекании процесса деструкции. Однако как видно из рис. 2, для того, чтобы процесс деструкции стал ощутим, требуются весьма существенные количества фермента. Наличие фермента в растворе порядка 0.1-0.5% масс. по отношению к ХТ не вызывает заметного уменьшения относительной вязкости раствора. Ощутимым процесс деструкции становится только лишь при содержании фермента >1% масс.

В общем случае степень деструктивного превращения ХТ от содержания фермента в растворе зависит нелинейным образом (рис. 3).

Влияние концентрации ХТ в растворе на степень его ферментативного превращения имеет характер экстремальной зависимости между степенью падения относительной вязкости и его содержанием в растворе (рис. 4).

* автор, ответственный за переписку

Рис. 1. Фрагмент цепи гиалуроновой кислоты (а) и хитозана (б).

Лт)

^0

Рис. 2. Изменение вязкости раствора хитозана от времени выдержки с ферментом. Концентрация хитозана в растворе -2 г/дл. Концентрация уксусной кислоты в растворе - 1 г/дл. Соотношение фермент:ХТ в растворе 0.5: 99.5 (1), 1: 99 (2), 5: 95 (3) и 10: 90 (4). Температура процесса 25 °С.

Данный характер зависимости может быть объяснен, если учесть тот факт, что область концентраций ХТ порядка 0.35-0.4 г/дл соответствует области кроссовера, т. е. области перехода полимера из разбавленного раствора к раствору полуразбав-ленному. Несмотря на небольшую количественную разницу в значениях содержания ХТ в растворе до и после точки кроссовера, качественно надмолеку-

лярная структура полимера в разных концентрационных режимах принципиально различна [8]. В области разбавленного раствора надмолекулярная структура раствора представляет собой изолированные набухшие макромолекулярные клубки ХТ, доступность звеньев которых для взаимодействия с ферментом высока.

Дг|

1:99 5:95 10:90

соотношение фермент:ХТ

Рис. 3. Изменение вязкости раствора хитозана от содержания в растворе фермента. Концентрация уксусной кислоты в растворе - 1 г/дл. Выдержка раствора хитозана с ферментом - 3 часа. Содержание хитозана в растворе 0.2 г/дл (1), 0.3 г /дл (2), 0.4 г /дл (3), 0.7 г /дл (4), 1.0 г/дл (5) и 2.0 г/дл (6). Температура процесса 25° С.

Лг|

0.2 0.6 10 2.0

в растворе, г/дл

Рис. 4. Изменение вязкости раствора хитозана от его содержания в растворе. Концентрация уксусной кислоты в растворе - 1 г/дл. Выдержка раствора хитозана с ферментом - 3 часа. Соотношение фермент:ХТ 1:99 (1), 5:95(2), 10:90 (3). Температура процесса 25° С.

При переходе к полуразбавленному режиму раствор представлен перекрывающимися между собой агрегатами макромолекул, создающими определенные диффузионные затруднения для взаимодействующего с ними фермента. Очевидно, что доступность звеньев полимера для взаимодействия с ферментом с переходом к полуразбавленному раствору уменьшается, что, вероятно, и сопровождается уменьшением степени деструкции ХТ в растворе.

Повышение температуры проведения реакции ферментативной деструкции ХТ приводит к увеличению степени ферментативного разложения (рис. 5), на котором сказывается, однако, изменение концентрации используемой в качестве растворителя уксусной кислоты.

По всей вероятности для растворов уксусной кислоты каждой концентрации имеется свой температурный оптимум, соответствующий максимальной степени

деструкции ХТ. Соответственно и для каждой температуры процесса имеется определенная концентрация уксусной кислоты, обеспечивающая наибольшую глубину превращения ХТ. Например, при 25° С максимальной степени деструкции ХТ соответствует концентрация уксусной кислоты в растворе равная 5 г/дл (рис. 6).

Очевидно, что наблюдаемые закономерности измерения относительной вязкости отражают объективно проходящие в растворе ХТ процессы ферментативного разложения полимера.

Изменения молекулярной массы ХТ в ходе деструкции рассчитаны по уравнению Марка-Куна-Хаувинка для ХТ в буферном растворе [9, 10] (табл.).

Как видно из представленных данных, в ряде случаев степень деструкции весьма значительна - молекулярная масса ХТ падает практически в 2 раза. Кроме этого, можно отметить, что с увеличением температуры происходит существенное нивелирование различия в степенях деструкции для растворов ХТ, отличающихся кислотностью среды. Как видно из данных табл., при температуре деструкции равной 45° С степень падения молекулярной массы практически одинакова для растворов ХТ в 1 и 10%-ной кислоте, в то время как при 25° С разница весьма существенна (на 6800 и 37000 соответственно).

Таблица

Характеристики образцов хитозана, выделенных из 2%-ного раствора хитозана в уксусной кислоте (Время выдержки с ферментом -3 часа. Соотношение фермент:ХЗ - 10:90)

Т, О о [СН3СООН], Изменение в ходе

г/дл Д[Г|] ДМ

1 0.25 6800

25

10 1.05 37000

1 1.45 53000

35

10 0.80 27000

1 0.85 29000

45

10 0.70 23000

Рис. 5. Изменение вязкости раствора 2%-ного хитозана от температуры. Концентрация уксусной кислоты в растворе - 1 г/дл (а) и 10 г/дл (б). Выдержка раствора хитозана с ферментом - 3 часа. Соотношение фермент:ХТ 1:99 (1), 5:95(2) и 10:90 (3).

Рис. 6. Изменение вязкости 2%-ного раствора хитозана от кислотности среды. Выдержка раствора хитозана с ферментом - 3 часа. Соотношение фермент:ХТ 1:99 (1), 5 :95 (2) и 10:90 (3). Температура 25° С.

Выводы

1. Обнаружен факт протекания ферментативной деструкции хитозана в растворе уксусной кислоты под действием фермента гиалуронидаза.

2. Определено влияние на степень ферментативного разложения:

а) концентрации хитозана в растворе - в интервале концентраций 0.2-2% масс. наблюдается экстремальная зависимость степени падения относительной вязкости с максимумом в области точки кроссовера;

б) концентрации фермента в растворе - в интервале концентраций 0.1-10% масс. как общая тенденция

наблюдается уменьшение степени влияния фермента на процесс деструкции хитозана;

в) концентрации уксусной кислоты в растворе -при температуре 25° С в интервале рН равных от 2.71 до 2.21 наблюдается экстремальная зависимость степени падения относительной вязкости с максимумом в области рН = 2.36 (соответствующей 5%-ной кислоте).

3. По степени падения молекулярных масс в ходе деструкции можно предположить, что неспецифические ферменты разрушают основную цепь хитозана.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и Республики Башкортостан (грант

р_поволжье_а №08-03-97030).

ЛИТЕРАТУРА

1. Muzzarelli R. A. Chitin. Oxford : Pergamon Press, 1977.

2. Марквичева Е. А. // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. М.: Наука, 2002. С. 315-326.

3. Гальбрайх Л. С. // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. №1.С. 51

4. Сливкин А. И., Лапенко В. Л., Арзамасцев А. П., Болгов А. А. // Вестник ВГУ. 2005. Серия: Химия. Биология. Фармация. №2. С. 73-87.

5. Ильина А. В., Варламов В. П. // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение. М.: Наука, 2002. С. 79-90.

6. Рафиков С. Р., Будтов В. П., Монаков Ю. Б. Введение в физи-ко-химию растворов полимеров. М.: Наука, 1978. -328 с.

7. Meyer K. Hyaluronidases // The Enzimes. NY: Academic Press, 1971. V. 5, P. 307-320.

8. Кулиш Е. И., Володина В. П., Фаткуллина Р. Р., Колесов С. В., Заиков Г. Е. // Высокомолек.соед. 2008. Серия Б. Т. 50. №7. С. 1277-1280.

9. Агеев Е. П., Вихорева Г. А., Матушкина Н. Н., Пчелко О. М., Гальбрайх Л. С. // Высокомолек.соед. 2000. Серия А. Т. 42. №2. С. 333-339.

10. Гамзадзе А. И., Шлимак В. М., Скляр А. М // Äota Poly-merica. 1985. Вd. 36. № 8. S. 420.

Поступила в редакцию 28.I0.2008 г.