Изучение процесса ферментативного расщепления хитозана в растворе уксусной кислоты Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 541.64

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ ХИТОЗАНА В РАСТВОРЕ УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ

© Е. И. Кулиш1, И. Ф. Туктарова1*, В. В. Чернова1, С. В. Колесов1,2

1Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32. Тел./факс: +7 (347) 229 97 24. E-mail: tuktarova_irina@rambler. ru 2Институт органической химии Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.

С помощью метода вискозиметрии исследован процесс ферментативного расщепления хитозана в растворе уксусной кислоты и определены кинетические параметры под действием фермента гиалуронидазы.

Ключевые слова: хитозан, вязкость, ферментативное расщепление, гиалуронидаза.

Введение

Полисахарид хитозан в настоящее время находит все возрастающее практическое применение. Одним из перспективных направлений его использования является создание на его основе биологически активных защитных биодеградируемых полимерных материалов для медицинской практики. В этом случае биодеградация (ферментативное расщепление) хитозанового материала будет осуществляться под действием неспецифических ферментов человеческого организма (например, гиалуронидазы, присутствующей на раневой поверхности и др.). Скорость протекания этого процесса будет предопределять срок службы полимерного материала на раневой поверхности. Таким образом, изучение процесса ферментативного расщепления хитозана под действием неспецифических ферментных препаратов, представляется важной задачей, как с научной, так и с практической точки зрения. В данной работе определены кинетические параметры процесса ферментативного расщепления хитозана под действием фермента гиалуронидазы.

Экспериментальная часть

Для исследования был взят образец хитозана (ХТЗ) производства ЗАО «Биопрогресс» (Щелково, Россия) с молекулярной массой М8П=113000. В качестве ферментного препарата был использован ферментный препарат гиалуронидаза (торговое название препарата - «Лираза») производства «Микроген» (Москва, Россия). Концентрация ферментного препарата составляла 0.1, 0.2 и 0.3 г/л. В качестве растворителя ХТЗ была использована 1% уксусная кислота. Концентрация ХТЗ в растворе для проведения процесса ферментативного расщепления сфр варьировалась от 0.1 до 5 г/дл.

О процессе ферментативного расщепления судили по падению характеристической вязкости [л] ХТЗ. Характеристическую вязкость в растворе уксусной кислоты определяли при температуре 25 °С, пользуясь методом Иржака и Баранова [1]. Для определения значений исходной характеристической вязкости ХТЗ [л]0 использовали раствор с концен-

трацией с = 0.15 г/дл. Для определения значений характеристической вязкости в ходе проведения ферментативного расщепления [л], раствор ХТЗ в уксусной кислоте, к которому был добавлен раствор ферментного препарата, выдерживали в течение определенного времени. После этого, процесс ферментативного расщепления гасили кипячением исходного раствора в течение 30 минут на водяной бане. Далее из раствора исходной концентрации сфр готовился разведением раствор для определения характеристической вязкости, с концентрацией с = 0.15 г/дл. Процесс ферментативного расщепления проводили при температуре 36 °С.

Начальная скорость ферментативного расщепления хитозана У0 оценивалась на линейном участке по падению его характеристической вязкости [л] и рассчитывалась по формуле [2]:

Vo=

Ш п-1/а -1/а.

СфрК ([Л] '[Л]0 ) t

(1)

где сфр - концентрация хитозана в растворе, подвергаемом ферментативной деструкции, г/дл; 1 -время расщепления, мин; К и а - константы в уравнении Марка-Куна-Хаувинка [л] = КМа; М - молекулярная масса хитозана.

Для определения констант в уравнении Марка-Куна-Хаувинка, необходимых для вычисления значений начальной скорости ферментативного расщепления по уравнению (1) ,образец исходного ХТЗ был расфракционирован на 10 фракций в диапазоне значений молекулярных масс от 20000 до 150000 Да. Абсолютное значение молекулярных масс фракций ХТЗ было определено сочетанием методов скоростной седиментации и вискозиметрии.

Молекулярная масса фракций определялась по формуле:

\3/2

\ S h [ет]1/3N

М = 00 _A

sh An (1-vpn)

(2)

где Б0 - константа седиментации; п0 - динамическая вязкость растворителя, равная 1.2269 • 10-2 ПЗ; [П] - характеристическая вязкость, дл/г; КА - число

* автор, ответственный за переписку

ISSN 1998-4812

Вестник Башкирского университета. 2013. Т. 18. №3

689

Авогадро, равное 6.023 • 1023 моль-1; (1-ур0) - Архимедов множитель или фактор плавучести, V -удельный парциальный объем, см3/г, р0 - плотность растворителя г/см3; Агд - гидродинамический инвариант, равный 2.71 • 106.

Результаты и их обсуждение

На рис. 1 представлена зависимость изменения характеристической вязкости раствора ХТЗ от времени контакта с ферментным препаратом.

[Л ] ,Дл/г 8,0,

3,0

_!_!_|_|_I_>

30 60 90 120 180

время выдержки с раствором ферментного препарата, мин

Рис. 1. Зависимость характеристической вязкости ХТЗ от времени контактирования его 1% раствора с раствором ферментного препарата концентрации 0.1 (7), 0.2 (2) и 0.3 (3) г/л.

Как видно, с увеличением времени выдержки раствора ХТЗ с ферментом, вязкость закономерно уменьшается, что свидетельствует об уменьшении молекулярной массы ХТЗ. Наиболее значительное падение вязкости происходит на начальном периоде. Дальнейшая ферментативная экспозиция раствора ХТЗ, сказывается на степени падения вязкости существенно в меньшей степени, т.е. скорость реакции уменьшается со временем. Такой ход кинетической кривой характерен для большинства ферментативных реакций [3]. Увеличение концентрации ферментного препарата приводит к закономерному увеличению скорости падения характеристической вязкости.

Как было установлено в ходе работ, для всех изучаемых растворов ХТЗ при небольших временах расщепления кривые уменьшения характеристической вязкости носят линейный характер. Именно на этом участке было определено значение начальной скорости ферментативного расщепления V0, служащей мерой ферментативной активности фермента по отношению к ХТЗ.

Для определения скорости ферментативного расщепления по формуле (1) необходимо было оп-

ределить значение констант в уравнении Марка-Куна-Хаувинка. Для используемого нами образца ХТЗ их значение было определено как а=1.02 и К=5.57 • 105.

Как показали проведенные исследования, наблюдаемые зависимости начальной скорости ферментативного расщепления от концентрации субстрата могут быть описаны в рамках схемы Михаэлиса-Мэнтен. На рис. 2 представлена зависимость начальной скорости от концентрации ХТЗ в растворе.

7 -1

1 2 3 4 5

q в растворе, г/дл

Рис. 2. Зависимость начальной скорости ферментативного расщепления ХТЗ (1) при концентрации ферментного препарата 0.1 (1), 0.2 (2) и 0.3 (3) г/л от концентрации ХТЗ в растворе.

Из данного рисунка видно, что она имеет классический вид и представляет собой часть равнобочной гиперболы. Представление в двойных обратных координатах (графический метод Лай-нуивера-Берка) позволяет точно определить значение константы Михаэлиса Кт (табл. 1). Как видно из представленных данных, ее значение является величиной постоянной, не зависящей от концентрации фермента и фактически характеризует сродство данного фермента к субстрату. Значение Утах = к2Сф, где к2 - константа распада фермен-тсубстратного комплекса, дает характеристику каталитической активности фермента, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта реакции при данной концентрации фермента при условии избытка субстрата. При проведении реакции в условиях избытка субстрата, максимальная скорость реакции линейным образом зависит от концентрации фермента (рис. 3).

Таблица 1

Значения констант в уравнении Михаэлиса-Мэнтен для раствора хитозана в 1% уксусной кислоте

Сф, г/л I Кт, г/дл I Vmax, 106

0.1 3.37 0.50

0.2 3.47 0.92

0.3 3.42 1.51

УшахЮ

ОД 0,2 0,3

С фермента, г/л

Рис. 3. Зависимость максимальной скорости реакции ферментативного расщепления ХТЗ от концентрации ферментного препарата в растворе.

Выводы

Таким образом, впервые были определены кинетические характеристики активности фермента гиалуронидазы для реакции ферментативного рас-

щепления ХТЗ в растворе 1% уксусной кислоты. Определенное значение константы Михаэлиса Кт » 3.4 г/дл существенно выше значения Кт=0.03 г/дл, определенной в работе [1] для карбоксиметилцел-люлозы под действием целлюлазной системы из ОвМгШыт сапй1йит. Данный факт, очевидно, обусловлен тем, что используемый в работе фермент неспецифичен по отношению к ХТЗ и тем, что условия проведения ферментативного расщепления не соответствовали температурному и рН оптимуму фермента гиалуронидазы.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и республики Башкортостан (грант р_поволжье_а № 11-03-97016)

ЛИТЕРАТУРА

1. Баранов В. Г., Бресткин Ю. В., Агранова С. А. Пинкевич В. Н. Поведение макромолекул полистирола в «загущенном» хорошем растворителе // Высокомолекулярные соединения. 1986. Т. 28Б. №10. С. 841-843.

2. Рабинович М. Л., Клесов А. А., Березин И. В. Кинетика действия целлюлитических ферментов из ОвоМИит candidum. Вискозиметрический анализ кинетики гидролиза карбоксиметилцеллюлозы. //Биоорганическая химия 1977. Т.3. №3. С. 405-414.

3. Биохимия/ под ред. Е. С. Северина. М.: Геотар-Мед. 2004. 779 с.

Поступила в редакцию 19.06.2013 г.