CC BY
64
УДК 541.64:536.7
М. С. Гурина, Р. Д. Каримова, В. В. Чернова, Е. И. Кулиш, Г. Е. Заиков
БИОДЕСТРУКЦИЯ ПЛЕНОК ХИТОЗАНА
Ключевые слова: хитозан, биодеструкция, пленки, ферментативный гидролиз.
Изучена кинетика биодеструкции пленочных образцов биополимера хитозана под действием неспецифичного ферментного препарата гиалуронидазы. Вычислены кинетические параметры процесса, а именно максимальная скорость и константа Михаэлиса ферментативной реакции . Установлено, что в том случае, когда биодеструкции подвергается монолитный пленочный образец, ферментативный гидролиз хитозана подчиняется тем же закономерностям, что и процесс ферментативного гидролиза хитозана в растворе при малых концентрациях субстрата.
Keywords: chitosan, biodestruction, film, enzymatichydrolis.
The kinetics of biodegradation film samples of biopolymer chitosan under the action of non-specific enzyme preparation hyaluronidasearestudied. Calculated kinetic parameters of the process, namely the maximum speed and constant Michaelis enzymatic reaction. Installed, that in the case when the preparation is exposed monolithic film sample, enzymatic hydrolysis of chitosan is subject to the same laws as the process of enzymatic hydrolysis of chitosan solution at small concentration of the substrate.
Введение
При контакте природных полимеров с ферментативными средами происходит процесс их ферментативного разложения (биодеструкции) [1]. Например, биодеструкция хитозана, полимера, имеющего огромные перспективы для создания материалов медицинского назначения, протекает как процесс гидролиза макроцепей по р-гликозидным связям. Очевидно, что самыми подходящими из ферментов для осуществления процесса ферментативного гидролиза хитозана являются специфические для хитозанаферметны-хитиназы и хитозаназы, которые приводят к получению олигосахаридов со степенью полимеризации 2-5 [2]. Однако, в условиях медицинского применения хитозановых материалов их биоразрушение может происходить только под действием неспецифических ферментов[3,4], поскольку в человеческом организме отсутсвуют и хитиназы, и хитозаназы.
Изучение кинетических закономерностей процесса биодеструкции в конечном счете приводит к прогнозированию времени жизни полимера в соответствующих условиях функционирования [1]. И если закономерности процесса биодеструкциив растворе, в том числе и для хитозана, достаточно хорошо изучены [4-7], вопрос об особенностях ферментативного разрушения монолитных (пленочных) образцов, остается практически открытым, что и определило цель данной работы.
Экспериментальная часть
Для исследования использовали образец хитозана производства ЗАО «Биопрогресс» (Щелково, Россия) с молекулярной массой М8Л=113000. В качестве ферментного препарата использовали гиалуронидазу («Лираза») производства ЗАО «Микроген» (Москва, Россия). Концентрация ферментного препарата во всех экспериментах составляла 0,3 г/л. В качестве растворителя использована 1% уксусная кислота. Концентрация хитозана в растворе при проведении
процесса ферментативного гидролиза (Суа) варьировалась от 0,1 до 5 г/дл. Характеристическую вязкость хитозана^] в растворе уксусной кислоты определяли методом Иржака и Баранова [8] по тангенсу угла наклона на начальном участке кривой зависимости логарифма относительной вязкости 1п^ге1 от концентрации хитозанав растворе С, позволяющим исключить влияние эффекта полиэлектролитного набухания при определении вязкости [9].
Для определения значений исходной характеристической вязкости хитозана
использовали раствор с концентрацией С = 0,15 г/дл. Для используемого в работе образца хитозана в 1% уксусной кислоте значение исходной характеристической вязкости образца, не подвергнутого биодеструкции, составляло [^]0 = 7,8 дл/г. В экспериментах по определению значений характеристической вязкости хитозана в ходе ферментативного гидролиза раствор хитозана в уксусной кислоте, к которому был добавлен раствор ферментного препарата, выдерживали в течение определенного времени при температуре 36°С, после чего процесс биодеструкции останавливали кипячением исходного раствора в течение 30 минут на водяной бане. Далее, из раствора исходной концентрации Сьуа готовили разведением раствор для определения характеристической вязкости с концентрацией С= 0,15 г/дл.
Для всех использованных концентраций хитозана при небольших временах деструкции (3040 минут) зависимости уменьшения характеристической вязкости от времени имели линейный характер. Именно на этом участке определяли значение начальной скорости ферментативного гидролизаУ0, которое
рассчитывали по формуле [10]:
где СЬу<1 -концентрация хитозана, подвергающегося процессу ферментативного гидролиза в растворе (г/дл); 1 - время гидролиза, мин.; К и а - константы в уравнении Марка-Куна-Хаувинка.
Для определения констант К и а, необходимых для вычисления значений начальной скорости ферментативного гидролиза по уравнению (1) в 1% уксусной кислоте, образец исходного хитозана был расфракционирован на 10 фракций в диапазоне значений молекулярных масс от 20000 до 150000 Да. Абсолютное значение молекулярных масс фракций хитозана было определено сочетанием методов скоростной седиментации и вискозиметрии. Значение констант в уравнении Марка-Куна-Хаувинка в нашем случае составило а = 1,02 и К = 5,57*10-5.
Пленки хитозана получали методом полива 2% раствора хитозана на поверхность стекла в чашке Петри. Для изучения процесса биодеструкции пленок, из пленки по шаблонам вырезали образец с линейными размерами а и Ь. Толщину пленок поддерживали постоянной, равной 100 мкм. Точный объем пленочного образца рассчитывали исходя из значений массы и плотности пленки. Плотность пленочного образца хитозана, полученного из 1% уксусной кислоты, определяли пикнометрическим методом, которая для изучаемого нами образца хитозана составила р=1,37 + 0.03 г/см3.
Для проведения эксперимента,
моделирующего процесс биодеструкции хитозанана раневой поверхности, пленочный образец хитозана помещали на подложку, смоченную раствором ферментного препарата в 1% уксусной кислоте, и выдерживали в течение определенного времени при постоянной температуре (360С). Объем раствора ферментного препарата (0,05 мл) выбирали исходя из условия, чтобы только одна из поверхностей пленки соприкасалась с раствором фермента. После выдержки, процесс ферментативного гидролиза останавливали дезактивацией фермента кипячением в течение 30 минут на водяной бане. Далее пленку растворяли в 1% уксусной кислоте и определяли текущее значение характеристической вязкости полимера
Обсуждение результатов
Задача определения скорости процесса в случае хитозана сводится к определению изменений во времени значений характеристической вязкости полимера, происходящих вследствие разрыва макроцепей при взаимодействии хитозана с ферментным препаратом. Как видно из данных рисунка 1, и в случае пленки, и в случае растворов хитозана, увеличение времени контакта хитозана с ферментом сопровождается уменьшением характеристической вязкости, что свидетельствует об уменьшении его молекулярной массы. При этом в обоих случаях зависимости линейны на начальном этапе реакции.
В случае раствора наблюдаемые зависимости начальной скорости ферментативного гидролиза, рассчитанные по уравнению (1), от
концентрации хитозана в растворе (рис. 2) хорошо описываются в рамках схемы Михаэлиса-Мэнтен.
Рис. 1 - Зависимость характеристической вязкости хитозана, выделенного из пленочного образца (1) и из раствора (2,3) с концентрацией хитозана в растворе 0,5 (2) и 1,0 (3) г/дл от времени экспозиции с раствором ферментного препарата
Значение константы Михаэлиса, определенное графическим методом Лайнуивера-Берка[11], составило 3,42 г/дл, значение максимальной скорости ферментативного гидролизаУтах, определяющей максимальную возможность образования продукта реакции при данной концентрации фермента в условиях избытка субстрата, составило 1,50* 10-6 мин-1. Значение параметраУтах/Кт, имеющего физический смысл константы скорости процесса биодеструкции, составилоУтах/Кт=0,44*10-6 (дл/г)*мин-1. Именно прямой с наклоном Утах/Кт. Апроксимируется зависимость скорости ферментативного гидролиза У0 от концентрации субстрата на начальном этапе.
Г в растворе, г/дл '"ХГЗ
Рис. 2 - Зависимость начальной скорости ферментативного гидролиза хитозана от его концентрации в растворе
В самом первом приближении задачу описания кинетики деструкции пленки можно представить как определение скорости деструкции в растворе с концентрацией хитозана (г/дл), соответствующей концентрации поверхностных звеньев в объеме раствора фермента, т.е.:
■с S--^,
ТшЛ
(2)
где щ - масса мономерных звеньев хитозанана поверхности пленки, г; У5о1 - объем раствора ферментного препарата, с которым контактирует пленка, дл.
Для оценки массы мономерных звеньев хитозанана поверхности пленки использованы следующие рассуждения. Зная массу пленочного образца, можно рассчитать число мономерных хитозановых звеньев пт11, приходящихся на весь объем пленки:
:.. =.-.■.. (3)
где Мт11 - молекулярная масса звена хитозана; N3 -число Авогадро.
Допустим, что мономерное звено хитозанавписано в куб с гранью ё. Объем, занимаемый мономерным звеном в объеме пленки, равен уип11= У^ пип11, где У(— объем пленочного образца. Отсюда, размер грани ё = (уип11)1/3. Теперь можно оценить, сколько мономерных звеньев пип11, каждое из которых занимает площадь 51^= ё2 , размещается на поверхности пленки с площадью контактирующей с раствором ферментного препарата
IlimiV
=Jl
(4)
Определив п^, можно найти искомою величину с1.
Таким образом, варьируя размер пленочного образца, можно получить ряд пленок с различной концентрацией с1 звеньев хитозана и определить для них значение скорости процесса биодеструкции по уравнению (1) (рис.3).
Рис. 3 - Зависимость начальной скорости ферментативного гидролиза хитозана от поверхностной концентрации звеньев хитозана в пленочных образцов
Обращает на себя внимание тот факт, что значение тангенса угла наклона на зависимости скорости ферментативного гидролиза хитозана в растворе V0 от концентрации субстрата на начальном этапе (рис.1) и зависимости скорости ферментативного гидролиза хитозана в пленках от поверхностной концентрации хитозана, совпадают и составляют Vmax/Km= 0,44* 10-6 (дл/г)хмин-1.
Таким образом, можно считать доказанным, что, несмотря на то, что процесс биодеструкции подвергается монолитный пленочный образец, деструкция пленки подчиняется тем же закономерностям, что и ферментативный гидролиз в растворе при малых концентрациях субстрата.
Выводы
1. Впервые определены кинетические параметры процесса ферментативного гидролиза хитозана под действием гиалуронидазы, а именно значение константы МихаэлисаКт=3,42 г/дл и значение максимальной скорости ферментативного гидролиза Vmax =1,50*10-6 мин-1;
2. Показано, что ферментативный гидролиз пленочных образцов, полученных из раствора, подчиняется тем же кинетическим закономерностям, что и биодеструкция хитозана в растворе при малых концентрациях субстрата.
Литература
1. К.З. Гумаргалиева., Г.Е.Заиков, Ю.В. Моисеев, Успехи химии, 63,10, 905-920(1994);
2. Новиков В.Ю., Мухин В.А. // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 5. С.530-535;.
3. R.A.A Muzzarelli, V. Stanic, V. Ramos, Methods in bio-technology,10: carbohydrate biotechnology protocols, 1999, С. 197-211
4. R.A.A Muzzarelli, Peter M.G. Grottammare, Chitin handbook AldaTechnografica, 1997. C. 528.
5. И.Р. Муллагалиев, Г.Э. Актуганов, А.И. Мелетьев, Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Материалы Восьмой Международной конференции. ВНИРО, Москва, 2006, С. 305-308.
6. М.Д. Мукатов, АлааЭльдин Мухаммед Юнес,Рыбное хозяйство, Вестник Астраханского государственного технического университета, Астрахань, 141-144.2009
7. Е.И.Черкасова, М.Ф.Алексеева, М.О.Пастухов, В.Г.Фролов, Л.А.Смирнова, В.Ф Смирнов., И.Ф. Алексеева// Биотехнология. 2005. № 2. С. 73-81
8. В.Г.Баранов, Ю.В. Бресткин, С.А. Агранова В.Н. Пин-кевич, Высокомолекулярные соединения. 28Б, 10, 841-843(1986)
9. Е.И.Кулиш, И.Ф.Туктарова, В.В. Чернова, Вестник Казанского технологического университета, 4, 140-143.(2013)
10. Рабинович М.Л., Клесов А.А., Березин И.В. // Биоорганическая химия 1977, т.3, №3, С.405-414.
11. Биохимия/ под ред. Е.С. Северина. М.: Геотар-Мед. 2004. - 779 с.
© М. С. Гурина - магистрант каф. высокомолекулярных соединений Башкирского госуд. ун-та; Р. Д. Каримова - магистрант той же кафедры, [email protected]; В. В. Чернова - к.х.н., доцент той же кафедры; Е. И. Кулиш - д-р хим. наук, проф. той же кафедры; Г. Е. Заиков - д-р хим. наук, проф. каф. технологии пластических масс КНИТУ.
© M. S. Gurina - Bashkir state university; R. D. Karimova - Bashkir state university, [email protected]; V. V. Chernova -associate professor, Bashkir state university; E. I. Kulish - PhD, Bashkir state university; G. E. Zaikov - Prof., Kazan National Research Technological University.
