Деструкция хитозановых пленок под действием неспецифических ферментов Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

ISSN 1998-4812__________Вестник Башкирского университета. 2008. Т. 13. №2

259

УДК 541.64:536

ДЕСТРУКЦИЯ ХИТОЗАНОВЫХ ПЛЕНОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

© Е. И. Кулиш 1а, В. В. Чернова \ В. П. Володина 2,

Л. Б. Абдуллина 1, С. В. Колесов 1

1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г.Уфа, Ул. Фрунзе, 32.

Тел.: + 7 (347) 273 66 08.

E-mail: [email protected] 2Институт органической химии Уфимского научного центра РАН Россия, 450054 г.Уфа, пр. Октября, 71.

Тел.: + 7 (347) 233 35 60.

Рассмотрены особенности протекания ферментативной деструкции образцов хитоза-на, полученных в виде пленок из растворов в уксусной кислоте, под действием неспецифических ферментов — коллагеназы и лиразы. Обнаружено, что варьирование концентрации кислоты в исходном растворе в существенной мере сказывается на структуре хитозана в сформированной пленке и, как следствие, степени деструкции пленочных образцов.

Ключевые слова: хитозан, полимерные пленки, ферменты, деструкция.

Одним из многочисленных достоинств хитозана (ХТ) является его биоразрушаемость до обычных для организма веществ [1]. В условиях медицинского применения хитозановых материалов их биодеградация осуществляется под действием неспецифических ферментов (например, ферментов, выделяемых раневой поверхностью: лиразы, коллагеназы и др.). В связи с этим рассмотрение факта возможного деструктирующего влияния на ХТ неспецифического фермента представляется важной задачей, как с научной, так и с практической точки зрения.

В качестве объекта исследования использовали образец ХТ производства фирмы Химмед, Россия (ТУ 6-09-05-296-76), полученный щелочным деацетилиро-ванием крабового хитина, со степенью деацетилирова-ния ~75% и с Мп = 120000 ([^]о = 3.0). В качестве ферментов использовались ферментные препараты «Коллагеназа КК» и «Лираза», (ГУП «Иммунопрепарат», Уфа), взятые в количестве 4% масс. по отношению к массе полимера. Пленки ХТ из растворов в уксусной кислоте различной концентрации получали методом полива на стеклянную подложку. Массовая концентрация полимеров в исходном растворе составляла 2 г/дл. Концентрация уксусной кислоты варьировалась от 1 до 50% масс. Толщина пленок во всех экспериментах поддерживалась постоянной и равной 0.1 мм. Для моделирования процесса деструкции пленочного образца ХТ на раневой поверхности пленку помещали на подложку, смоченную раствором фермента, и выдерживали при температуре 35 °С в течение определенного времени. Кинетику деструкции определяли по данным вискозиметрии в буферном растворе, состоящем из 0.3 М уксусной кислоты и 0.2 М ацетата натрия.

Принципиальная возможность протекания процесса ферментативного разложения ХТ под действием коллагеназы была нами обнаружена ранее [2]. Использованная в работе методика вискозиметриче-ской оценки степени изменения молекулярной массы позволяет установить факт протекания деструкции

по уменьшению вязкости растворов ХТ под действием ферментного препарата в зависимости от времени выдержки пленочного образца. Полученные данные однозначно свидетельствуют в пользу того, что в пленках ХТ под действием коллагеназы и лиразы проходит ферментативная деструкция, несмотря на то, что данные ферменты являются неспецифичными по отношению к ХТ. Обращает на себя внимание тот факт, что при ферментолизе хитозановой пленки изменение характеристической вязкости со временем носит неравномерный характер: основное падение вязкости (в среднем на 30-40% от исходного значения) происходит за первые 30 минут, а далее изменения характеристической вязкости раствора, полученного из пленочных образцов, крайне незначительны (рис. 1). Кроме того, значение характеристической вязкости ХТ, определенное путем растворения пленочного образца, прошедшего стадию формования из раствора в уксусной кислоте и не подвергнутого ферментативной деструкции ([^] = 2.5), не совпадает со значением характеристической вязкости исходного ХТ ([л]0 = 3.0). Данный факт был объяснен как результат структурных перестроек, которые происходят в растворе и сохраняются в пленке [2].

Рис. 1. Зависимость характеристической вязкости растворов хитозана, полученных из пленочных образцов, сформированных из 1%-ной уксусной кислоты, от времени контакта с коллагеназой (1) и лиразой (2).

* автор, ответственный за переписку

260

раздел ХИМИЯ и ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ

Известно [3, 4], что концентрация уксусной кислоты в растворе существенным образом сказывается на степени протонирования аминогрупп ХТ а и, соответственно, вязкости растворов ХТ. Эквимольное соотношение «уксусная кислота : ХТ» обеспечивает достижение величин а < 0.5-0.7. Соответственно, растворы ХТ в разбавленной уксусной кислоте (1-2% масс.) характеризуются невысокой вязкостью и компактной формой макромолекул. Лишь при 7-10-кратном мольном избытке уксусной кислоты (10%-ная уксусная кислота) по отношению к ХТ степень протонирования аминогрупп становится равной единице. Соответственно, повышение концентрации уксусной кислоты от 1 до 10%, вероятно, сопровождается разворачиванием макромолекулярных кубков и увеличением значения характеристической вязкости раствора. При увеличении концентрации кислоты (выше 10%) наблюдается снижение характеристической вязкости, которое, по-видимому, связано с повышением ионной силы раствора, экранированием аминогрупп полимера и компактцией его макромолекул. Таким образом, различие в структуре исходных растворов сохраняется и в структуре пленок, сформированных из растворов. Зависимость характеристической вязкости растворов, полученных из пленочных образцов, от концентрации кислоты, из которой была сформирована пленка, носит сложный, экстремальный характер (рис. 2).

В связи с этим существует принципиальная возможность, варьируя структуру полученного из раствора пленочного материала, регулировать доступность звеньев ХТ для взаимодействия с ферментом в процессе деструкции, и, следовательно, регулировать скорость процесса ферментативной деструкции ХТ.

По данным вискозиметрических измерений (табл.) можно оценить не только относительное уменьшение характеристической вязкости, но и молекулярной массы ХТ, пользуясь уравнением Марка-Куна для растворов ХТ в используемом ацетатном буфере ([^] = 1.38-10-4 М 085).

[Л] *

-----1—...".. 1 ......................►

20 40 С, г/дл

Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости растворов хитозана, полученных из недеструктированных пленочных образцов, от концентрации уксусной кислоты в исходном растворе.

Таблица

Влияние концентрации уксусной кислоты в исходном растворе на степень ферментативной деструкции пленочных образцов хитозана (время выдержки в растворе с ферментом - 1 час)

Концентрация уксусной кислоты, г/дл А[,], дл/г ДМ^10 -3

Коллагеназа

1 1.03 36

5 1.28 47

10 1.33 49

15 1.15 41

20 1.08 38

50 1.12 40

Лираза

1 0.70 17

5 0.88 30

10 0.94 32

15 0.90 31

20 0.74 24

50 0.80 26

Как видно из табл., несмотря на некоторую количественную разницу, закономерности протекания ферментативной деструкции при использовании коллагеназы и лиразы одни и те же: в большей степени деструкции подвергаются пленки, полученные из 10%-ной уксусной кислоты, в меньшей -из 1%-ной кислоты. По всей вероятности, надмолекулярная структура пленочных образцов разная. Пленки, сформированные из 1%-ной уксусной кислоты, характеризуются более плотной упаковкой, и доступность звеньев ХТ для взаимодействия с ферментом в них небольшая. Пленки, сформированные из растворов в 10%-ной уксусной кислоте, напротив, характеризуются пониженной плотностью упаковки, что приводит к большей доступности ХТ для взаимодействия с ферментом, и, как следствие, более интенсивной деструкции.

Таким образом, процесс ферментативной деструкции пленочных образцов ХТ оказывается чувствительным к надмолекулярной структуре полимера, которая, в свою очередь, определяется структурой полимера в исходном растворе, из которого готовятся пленки. Это позволяет формировать хитозановые покрытия с регулируемой биораз-рушаемостью.

ЛИТЕРАТУРА

1. Muzzarelly R. Chitin. London: Pergamon Press, 1977. - 309 p.

2. Кулиш Е. И., Володина В. П., Колесов С. В., Заиков Г. Е. // Вы-сокомолек.соед. Б. 2006. Т.48. №9. С.1721.

3. Вихорева Г. А., Роговина С. З., Пчелко О. М., Гальфайх Л. С. // Высо-комолек. соед Б. 2001. Т.43. №6. С.1079.

4. Агеев Е. П., Вихорева Г. А., Матушкина Н. Н., Пчелко О. М., Гальбрайх Л. С. // Высокомолек. соед. А. 2000. Т.42. №2. С.333.

Поступила в редакцию 2I.02.2007 г.